抑制miR-181a对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y多巴胺能细胞损伤的保护作用

目的:通过抑制mi R-181a表达研究其对鱼藤酮诱导SH-SY5Y的细胞损伤、内质网应激以及未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)的影响,为mi R-181a在帕金森病治疗方面提供初步的实验依据。方法:不同浓度的鱼藤酮诱导SH-SY5Y作用12、24、48、72 h;mi R-181a类似物和mi R-181a抑制剂及0.4μmol/L鱼藤酮诱导SH-SY5Y作用24 h;采用CCK-8法检测细胞存活率;Annexin V/PI双染检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测mi R-181a与葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 k D,GRP78)的靶标关系;q RT-PCR检测mi R-181a和GRP78 m RNA表达水平;Western Blot检测GRP78、肌醇需酶1α(inositol-requiring enzyme 1,IRE1α)、X-盒结合蛋白1(X box-binding protein 1,XBP1)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)的蛋白表达水平。结果:(1)CCK-8结果显示:随着鱼藤酮浓度(0.1μmol/L)增加,SH-SY5Y存活率降低,并存在浓度和时间依赖性;其中0.4μmol/L作用24 h后存活率已降为0.6(P0.05),加入mi R-181a抑制剂后细胞存活率升高达0.8(P0.05);(2)Annexin V/PI双染结果显示:抑制mi R-181a表达,细胞的凋亡降低至0.23(P0.05);(3)双荧光素酶报告基因检测显示:mi R-181a与GRP78存在直接的靶标关系;(4)q RT-PCR结果显示:0.4μmol/L鱼藤酮作用24 h后细胞mi R-181a呈高表达(P0.05),抑制mi R-181a表达可上调GRP78 m RNA水平(P0.05);(5)Western Blot结果显示:抑制mi R-181a表达可上调GRP78和下调p IRE1α、XBP1和CHOP的蛋白表达(P0.05)。结论:抑制mi R-181a表达可减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤,其机制可能通过上调GRP78进而调节内质网应激以及抑制UPR相关信号通路,从而发挥对神经元细胞的保护作用。     

Exendin-4可通过下调内质网应激信号标志蛋白表达改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂exendin-4对内质网应激(ERS)诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的影响。方法:体外培养3T3-L1脂肪细胞,分别用TM、内质网应激抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)及exendin-4进行干预,以MTT法检测不同干预条件下脂肪细胞的存活情况,以葡萄糖氧化酶法检测不同干预条件下脂肪细胞的葡萄糖消耗量情况,利用Western blot法检测不同干预条件下p-Akt、Akt及ERS关键信号标志蛋白肌醇需求蛋白1(IRE1)、p-IRE1、c-Jun末端激酶(JNK)、p-JNK、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、真核生物翻译起始因子2的α亚单位(eIF2a)、p-eIF2a和转录激活因子(ATF)-6的蛋白水平。结果:单独TUDCA或exendin-4作用,可协同胰岛素作用,增加胰岛素刺激的脂肪细胞葡萄糖消耗量(P0.05)。TM(5 mg/L)作用5 h后可减少胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞萄糖消耗量(P0.05)及p-Akt的蛋白水平(P0.05)。TUDCA(1 mmol/L)或exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h后,均可拮抗TM对胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞萄糖消耗量(P0.05)及p-Akt蛋白水平的改变(P0.05),二者效价相当。TM(5 mg/L)作用5 h后可显著提高ERS标志蛋白的表达。而exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h后,可降低TM诱导的ERS标志蛋白的表达,其效价与应用内质网应激抑制剂TUDCA(1 mmol/L)预处理24 h相当。不同的处理因素对于总IRE1、JNK、PERK及eIF2a的表达情况并无显著性影响。结论:Exendin-4可改善内质网应激介导的3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗。     

