RNA干扰抑制环氧化酶-2表达对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的 建立以小分子干扰RNA(siRNA)抑制环氧化酶-2(COX-2)表达的宫颈癌HeLa细胞模型,探讨COX-2在肿瘤细胞增殖、凋亡方面的作用和可能机制.方法 构建靶向抑制COX-2的siRNA表达载体,转染HeLa细胞,Western blot法确定筛选的稳定表达siRNA的转化克隆COX-2表达受抑制;流式细胞仪检测RNA干扰(RNAi)抑制COX-2表达后细胞凋亡和细胞周期的变化;克隆形成试验检测细胞克隆形成率;RT-PCR及Western blot法检测ku70、ku80的表达变化.结果 获得稳定表达siRNA的转化细胞株(HeLa/COX-2i),其COX-2蛋白表达明显受抑制,而转入阴性对照质粒的细胞株(HeLa/Negi)COX-2蛋白表达不受影响;HeLa/COX-2i细胞的克隆形成率[(45±4)%]显著低于HeLa细胞[(85±7)%](P<0.01);HeLa,HeLa/Negi,HeLa/COX-2i 3株细胞的细胞周期分布以及细胞凋亡率差异无显著性意义;RT-PCR及Western blot显示RNAi抑制COX-2表达后ku70、ku80在转录和翻译水平均受抑制.结论 RNAi抑制COX-2表达后可抑制HeLa细胞增殖,其机制可能与ku70、ku80的表达下调有关.     

RNAi沉默HSP70基因对宫颈癌HeLa细胞的影响

目的:本研究初步探讨RNAi技术应用于宫颈癌基因治疗的特异性及其作用机理。方法:设计靶向HSP70基因siRNA序列,构建重组表达载体pTZU6+1-siRNA-HSP70,在脂质体介导下瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,在体外诱导RNAi沉默HSP70基因,同时设转染空载体pTZU6+1为阴性对照组和不加任何试剂的空白对照组。采用RT-PCR和Western blotting方法检测实验组和对照组中HSP70表达;MTT法检测细胞生长与增殖;流式细胞术检测细胞的凋亡率和细胞周期分布。结果:与对照组相比,实验组转染HeLa细胞后,细胞的HSP70 mRNA和蛋白表达均明显下调(P<0.01);细胞生长抑制率增高(P<0.05);细胞周期相分布发生变化。结论:siRNA明显抑制HSP70的表达及宫颈癌HeLa细胞的增殖,并引起细胞凋亡和细胞周期改变,为进一步研究HSP70基因在宫颈癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。     

Rab26诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡并抑制其迁移

目的 研究调控Rab26蛋白表达对宫颈癌HeLa细胞凋亡及迁移的影响.方法 常规培养HeLa细胞,分别将含有Rab26 cDNA全长的真核表达载体(过表达组)、含有Rab26 siRNA序列的真核表达载体(siRNA组)瞬时转染HeLa细胞,同时设立正常细胞组及空载体转染组作为对照.转染48 h后,分别用RT-PCR和Westem blot检测各组细胞中Rab26的mRNA及蛋白表达水平;采用流式细胞仪(FCM)检测各组细胞的凋亡率;同时采用划痕实验检测各组细胞迁移速度.结果 与正常细胞组及空载体转染组相比,过表达组HeLa细胞中Rab26 mRNA及蛋白表达水平显著上调(P＜0.05),而siRNA组细胞中Rab26 mRNA及蛋白表达水平显著下调(P＜0.05),过表达组HeLa细胞凋亡率增高并抑制细胞迁移速度(P＜0.01),siRNA组则促进细胞迁移(P＜0.05).结论 Rab26与HeLa细胞的凋亡及细胞迁移有关,故调控Rab26的表达有望成为治疗宫颈癌的新靶点.     

ATF4在顺铂致肝癌细胞HepG2凋亡中的作用

目的 探讨ATF4在顺铂诱导的肝癌细胞HepG2凋亡中的变化,并对其作用进行初步研究.方法 人肝癌细胞HepG2经不同浓度顺铂处理24和48 h后,MTS法检测细胞活力;Western blot 检测内质网应激反应及凋亡相关蛋白(Bip、 ATF4、PARP、activated-Caspase3、CHOP)表达的变化;使用siRNA干扰技术沉默ATF4 的表达,并观察沉默ATF4蛋白表达后,肝癌细胞对顺铂敏感性的变化;利用Annexin V-FITC 和PI双标法,在倒置荧光显微镜中检测细胞凋亡情况.平板克隆形成实验用于判断单个细胞克隆生长速度.结果 与溶剂对照组相比,顺铂明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡;时间和浓度依赖性地引起内质网应激反应相关蛋白CHOP、ATF4表达水平上调,但不影响Bip的蛋白表达;同时导致activated-Caspase3的活化,引起PARP蛋白的切割. 使用siRNA沉默ATF4的蛋白表达后,能部分逆转顺铂引起的细胞凋亡以及克隆形成抑制.结论 顺铂可以通过上调ATF4的表达,触发内质网反应,从而诱导肝癌细胞凋亡.     

