大鼠GAD65重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建大鼠GAD65重组腺病毒载体。方法将目的基因大鼠GAD65 cDNA亚克隆到穿梭质粒pShutile启动子CMV的下游,再通过I-CeuⅠ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点,将目的基因GAD65与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得含目的基因GAD65重组腺病毒质粒DNA,后者经限制性内切酶PaeⅠ切割后,两端露出反向末端重复序列(rTR),利用脂质体转染293细胞,获得含目的基因重组腺病毒上清。PCR双引物检测含有目的基因GAD65的片段。结果在挑选的5个空斑中,有4个含GAD65 cDNA阳性重组腺病毒。GAD65重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效的复制。PCR双引物检测证明含有目的基因GAD65片段,表明利用体外连接法成功构建了含目的基因GAD65重组腺病毒转移载体。结论成功构建了GAD65重组腺病毒,为进一步研究GAD65重组腺病毒的功能提供了条件。     

快速构建腺病毒载体的新方法

近年来,随着腺病毒载体广泛应用于实验性基因治疗等生物学研究领域,构建重组腺病毒的方法也有了很大改进,本文主要介绍两种快速构建人腺病毒载体的新方法：1．用DNA-末端蛋白质复合物构建重组腺病毒。2在大肠杆菌细胞内而非真核细胞内完成通过同源重组产生重组腺病毒核酸的过程。     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。     

腺病毒载体在皮肤科基因治疗中的应用

腺病毒载体是经去除腺病毒基因组的某些区而获得的，由于其诸多优点，正在成为皮肤科基因治疗中使用最多的载体之一，本文就腺病毒载体的特点及其在皮肤科基因治疗中的应用进展，作一综述。     

前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建

为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础,拟构建bimS的重组腺病毒载体。采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS;克隆至T载体测序正确。亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,形成含目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的穿梭载体。穿梭载体pAdtrack-CMV-bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组,获得重组pAdEasy-CMV-bimS,线性化后脂质体法转染人胚肾(HEK)293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察;将病毒以MOI=100感染HEK293细胞,western blot检测bimS蛋白表达。结果显示病毒感染293细胞48~72h观察到GFP表达,7d出现典型细胞病变症状(CPE);提取培养上清中病毒DNA,以PCR法可检测到bimS的扩增产物;western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白,与未感染的阴性对照细胞相比,bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞。表明重组bimS腺病毒构建成功;为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础。     

携带野生型PTEN基因的腺病毒载体的构建

目的 构建携带野生型PFEN(Phosphatase and tensinhomolog deleted on chromosome ten)基因的腺病毒载体,为研究PFEN功能和作用机制提供手段。方法将野生型PFEN基因克隆入含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因的pAdTrack-CMV质粒,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染AD293细胞,并在AD293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒;通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过GFP表达来监控腺病毒扩增;Western blot检测靶细胞内PFEN蛋白的表达。结果感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染心肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高。结论成功构建了携带PFEN基因的腺病毒载体。     

腺病毒载体研究进展

腺病毒载体目前广泛地应用于基因治疗 ,随着对腺病毒分子结构与功能及感染机制的深入了解 ,人们在降低其免疫原性 ,增强基因导入特异性 ,增强感染和表达效率等方面进行了许多探索 ,本文就这方面的研究进展进行综述     

中枢神经系统对腺病毒载体的免疫应答

腺病毒载体（adenoviral vector，AdV）在介导体内基因转染方面所表现出的多方面的优势，使得这一载体系统正在成为神经再生、神经示踪研究以及神经肌肉疾病基因治疗的实验研究中最具魅力的载体之一。虽然神经系统被认为是免疫豁免（immunological privilege）器官，然而AdV转染神经系统后所激发的对该载体的免疫应答常导致其携带的目的基因不能在体内长时间高水平表达，甚至引起转染细胞的破坏，致使这一载体系统的应用在很大程度上受到限制。为探索AdV在神经系统高效和安全给予方法以及使转染基因获得治疗水平的长期表达，很有必要详细分析研究神经系统对AdV的免疫应答机制以及探索新的免疫调控策略。     