色钉菇乙酸乙酯相对SH-SY5Y细胞的保护作用

目的探讨色钉菇乙酸乙酯提取物对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导损伤的多巴胺能神经元的保护作用。方法以SH-SY5Y细胞系为对象,首先测定MPP+孵育48 h时的半致死量(IC50)。然后用25mg/L、50mg/L、100mg/L等剂量的乙酸乙酯提取物预先孵育4 h,随后加入1.0mmol/L(IC50值)MPP+孵育48 h。通过MTT法检测细胞活性;Hoechst染色法、AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术检测法观察细胞凋亡情况。利用DCFHDA检测色钉菇乙酸乙酯提取物对细胞内活性氧(ROS)水平的影响。结果 1.0mmol/L MPP+孵育48 h时达到半致死剂量,MPP+的损伤浓度确定为1.0mmol/L。预先经色钉菇乙酸乙酯相(50mg/L)孵育,可显著提高SH-SY5Y细胞的活力,降低细胞凋亡率。MPP+损伤后ROS水平急剧升高,而25mg/L、50mg/L、100mg/L乙酸乙酯提取物干预后ROS水平下降。结论 50mg/L色钉菇乙酸乙酯相可显著减轻MPP+对SH-SY5Y细胞的毒性损伤,具有显著的保护作用。     

慢性复合应激对大鼠学习与记忆及海马 NMDA受体NR1亚基表达的影响

目的：观察慢性复合应激对大鼠学习与记忆的影响和海马内NMDA受体亚基NR1表达的变化。方法：成年雄性Wistar大鼠实验组每天交替暴露于复合应激原环境中达6w，然后作Morris水迷宫和Y迷宫作业测试，再采用免疫组织化学和图像处理方法分析海马CA1、CA3和齿状回区内NR1的表达变化。结果：慢性复合应激组大鼠寻找平台的潜伏期较对照组明显缩短，学会躲避电击的正确次数较对照组明显增多；海马内NMDA受体亚基NRI的表达水平较对照组明显上调。结论：慢性复合应激可增强学习与记忆能力，NMDA受体表达变化可能是影响学习与记忆的机制之一。     

氧化损伤对内皮细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

目的:通过第三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs),建立体外氧化应激的细胞凋亡模型,观察氧化损伤对内皮细胞内质网应激(ER stress)相关蛋白表达的影响。方法:不同浓度t-BHP(25、50、100、200、400μmol/L)诱导HUVECs 1-24 h,MTT法观察t-BHP作用后细胞的存活率;Hoechst/PI染色荧光显微镜观测细胞凋亡形态;Western blotting检测ER应激标志物肌醇需求激酶1α(IRE1α)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达情况。结果:不同浓度t-BHP(25、50、100、200、400μmol/L)诱导HUVECs 1-24 h后,发现随着t-BHP作用浓度的增加和时间的延长,细胞活力逐渐下降;不同浓度t-BHP处理8 h后,t-BHP大于25μmol/L时,细胞凋亡率明显增加(6.3%±0.6%、16.1%±0.9%、24.7%±1.5%、23.8%±1.3%,P0.05);ER应激相关信号蛋白IRE1α、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)及凋亡蛋白caspase-3表达增加。结论:氧化应激可导致内皮细胞发生凋亡,可能与引起内质网应激相关信号蛋白的表达有关。     

山栀苷对6-羟基多巴胺损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用及其机制

目的：观察山栀苷对6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的作用,并探讨其作用的分子机制。方法：以6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞为帕金森病体外细胞模型,分别以5、50、100和200μmol/L山栀苷作用于受损细胞,另设空白组及50μmol/L栀子苷阳性对照组。CCK-8法检测细胞活力;倒置显微镜下观察细胞形态学改变;流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）的荧光强度;分子对接技术评价山栀苷、栀子苷与Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)的结合情况;Western blot检测Keap1、核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶1(HO-1)蛋白表达水平;RT-qPCR检测HO-1的mRNA水平。结果：（1）与空白组比较,模型组细胞活力降低,细胞数量减少,形态改变明显,ROS水平显著升高,Nrf2和HO-1蛋白表达均显著下降,HO-1的mRNA水平显著降低（P<0.05）;(2)与模型组比较,山栀苷预处理2 h可提高6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞的活力,其中100μmol/L山栀苷组的细胞活力最高（P<0.05）,还可显著降低ROS水平...     