ABT737通过激活JNK/c-Jun通路上调Bim诱导宫颈癌细胞凋亡

【目的】探讨JNK/c-Jun信号通路激活Bim在ABT737诱导宫颈癌细胞凋亡中的作用。【方法】用MTT法检测ABT-737对人宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用;用流式细胞术检测细胞凋亡率;用Western blot方法检测JNK、phospho-JNK、c-Jun、phospho-c-Jun以及Bim蛋白的表达;用RT-PCR检测Bim在mRNA水平的变化;用JNK特异性抑制剂SP600125和siRNA瞬时转染抑制JNK及c-Jun的活性。 【结果】ABT-737能抑制Hela细胞的生长,诱导HeLa细胞发生凋亡。ABT737可激活JNK激酶活性其下游靶分子c-Jun,凋亡相关基因Bim在mRNA水平和蛋白水平的表达也随之上调。应用JNK特异性抑制剂SP600125和靶向JNK及c-Jun的siRNA抑制JNK或c-Jun的活性或表达后,ABT737诱导的Bim上调及细胞凋亡亦被有效阻断。【结论】ABT737通过JNK/c-Jun信号通路上调凋亡相关基因Bim的表达,诱导HeLa细胞发生凋亡。     

吲哚-3-甲醇新衍生物I3C-6对宫颈癌HeLa细胞生长的影响

目的研究吲哚-3-甲醇（I3C）的一种新衍生物I3C-6对人类宫颈癌HeLa细胞生长的影响。方法采用MTT法和体外划痕法检测HeLa细胞的生长和浸润;采用流式细胞术检测对细胞周期的影响;采用DNA梯带凝胶电泳法检测细胞凋亡,采用Westernblot方法检测蛋白表达。结果I3C-6呈现剂量依赖性抑制HeLa细胞的生长,IC50剂量约为10μmol/L。I3C-6处理HeLa细胞后出现显著的细胞凋亡峰（SubG1峰）。DNA凝胶电泳结果也提示I3C-6处理的细胞出现明显的凋亡DNA片段。I3C-6可下调Bcl-2蛋白的表达,并上调Bax蛋白的表达。结论I3C-6可以抑制人类宫颈癌HeLa细胞生长,这与其诱导的细胞凋亡、细胞周期抑制以及凋亡蛋白调节有关。I3C-6可能是一种有效的抗宫颈癌药物和辅助治疗药物。     

siRNA抑制syk基因对外周T细胞淋巴瘤细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨siRNA抑制脾酪氨酸激酶(syk)基因后对外周T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78细胞增殖与凋亡的影响.方法 针对syk基因特异靶点设计3条siRNA(siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3),采用电穿孔法转染外周T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78,同时设Mock组和siRNA-NC组,转染48 h后,分别用RT-PCR和Western blot技术检测syk mRNA和蛋白的表达水平,筛选出最有效的syk siRNA;syk siRNA转染HUT-78后分别用软琼脂克隆形成实验检测syk下调后HUT-78细胞的克隆形成能力,MTT法检测干扰24、48、72 h后细胞增殖情况,流式细胞术检测syk下调后HUT-78细胞的凋亡情况.结果 RT-PCR和Western blot结果显示,与Mock组和siRNA-NC组相比,3条siRNA均能有效降低HUT-78细胞中syk mRNA和蛋白的表达,其中syk siRNA-1抑制效果最明显.克隆形成实验显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的克隆形成能力与Mock组相比明显下降(P<0.05);MTT实验结果显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的增殖能力与Mock组相比显著下降(P<0.05);流式细胞术结果显示,下调syk基因表达后HUT-78细胞的凋亡比例明显高于Mock组(P<0.05).结论 siRNA下调syk基因表达后可抑制外周T细胞淋巴瘤细胞的增殖、克隆形成,促进凋亡,推测syk基因在外周T细胞淋巴瘤的发生发展中发挥重要作用,有可能成为外周T细胞淋巴瘤基因治疗的新靶点.     

siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响

目的: 观察HPV16 E6 siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响.方法: 利用脂质体将HPV16 E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E6 mRNA的变化,流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化,MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化.结果: HPV16 E6 siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6 mRNA和E6蛋白的表达,抑制率分别为89.5%和98.1%;表达载体可明显增加细胞凋亡率,抑制细胞的增殖和克隆的形成.结论: HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达,增加细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成.     

si-RNA介导FGFR1基因沉默对胃癌细胞生长及凋亡的影响

目的探索靶向沉默成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）表达对胃癌细胞SGC-7901生长及凋亡的影响。方法通过Westernblotting法研究FGFR1蛋白在胃癌细胞SGC-7901以及人正常胃黏膜上皮细胞GES-1的表达情况;设计合成特异性针对FGFR1基因的小干扰RNA（siRNA）及阴性对照-siRNA（NC-siRNA）;采用瞬时转染法将siRNA转入胃癌细胞SGC-7901中,Westernblotting法检测转染siRNA-FGFR1后对SGC-7901细胞中FGFR1蛋白表达的影响。通过MTT法检测siRNA-FGFR1对SGC-7901细胞增殖抑制的时间-效应关系,以及克隆集落形成实验检测siRNA-FGFR1对SGC-7901细胞克隆集落形成的影响;采用Hoechst染色法和流式细胞术检测siRNA-FGFR1对胃癌细胞凋亡的影响。结果与人正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比,胃癌细胞SGC-7901的FGFR1蛋白表达水平明显增高（P＜0.05）;siRNA-FGFR1转染SGC-7901细胞后,FGFR1蛋白表达水平明显下调（P＜0.05）;胃癌细胞增殖生长曲线提示,用siRNA技术沉默胃癌细胞中FGFR1的表达后,相较于空白组和NC-siRNA组,siRNA-FGFR1组细胞增殖明显受抑制,另外胃癌细胞SGC-7901克隆集落形成明显受抑制;流式细胞术结果表明,正常组与NC-siRNA组中胃癌SGC-7901细胞早期凋亡百分比差异无统计学意义（P＞0.05）,而siRNA-FGFR1组细胞早期凋亡百分比显著升高（P＜0.01）。结论siRNA-FGFR1可抑制FGFR1蛋白在人胃癌细胞SGC-7901中的表达,并抑制胃癌细胞的生长,促进其凋亡。以FGFR1为靶点的小RNA干扰技术有望成为胃癌靶向治疗的新方法。     

siRNA转染浓度和时间对HeLa细胞ANXA5表达的抑制作用

目的：优化靶向ANXA5的siRNA转染HeLa细胞的条件,为进一步研究ANXA5低表达对宫颈癌细胞生物功能的影响奠定基础。方法：将靶向ANXA5的siRNA转染HeLa细胞,设置不同的siRNA与脂质体的比值和转染时间,Western Blot检测ANXA5蛋白的表达。结果：siRNA与脂质体的比值为0.4：1时,转染入HeLa细胞72h后,HeLa细胞ANXA5蛋白的表达水平最低,即抑制作用最强。结论：siRNA与脂质体的比值和转染时间可影响HeLa细胞ANXA5的表达,存在最佳比值和转染时间。     

siRNA介导的MAPKp42沉默诱导HeLa细胞凋亡

目的应用siRNA沉默HeLa细胞MAPKp42,研究其对细胞存活的影响。方法体外合成靶向MAPKp42的siRNA-1和siRNA-2,并用脂质体转染HeLa细胞,Western印迹法和免疫组织化学法检测p42^MPAK的表达;电镜观察,TUNEL法测定细胞凋亡,Annexin-PI法测定不同凋亡时期细胞的分布。结果siRNA-1和siRNA-2均可使HeLa细胞MAPK p42沉默,使p42^MAPK表达下调,与阴性对照组相比分别降低2、5倍和3．2倍。电镜观察证实,siRNA-1和siRNA-2转染组部分细胞丧失表面微绒毛,细胞内空泡增加,细胞核染色质边集。处理组HeLa细胞早期凋亡率显著增加,其中siRNA-1组晚期凋亡率也明显增加。结论siRNA介导的MAPKp42沉默可以诱导HeLa细胞凋亡。     