腺病毒载体,腺病毒相关病毒载体与基因治疗

近年来，腺病毒载体（ＡＶ），腺病毒相关病毒载体（ＡＡＶ）已经成为继反转录病毒载体（ＲＶ）以来最重要的病毒载体。与反转录病毒载体相比较，ＡＶ有其独特的优点，构建带有目的基因的腺病毒载体通过２９３辅助细胞产生重组腺病毒颗粒，用于活体基因转移及靶细胞感染。目前已利用ＡＶ研究了ｎｅｏ，ｌａｃＺ，ＨＢｓＡｇ及ＣＦＴＲ等基因在不用组织中的表达，其中人们已利用ＣＦＴＲ基因通过ＡＶ介导对囊性纤维化进行基因治疗临床     

大鼠microRNA-327重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的转染效率

目的:构建含微小RNA-327(miRNA-327)基因的腺病毒载体,并观察其在H9C2心肌细胞中的转染效率。方法:利用聚合酶链反应(PCR)法钓取目的基因miRNA-327,并将目的基因与穿梭载体GV202连接形成miRNA-327腺病毒表达载体。经酶切及测序鉴定后,将构建的miRNA-327腺病毒表达载体与包装质粒共转染到人胚肾293细胞,再通过Cre/loxP重组酶系统以获得重组腺病毒,并对其进行扩增、纯化及滴度测定。最后将构建成功的重组腺病毒载体转染H9C2心肌细胞48 h,并通过荧光显微镜以及流式细胞仪测定其转染效率。结果:双酶切与测序结果证明了大鼠miRNA-327腺病毒载体构建成功,且最终获得滴度为2×10~(10)PFU/ml的病毒液。转染心肌细胞48h后倒置荧光显微镜观察结果显示,腺病毒转染效率为90.15%±5.15%,流式细胞仪检测结果显示其转染效率为85.46%±3.08%。结论:成功构建了含miRNA-327基因的重组腺病毒载体,其在H9C2心肌细胞中具有较高的转染效率。     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建及制备

目的 构建小鼠T-bet基因重组腺病毒.方法 采用RT-PCR方法从小鼠脾脏活化的T淋巴细胞中扩增的cDNA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒,酶切线性化后,与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-l以电穿孔的方法共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经酶切鉴定筛选正确重组子,以线性化重组质粒转染293细胞,制备重组腺病毒小鼠T-bet重组腺病毒AdT-bet,最后以PCR及Western blot方法鉴定T-bet的表达.结果 感受态大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组24 h后共获得35%阳性重组质粒克隆,经酶切获得一个30 kb的大片段和一个4.5 kb的小片断.该质粒转染293细胞后获得的重组腺病毒可高效表达T-bet,纯化后病毒滴度为2.0×1011 PFU/mL.结论 应用细菌内同源重组法成功快捷构建了含小鼠T-bet基因的重组腺病毒,所获得的AdT-bet可进一步应用支气管哮喘等疾病的基因治疗研究.     

人腺病毒载体的研究进展

目前腺病毒载体已成为基因治疗和重组疫苗研究的热点，随着分子生物学技术及基因治疗理论的进一步发展，腺病毒载体将发挥越来越重要的作用。本文综述了腺病毒载体构建及其应用的研究进展。     

携带反义多药耐药基因的重组腺病毒载体的构建

从携带有全长人类 MDR1c DNA的质粒 p Ha MDR1- 1获得 MDR1基因片段 ,将其反向克隆到腺病毒载体 Ad Easy系统的穿梭质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装生成携带反义 MDR1基因片段的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- as MDR1,可以有效地感染人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究逆转肝癌多药耐药性的机制提供了基础     

腺病毒伴随病毒载体的研究进展

腺病毒伴随病毒载体的研究进展姚二梅冯泽华侯云德随着对人类基因愈加深入的了解，以及对真核基因改造和转移技术的发展，人类基因治疗已成为现实。基因治疗的关键问题就是要寻找有效的基因转移系统。在病毒介导和非病毒介导的两类基因转移系统中，感染性的重组病毒载体是...     

抑癌基因PTEN shRNA腺病毒载体的构建

目的:构建抑癌基因PTEN shRNA腺病毒载体, 探讨PTEN在哮喘患者气道重塑的作用机制.方法:设计形成短发夹序列 (shRNA) 的PTEN-shRNA引物对应的模板DNA序列, 亚克隆至 p Shuttle-GFP-U6重组穿梭载体, 构建穿梭质粒 p Shuttle-GFP-U6-PTEN-shRNA.鉴定正确后, 然后与腺病毒质粒 p Adxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组, 得到 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA病毒质粒, 将 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA质粒经 Pac I线性化后转染HEK293细胞, 包装重组、并大量扩增 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA腺病毒质粒, 氯化铯梯度离心纯化, 测病毒滴度, Western blot检测PTEN蛋白水平的表达.结果:结果证实 p Shuttle-GFP-U6-PTEN-shRNA及 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA质粒构建正确, 收获病毒后的PCR 及Western blot检测结果均证明 p Adxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA包被成功.结论:抑癌基因PTEN shRNA腺病毒载体成功构建, 为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了相关的实验基础.     