Survivin在MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡过程中的作用

目的探讨存活素(Survivin)能否抑制(1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP~+)诱导的神经元(SH-SY5Y细胞)的凋亡过程。方法运用1 mmol/L MPP~+处理SH-SY5Y细胞,诱导其发生凋亡,建立帕金森病的细胞模型,采用不同浓度的Survivin进行预处理,使用倒置显微镜观察细胞形态,采用MTT法、Real-time PCR、Western blot检测相关指标,进而评价Survivin对SH-SY5Y凋亡的作用。结果 1 mmol/L MPP~+作用24 h可诱导SH-SY5Y的凋亡,显著降低细胞存活率(F=13.32,P=0.000)。MPP~+作用前,预先经Survivin处理2 h的SH-SY5Y细胞的存活率显著提高(F=13.32,P=0.000,P=0.000,P=0.000),并呈剂量依赖性关系。Real-time PCR结果显示Survivin能够显著抑制SH-SY5Y细胞中凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的表达水平(F=61.57,P=0.000,P=0.000,P=0.000;F=54.26,P=0.001,P=0.000,P=0.000);Western blot结果亦显示Survivin能够显著抑制SH-SY5Y细胞中凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的表达水平。结论 Survivin能够剂量依赖性地抑制MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其机制可能与阻断Caspase信号通路相关。     

内质网应激诱导的自噬对肝细胞凋亡的影响

目的:观察二硫苏糖醇(DTT)诱导人正常肝细胞LO2发生内质网应激的过程中自噬相关指标表达的变化及其对细胞凋亡的影响。方法:采用2.0 mmol/L DTT处理LO2细胞0、6、12和24 h,诱导细胞发生内质网应激;real-time PCR及Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、自噬相关基因12(Atg12)、自噬相关基因5(Atg5)和微管相关蛋白1轻链3(LC3) mRNA及蛋白水平的变化;流式细胞术检测细胞凋亡情况;透射电镜观察自噬小体的产生情况。采用400 nmol/L的雷帕霉素预处理LO2细胞1 h,再给予2.0 mmol/L的DTT处理24 h,观察雷帕霉素预处理对细胞凋亡的影响。结果:2.0 mmol/L DTT处理LO2细胞6、12和24 h后,细胞中GRP78、PERK、ATF4、CHOP、Atg12、Atg5和LC3的mRNA及蛋白水平较0 h组显著上调(P 0.05);同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ也较0 h组显著增高(P 0.05);透射电镜检测发现,DTT处理6、12和24 h后,细胞中均可见自噬小体的产生;流式细胞术检测发现,DTT处理细胞6、12和24 h后,细胞凋亡较0 h组显著增加;而经自噬诱导剂雷帕霉素预处理后,DTT诱导的细胞凋亡显著下降(P0.05)。结论:内质网应激可诱导自噬的发生,而雷帕霉素预处理可在一定程度上减轻内质网应激诱导的LO2细胞凋亡。     

Nox1/4抑制剂减轻脂多糖致人脐静脉融合细胞的损伤

目的研究Nox1/4抑制剂对脂多糖致人脐静脉融合细胞EA.hy926损伤的保护作用及相关机制。方法将EA.hy926细胞分为对照组、LPS(脂多糖)组、Nox1/4抑制剂(GKT137831)+LPS组。CCK8法检测细胞活力;试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)与一氧化氮(NO)的含量;免疫荧光法检测细胞内活性氧(ROS)的水平;ELISA检测细胞IL-1β、IL-6的分泌情况;Western blot检测细胞内内质网应激标志性蛋白表达水平。结果 LPS组较对照组比较,NO的释放量、ROS生成量以及炎性因子IL-1β和IL-6释放量明显增加(P0.05);使用Nox1/4抑制剂干预后,ROS产生以及NO、IL-1β和IL-6的释放量明显降低(P0.05)。与对照组相比,LPS组细胞内GRP78、p-PERK、ATF6和IREα蛋白表达上调,提示内质网应激被激活;Nox1/4抑制剂干预后,内质网应激标志性蛋白表达下降。结论 Nox1/4抑制剂减轻了LPS诱导的EA.hy926细胞内质网应激损伤。其作用机制可能是通过减少细胞内Nox1/4来源的ROS的生成,抑制内质网应激,进而减轻炎性反应,改善内皮功能。     