核仁素表达下调对宫颈癌细胞Hela生物学行为的影响

目的 探讨核仁素表达下调对宫颈癌Hela细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响。方法 实验分4组：3个靶向人核仁素基因的实验组(siN1组、siN2组、siN3组)及1个阴性对照组(NC组)。体外化学合成各组siRNA并转染HeLa细胞;利用荧光实时定量RT-PCR法和Western blotting法分别从mRNA和蛋白水平检测核仁素基因的干扰效率,并筛选出干扰效率最高的片段;利用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测核仁素下调对HeLa细胞增殖活性的影响;利用流式细胞学Annexin V-FITC检测转染后HeLa细胞凋亡率的改变;Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的改变。结果 与NC组相比,各实验组核仁素mRNA表达水平均下降(P<0.05);蛋白表达水平也相应下调(P<0.05)。成功筛选出最佳干扰片段siN2,用于后续实验。siN2组HeLa细胞生长速率明显受到抑制(P<0.05);流式细胞学Annexin V-FITC检测siN2组HeLa细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.05);Transwell实验显示siN2组HeLa细胞侵袭能力减弱(P<0.05)。结论 核仁素表达下调明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭能力,促进细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了理论依据。     

靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA与ASO联合应用对宫颈癌细胞转移能力的影响

目的 探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal Ⅰ)小分子干扰RNA(siRNA)及其与反义寡核苷酸(ASO)联合应用对ST6Gal Ⅰ高表达的宫颈癌HeLa细胞的粘附和侵袭力的影响.方法 设计并合成靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染HeLa细胞.实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA相同靶点)、ASO2组(与siRNA不同靶点)、siRNA ASO1组及siRNA ASO2组,用RT-PCR测定细胞中ST6Gal Ⅰ mRNA水平,流式细胞仪检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)的粘附与侵袭力.结果 转染后各实验组细胞的ST6Gal Ⅰ mRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均低于空白对照组及脂质体对照组(P均＜0.05),以siRNA ASO2组调低作用最明显.其中siRNA组细胞的ST6Gal Ⅰ mRNA表达水平(0.55±0.08)、细胞表面α2,6-唾液酸含量(39.27±9.23)分别与siRNA ASO1组(0.54±0.09、38.27±7.74)比较,差异均无统计学意义,与siRNA ASO2组(0.33±0.09、9.10±0.40)比较,差异有统计学意义(P均＜0.05);siRNA组与siRNA ASO1组比较,细胞对ECM的粘附与侵袭力差异均无统计学意义,而siRNA ASO2组细胞对ECM的粘附与侵袭力较siRNA组降低(P均＜0.05).结论 化学合成的靶向ST6Gal Ⅰ的siRNA能够下调HeLa细胞中ST6Gal Ⅰ基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应.     

siRNA-FAM92A1-289对HeLa细胞增殖的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)沉默基因FAM92A1-289对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法:化学合成法合成小干扰RNA(siRNA),阳离子脂质体转染FAM92A1-289 HeLa细胞;实时定量RT-PCR检测其mRNA表达,MTT法和流式细胞仪检测转染后HeLa细胞增殖、细胞周期和凋亡变化。结果:转染合成FAM92A1-289 siRNA后,HeLa细胞中FAM92A1-289 mRNA表达下降(P<0.01),细胞增殖均明显增强(P<0.01);细胞周期分布改变,S期细胞明显增多,而G2/M期细胞减少,凋亡率无变化。结论:FAM92A1-289基因调节细胞增殖活动。     

靶向4-1BBL基因siRNA抑制HL-60B细胞生长的体外研究

目的：观察4-1BBL基因小分子干扰RNA（siRNA）对HL-60细胞生长及诱导其凋亡作用的影响。方法：化学合成法合成靶向人4-1BBL基因siRNA,脂质体转染法转染HL-60B细胞;半定量PCR和流式细胞术检测转染前后HL-60B细胞4-1BBL的表达水平,MTT法检测HL-60B细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：靶向4-1BBL基因siRNA转染HL-60B细胞后,4-1BBLmRNA和蛋白的表达明显降低;细胞增殖被抑制,其抑制作用在转染后48h最明显,增生抑制率达到（22.1±2.3）%;细胞凋亡率增加,由（9.8±2.5）%上升到（32.5±5.1）%。结论：化学合成的siRNA在体外能成功抑制靶基因4-1BBL的表达和HL-60B细胞的增殖,并有助于细胞趋向凋亡。     