携带eGFP及人endostatin-K5的嵌合腺病毒载体Ad5/11的构建及其体外实验研究

目的:构建携带报告基因eGFP及人内皮他丁en-dostatin-K5的嵌合型腺病毒载体ADS/11.方法:采用重叠PCR及在细菌E coil.BJ5183中同源重组的方法,获得表达eGFP报告基因的嵌合腺病毒骨架载体,然后以经Pac Ⅰ线性化的嵌合腺病毒载体骨架与Pac Ⅰ线性化的表达endostatin-K5的腺病毒E1穿梭载体共转染真核细胞HEK 293细胞中获得携带报告基因eGFP及人endostatin.K5的嵌合型腺病毒载体Ad5/11-E1-CMV-endo-K5/E3-CMV-eGFP.以获得的嵌合型腺病毒载体感染U87MG细胞,在荧光显微镜观察eGFP的表达,采用RT-PCR检测endostatin-K5的表达;将所构建的嵌合病毒载体ADS/11-E1-CMV-endo-KS/E3-CMV-eGFP与未经修饰的腺病毒载体Ad5-E1-CMV-eGFP在体外感染人胶质瘤细胞系A172及乳腺癌细胞系MDA-MB-231;通过荧光蛋白eG-FP的表达,比较它们对以上肿瘤细胞的感染效率.结果:嵌合病毒载体Ad5/11-E1-CMV-endo-K5/E3-CMV-eGFP可成功地表达eGFP及endostafin-K5.以经过修饰的嵌合型腺病毒载体AdS/11-E1-CMV-endo-KS/E3-CMV-eGFP感染人脑胶质瘤细胞系A172及人乳腺癌细胞MDA-MB-231的感染效率,明显高于对照未经修饰的腺病毒载体Ad5-E1-CMV-eGFP.结论:携带eGFP及人endostatin-K5的嵌合型腺病毒载体ADS/11,可明显提高对人脑胶质瘤细胞系A172及人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的感染效率.     

鼠内皮抑素基因腺病毒载体的构建及对血管内皮细胞的生长抑制

构建含鼠内皮抑素基因的腺病毒载体（pAd／mEnd），并观察内皮抑素蛋白对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的生长抑制、细胞周期和凋亡的影响。结果发现pAd／mEnd感染BEL7402细胞后，能有效表达内皮抑素蛋白，显著抑制HUVEC增殖，阻滞HUVEC细胞S期，凋亡指数显著增加。     

大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因（GLUT1）的复制缺陷型重组腺病毒载体，为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-Glut1，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-Glut1，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印迹法（Western blotting）从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果:经PCR分析及DNA测序显示GLUT1 cDNA序列正确；筛选出重组腺病毒质粒pAd-Glut1后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及Western blotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论:成功扩增了大鼠GLUT1基因并构建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。     

AdMax系统构建腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal样间质细胞及其表达

目的 构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的转染及其介导SCL基因的表达.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率,RT-PCR法分析转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA的表达.结果 PCR结果和Western blot法检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/ml,对膀胱Cajal样间质细胞的转染率高达98%,RT-PCR法检测转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA有表达.结论 成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很强的转染能力,可介导SCL基因在Cajal样间质细胞的表达.     

TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :构建含人硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因的重组腺病毒载体 ,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性。方法 :从重组质粒pGEM TR上用内切酶切下编码 5 0 0个氨基酸的全长TRcDNA片段 ,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle TR。将带有CMV启动子的目的片段 ,插入E1、E3缺失的Adeno X病毒DNA中 ,以Adeno TRDNA通过脂质体转染HEK2 93细胞 ,获得重组腺病毒Adeno TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定。用重组腺病毒感染CV1细胞 ,通过免疫荧光染色与Westernblot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达。结果 :重组腺病毒Adeno TR的病毒滴度为 4 .4× 10 11pfu/L。PCR、荧光显微镜证实 ,以及Westernbolt分析 ,在相对分子质量 (Mr)约 5 5 0 0 0处均出现特异性条带。结论 :成功地构建了重组腺病毒载体 ,并能介导外源基因TR表达 ,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础。