4-PBA通过抑制内质网应激降低七氟醚诱导的HT22细胞凋亡

目的:探讨七氟醚暴露后的神经细胞损害以及通过4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid,4-PBA)抑制内质网应激对这种损害的保护作用。方法:以小鼠海马神经元来源的HT22细胞系为研究对象,将其分为对照组、七氟醚处理组、七氟醚+4-PBA预处理组。处理组在吸入性麻醉诱导箱中给予5%CO2和2%七氟醚麻醉处理5h,对照组只通入5%CO2,4-PBA预处理组则在麻醉前30 min给予4-PBA腹腔注射。检测内质网应激蛋白指标Bi P、p-IRE1以及活化的caspase12,并利用流式细胞法检测HT22细胞的凋亡情况。结果:(1)七氟醚诱导HT22细胞发生内质网应激,七氟醚处理后Bi P蛋白和IRE1的磷酸化水平明显升高,而4-PBA预处理组上述指标显著下降(P0.01)。(2)七氟醚引起的HT22细胞凋亡能够被4-PBA抑制,流式细胞技术显示处理组细胞凋亡率明显大于4-PBA预处理组(P0.01)。(3)内质网应激相关的caspase12激活介导了七氟醚引起的HT22细胞凋亡。统计学分析显示,处理组cleaved caspase12表达显著升高(P0.01)。结论:吸入性麻醉剂七氟醚具有一定的神经毒性,内质网应激是其神经损害的重要机制之一。七氟醚能够通过诱导内质网应激而引起HT22细胞凋亡,而麻醉前给予4-PBA预处理可明显降低内质网应激反应,减少细胞凋亡,从而对七氟醚的神经毒性起到抵抗作用。     

绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯对酒精诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用研究

目的：体外观察绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对酒精诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用,初步探讨EGCG治疗酒精性痴呆(alcohol-associated dementia,AAD)的可行性。方法：以SH-SY5Y神经元细胞为实验对象,酒精组给予100 mol/L酒精37℃培养24 h, EGCG+酒精组在其培养液中同时加入不同浓度的EGCG(1~100μmol/L)及100 mol/L酒精,37℃培养24 h;另设相同浓度的EGCG对照组(EGCG组)及空白对照组(对照组)。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,以Annexin-V APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡及光镜下观察细胞形态。结果：MTT结果证实EGCG(25~100μmol/L)作用24 h后可明显促进SH-SY5Y细胞存活,并呈浓度依赖关系(P<0.001)。流式检测及细胞形态观察结果证实酒精组细胞凋亡率(21.82%±1.27%),明显高于对照组(4.90%±0.80%)(P<0.001)及EGCG组(7.82%±0.68%)(P<0.001);EGCG(100μmol/L)+酒精组细胞凋亡率(10.81%±0.31%),明显低于酒精组(P<0.001)。结论：EGCG可抑制酒精诱导SH-SY5Y细胞凋亡发生并促进细胞存活,提示EGCG对于AAD治疗具有潜在价值。     

延龄草总皂苷通过调控GRP78/IRE1α/TRAF2/JNK信号通路抑制内质网应激而减轻PSCI大鼠海马神经元损伤

目的：探讨延龄草总皂苷（TST）对卒中后认知障碍（PSCI）大鼠海马神经元的保护作用及分子机制。方法：将采用改良Zea Longa线栓法造模成功的大鼠随机分为模型（model）组、TST(100 mg/kg)组和盐酸多奈哌齐（DON; 0.45 mg/kg）组，另设假手术（sham）组，每组10只，连续给药4周。采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力；TTC染色检测大鼠脑梗死体积变化，HE、Nissl和TUNEL染色观察大鼠海马组织神经元病理变化；免疫组化及Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、肌醇需求酶1α(IRE1α)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、胱天蛋白酶12(caspase-12)、Bax和Bcl-2的蛋白水平。结果：与sham组相比，model组大鼠逃避潜伏期显著延长，穿越平台次数及目标象限停留时间显著减少（P<0.01）；大鼠脑梗死体积显著增大，神经元尼氏小体数量显著减少，凋亡细胞显著增多；海马组织中GRP78、IRE1α、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白...     