葡萄糖苷酶Ⅰ特异性siRNA-EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建葡萄糖苷酶Ⅰ(glucosidaseⅠ, GluⅠ)特异性siRNA真核表达载体。方法:根据 siRNA靶序列选取原则,设计并合成针对鼠葡萄糖苷酶ⅠcDNA的寡聚DNA,退火并连接至载体 pSilencer1.0 U6,再将 U6 启动子及下游插入片断一起切下,克隆至真核表达载体 pEGFP C1,通过限制性酶切和测序对重组表达载体进行鉴定,最后将该质粒转染至HeLa细胞,共聚焦荧光显微镜观察其表达。结果:①限制性酶切和测序结果表明成功构建了带有EGFP基因的鼠GluⅠ特异性的siRNA真核表达载体 pC 1U6glu; ②共聚焦荧光显微镜观察结果表明p C1U6glu成功转染至HeLa细胞。结论:pC 1U6glu的成功构建及表达为进一步利用 siRNA研究葡萄糖苷酶Ⅰ的功能和治疗肿瘤奠定基础。     

siRNA阻断NF—κB通路抑制HepG2细胞增殖及NK杀伤抵抗性

目的利用小于扰RNA（siRNA）阻断肝癌细胞HepG2中的NF—κB信号通路,研究其对肝癌细胞增殖活性及NK杀伤敏感性的影响。方法利用NF—κB p65 siRNA转染HepG2细胞,48h后分别进行Western blotting及ELISA检测NF—κB p65蛋白的表达;MTT法检测转染后细胞的增殖变化及对NK-92细胞杀伤敏感性的变化。结果转染NF—κB p65 siRNA后肝癌细胞中NF—κB p65蛋白表达的水平明显下降;MTT检测发现,与对照组相比,NF—κB p65 siRNA能够明显抑制HepG2细胞的增殖活性,同时使其对NK-92细胞介导的杀伤敏感性增加（P〈0．05）。结论siRNA阻断NF—κB通路能够抑制肝癌细胞增殖及对NK细胞杀伤的抵抗性。     

hTERT siRNA表达载体的构建及对转染的HeLa细胞生长抑制作用

目的:通过RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨干涉后对肿瘤细胞生长的抑制作用. 方法:根据人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA编码序列,设计RNA干涉靶点,构建siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并转染HeLa细胞,通过RT-PCR法观察重组质粒转染肿瘤细胞后端粒酶mRNA、蛋白含量及细胞生长情况. 结果:构建的siRNA表达载体可以使HeLa细胞端粒酶逆转录酶mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度减慢. 结论:成功构建了针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中端粒酶的表达,并引起细胞生长抑制.     

Inhibition of survivin expression and mechanisms of reversing drug-resistance of human lung adenocarcinoma cells by siRNA

Background Survivin, a member of the inhibitor of apoptosis protein （IAP） family, overexpresses in tumor cells and not expresses in terminally differentiated adult tissues. This study aimed to investigate the effects of survivin-specific siRNA on cell proliferation, apoptosis and chemosensitivity to cisplatin in vitro and in vivo and explore the mechanisms about decreasing expression of survivin in reversing cancer cells resistance to chemotherapeutic drug.Methods Survivin-specific siRNA was transfected into A549/DDP cells. The expression of survivin and lung resistance-related protein （LRP） mRNA levels were determined by RT-PCR, chemosensitivity of A549/DDP （cisplatin）cells to cisplatin was determined by MTT assay, and apoptosis and cell cycle were determined by flow cytometry （FCM）.The protein expression levels of survivin, LRP, cyclin-D1, caspase-3 and bcl-2 were determined by Western blotting analyses. The effect of survivin siRNA inhibition on tumor growth was studied in athymic nude mice in vivo.Results Survivin-specific siRNA efficiently down-regulated survivin expression. The cell cycle was arrested at G2/M phase, and apoptosis was obviously found. Inhibition of survivin expression could make the IC50 and drug-resistant index of cisplatin decrease, and enhance the cancer cells sensitivity to cisplatin. After transfection by survivin-specific siRNA, expression of LRP and cyclin-D1 were downregulated, caspase-3 expression was upregulated, bcl-2 expression had no obvious change. The animal experiment confirmed knockdown of survivin could inhibit the tumor growth.Conclusions Survivin-specific siRNA can efficiently suppress the expression of survivin, increase apoptosis, inhibit cells proliferation and enhance the chemosensitivity to cisplatin in vitro and in vivo. Suppression of survivin expression helping to reverse drug-resistance may have relationship with downregulation of LRP and upregulation of caspase-3.Anti-tumor strategies based on the inhibition of survivin may be useful in targeting lung adenocarcinomas.