白杨素对离体培养致炎大鼠软骨细胞凋亡及内质网应激GRP78/PERK/CHOP通路的影响

目的：观察白杨素（CHR）对大鼠软骨细胞凋亡的影响,并探究其可能分子机制。方法：提取大鼠软骨细胞,使用脂多糖（LPS）诱导体外骨关节炎模型,将细胞随机分为对照（control）组、LPS组及CHR处理组（处理浓度分别为1和5 mg/L）;采用CCK-8法测定不同条件下软骨细胞的活力;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;Hoechst 33342染色法观察凋亡细胞核变化;Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白及内质网应激相关蛋白[葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录激活因子6(ATF-6)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、p-PERK、真核起始因子2α(eIF2α)和p-eIF2α]的表达水平。结果：CHR浓度为1和5 mg/L时可显著提高LPS致炎软骨细胞的活力（P<0.05）,逆转细胞凋亡情况,上调Bcl-2的蛋白表达（P<0.05）,抑制Bax、cleaved caspase-3、caspase-9、GRP78、ATF-6和CHOP的蛋白表达（P<0.05）,降低p-PERK/PERK和p-eIF2α/e...     

基于IL-33/ST2L通路研究黄芩苷对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用

目的：探讨黄芩苷对缺血性脑卒中大鼠的神经功能及IL-33/白介素1受体样1(ST2L)信号通路的影响。方法：将90只大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组[0.4 mg/（kg·d）]、黄芩苷低、中、高剂量组[50、100、150 mg/（kg·d）]，改良Longa线栓法构建缺血性脑卒中大鼠模型。建模24 h后，Longa评分对所有大鼠神经功能损伤进行评分；ELISA法检测大鼠血清IL-6、TNF-α水平；2,3,5-三苯基氯化四唑（TTC）染色测定大鼠脑梗死面积；苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠脑组织病理学变化；免疫组化法检测大鼠脑组织小胶质细胞数目；Western blot检测大鼠脑组织中IL-33/ST2L通路蛋白表达。结果：假手术组大鼠脑组织海马区未发生水肿，组织排列层次分明，神经元细胞结构正常；模型组大鼠海马区出现严重水肿，神经元紊乱，细胞核固缩、坏死，神经元细胞大量死亡；尼莫地平组、黄芩苷低、中、高剂量组大鼠水肿程度减轻，神经元细胞、变性、死亡数量减少，随着黄芩苷剂量增加，水肿程度逐渐变轻，神经元细胞死亡数量逐渐减少。与假手术组相比，模型组大鼠Longa评分、脑梗死面积...     

氧化损伤对MIN6细胞内质网应激凋亡通路相关分子表达的影响

目的:通过第三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导小鼠胰岛β细胞凋亡,研究氧化损伤对内质网应激JNK凋亡通路相关分子表达的影响。方法:将不同浓度t-BHP(0~400μmol/L)分别加入胰岛β细胞株M IN6细胞中,于不同时间(0~8 h)收集细胞悬液进行相关检测。CCK-8法检测细胞增殖活力;An-nexin-V-PI流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率及坏死率;Caspase-3检测试剂盒测定caspase-3活性;W estern b lot检测内质网应激相关分子IRE1,αJNK,P-JNK,Caspase-3蛋白的表达。结果:随t-BHP浓度的增高,①M IN6细胞的存活率降低;②t-BHP以浓度≥25μmol/L作用≥1 h时,Caspase-3活性有明显变化(P<0.05);③随t-BHP浓度增大、作用时间延长,内质网应激跨膜蛋白IRE1α表达逐渐减少,P-JNK、活性caspase-3表达明显增多。结论:①t-BHP引发细胞凋亡坏死呈一定的时效和量效关系;②持续t-BHP氧化损伤可诱导M IN6细胞发生内质网应激并发生凋亡;③内质网应激凋亡通路相关分子表达在细胞凋亡过程中有浓度和时间依赖性。     

刺芒柄花素通过阻断海马组织NF-κB通路抑制炎症因子释放改善慢性轻度不可预见性应激老龄大鼠认知行为

目的 探讨刺芒柄花素(FMN)在慢性轻度不可预见性应激(CUMS)老龄大鼠认知行为和炎症中的调节作用。方法约70周龄的SD大鼠分为健康对照组、 CUMS模型组、 CUMS联合10 mg/kg FMN组、 CUMS联合20 mg/kg FMN组和CUMS联合1.8 mg/kg盐酸氟西汀(Flu)组。除健康对照组外，其余各组大鼠以CUMS刺激并根据分组给药，持续28 d。糖水偏好、强制游泳实验和旷场实验观测各组大鼠情绪行为。Y迷宫实验检测大鼠学习、记忆和空间认知。HE染色观察脑海马区病理损伤程度，试剂盒检测5-羟色胺(5-HT)和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)含量，原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测脑组织细胞凋亡，ELISA检测外周血中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素6(IL-6)含量，Western blot法检测脑组织中B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、活化的胱天蛋白酶9(cleaved caspase-9)、 cleaved caspase-3、 Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)和磷...     

左卡尼汀通过内质网应激ATF6通路抑制高糖诱导的HAECs凋亡

目的:探讨左卡尼汀对高糖诱导的人主动脉内皮细胞(HAECs)凋亡的影响及相关分子机制。方法:以高糖培养基培养HAECs并诱导其发生凋亡,同时以不同浓度(50、100和200μmol/L)的左卡尼汀对HAECs进行处理。以MTT法对细胞活力进行检测;Hoechst 33258染色及流式细胞术评估细胞凋亡情况;比色法对HAECs的caspase-3活性进行检测;Western blot法对细胞内质网应激信号通路蛋白及磷酸化水平进行分析。结果:高糖培养诱导HAECs产生凋亡并显著抑制细胞活力。高糖培养的HAECs中产生内质网应激,其蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇需酶1(IRE1)及活化转录因子6(ATF6)信号通路均被显著激活,能够通过下游caspase-4/3级联瀑布反应诱导细胞凋亡。然而,左卡尼汀能够显著减少高糖诱导的HAECs细胞凋亡,使细胞存活率升高,且呈现出浓度依赖性。左卡尼汀可显著降低高糖培养HAECs诱发的内质网应激,通过下调位点1蛋白酶(S1P)及位点2蛋白酶(S2P)表达降低其对ATF6剪切形成的促凋亡因子ATF6 p50的水平;而左卡尼汀并未对PERK及IRE1信号通路活性表现出抑制作用。结论:左卡尼汀能够抑制高糖对HAECs凋亡的诱导作用,其作用机制可能为抑制内质网应激相关的ATF6信号通路。     

参附注射液对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑皮层IRE1α表达及神经元凋亡的影响

目的:观察参附注射液对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑皮层中内质网应激关键分子-肌醇需求因子1α(inositol-requiring enzyme1α,IRE1α)表达及神经元凋亡的影响,探讨其脑保护机制。方法:参照Rice法制备HIBD模型,将7日龄SD大鼠随机分为假手术组(S)和HIBD模型组,模型组又分为生理盐水对照组(C)和参附治疗组(SF),各组按照观察时间点不同进一步分为3、6、12、24、72 h 5个亚组,每组均10只。HE染色光镜下观察脑组织病理变化;RT-PCR方法检测IRE1αmRNA的表达变化;Western blot方法检测IRE1α蛋白表达变化;流式细胞术检测神经元的凋亡率;结果:(1)RT-PCR:C组在HIBD后3、6、12、24 h时间点IRE1αmRNA表达量较S组升高(P<0.05);SF组各时间点IRE1αmRNA表达均较S组升高(P<0.05)。SF组在6、12、24、72 h时间点的IRE1αmRNA表达量较C组升高明显(P<0.05)。(2)Western blot:C组和SF组各时间点IRE1α蛋白表达量均较S组升高(P<0.05),SF组在6、12、24、72 h时间点的IRE1α蛋白表达量较C组升高明显(P<0.05)。(3)神经元的凋亡率:SF组各时间点的凋亡率均明显低于C组(P<0.05)。结论:参附注射液可能通过上调IER1α的表达,减少神经元凋亡来减轻新生大鼠缺氧缺血性脑损伤。     

β_1-肾上腺素受体自身抗体通过激活内质网应激诱导心肌细胞凋亡

目的:探讨内质网应激在β_1-肾上腺素受体自身抗体(β_1-AA)引起心肌细胞凋亡中的作用。方法:采用β_1-肾上腺素受体细胞外第二环抗原肽段主动免疫大鼠,应用SA-ELISA法检测大鼠血清中β_1-AA的水平,TUNEL染色检测心肌组织的凋亡水平,Western blot法和免疫组化法检测心肌组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及caspase-12的蛋白表达。利用亲和层析法纯化的β_1-AA处理H9c2心肌细胞,CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡;采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)预处理H9c2心肌细胞,再给予β_1-AA干预,CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞活力及凋亡的变化情况。结果:与对照组相比,主动免疫大鼠血清中β_1-AA水平在免疫2周时显著增加,进一步增加至8周,并且主动免疫2周大鼠心肌组织凋亡率明显升高,持续升高至8周。与对照组相比,主动免疫大鼠心肌组织中GRP78、CHOP及caspase-12的蛋白表达在免疫4周和8周时均明显增加。β_1-AA引起H9c2心肌细胞活力持续降低,凋亡明显增加。与β_1-AA单独处理组相比,内质网应激抑制剂4-PBA预处理H9c2心肌细胞可以有效逆转β_1-AA诱导的细胞凋亡增加和活力下降。结论:β_1-AA可以通过激活内质网应激诱导心肌细胞凋亡。     

腺相关病毒介导胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖诱导神经元凋亡的保护作用

目的 研究重组腺相关病毒(AAV)载体介导胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF Ⅰ)在体外神经元表达的情况,及其对高糖诱导神经元凋亡的保护作用.方法 利用分子克隆技术将大鼠IGF Ⅰ基因克隆到pSNAV2.0质粒上,构建包含重组质粒pSNAV2.0-IGF Ⅰ的杂合型重组AAV载体rAAV2/1-IGF Ⅰ.将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为正常组(A组)、无血清组(B组)、无血清高糖组(C组),无血清高糖+rAAV2/1-IGF Ⅰ组(D组),其中A组不做任何处理;B组使用无血清培养基培养;C组用含100mmol/L D-葡萄糖的无血清培养基培养;D组则先用rAAV2/1-IGF Ⅰ病毒载体感染后再用含100 mmol/LD-葡萄糖的无血清培养基处理.干预24 h后应用RT-PCR和Western免疫印迹检测各组IGF Ⅰ基因和蛋白的表达情况;应用Hoechst33342荧光染色法、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡.观察rAAV2/1-IGF Ⅰ感染后对高糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用.结果 成功构建rAAV2/1-IGF Ⅰ重组AAV载体.感染SH-SY5Y细胞后,RT-PCR显示SH-SY5Y能表达大鼠IGF Ⅰ基因;Western免疫印迹检测发现D组IGF Ⅰ蛋白的表达水平(0.44±0.04)显著高于其他3组(A组0.29±0.02,B组0.17+0.02,C组0.08±0.02,均P<0.05).rAAV2/1-IGF Ⅰ能明显降低高糖诱导细胞捌亡的凋亡率:Hoechst33342荧光染色检测总凋亡率分别为A组(2.71±1.03)%,B组(9.17±1.72)%,C组(25.63±1.81)%,D组(14.50±2.27)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪分析结果表明AnnexinV-FITC~+/PI~+的早期凋亡细胞加上AnnexinV-FITC~+/PI~+的晚期凋亡细胞的总细胞凋亡率A组为(5.01±1.17)%,B组为(9.87±1.38)%,C组为(27.56±2.25)%,D组为(17.34±2.08)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05).结论 rAAV2/1-IGF Ⅰ感染体外神经元SH-SY5Y细胞能显著表达IGF Ⅰ蛋白,并有效地降低高糖对神经元的诱导凋亡作用.