阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因的克隆和序列分析

目的　构建阴道毛滴虫铁氧还蛋白 (ferredoxin ,Fd)基因重组质粒 ,并进行克隆及序列分析。　方法　根据Fd基因已知序列 ,设计合成 1对引物 ,应用螯合树脂 (Chelex-100 )提取基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增出Fd基因 ,克隆入pMD-18T载体 ,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞 ,经PCR及酶切鉴定、测序。　结果　Fd基因体外扩增产物长度为 306 bp ,重组质粒经PCR及酶切鉴定结果表明获得正确重组子 ,测序结果表明其片段与已知序列吻合。　结论　克隆出阴道毛滴虫Fd基因。     

人硫氧还蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人硫氧还蛋白基因的重组真核表达载体。方法人硫氧还蛋白的cDNA克隆至pGEM-TEasy载体,经DNA测序证明后,将其克隆至真核表达载体pShttle构建重组pShttle-hTRX,pShttle-hTRX转染Hela细胞系进行瞬时表达,通过Westernblot、免疫组化、活性测定、酶切、PCR扩增等方法证实构建载体的正确性。结果构建携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体pShttle-hTRX,转染HeLa细胞后可检测到hTRX的转录和表达。结论正确构建了携带人硫氧还蛋白基因的真核表达载体,本结果可用于探讨硫氧还蛋白的生物学作用。     

人硫氧还蛋白基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人硫氧还蛋白(hTRX)cDNA序列,进行真核表达载体的构建.方法 应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中,经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定;利用阳性脂质体Lipofectamine将其转入COS-7细胞(瞬时表达细胞),RT-PCR检测其表达情况.结果 将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cya)和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确;COS-7细胞中有hTRX的表达.结论 成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,并在COS-7细胞中得到了表达,为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础.     

人硫氧还蛋白基因分子克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人硫氧还蛋白（hTRX）cDNA序列并进行真核表达载体的构建。方法应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中;经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定。结果将所得序列与GenBank（J04026）提供的序列比较,其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达

目的 构建弓形虫微线体蛋白( MIC3)的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白的功能奠定基础.方法 PCR法扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3.0,并转入DH5α 宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增法对重组质粒进行鉴定;应用HifectinⅡ真核细胞转染试剂将弓形虫PCDNA-MIC3真核表达质粒转染幼地鼠肾细胞(BHK),表达产物用SDS-PAGE进一步确认,ELISA法检测表达蛋白的免疫原性.结果 重组质粒PCDNA-MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120 bp大小相同的片段,PCDNA-MIC3能在BHK细胞中高效表达,表达产物能被弓形虫特异性血清所识别.结论 成功构建了弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA-MIC3.     

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒，并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术，构建pVAC-GRA4重组质粒；利用脂质体介导转染法，将该重组质粒导入HEK-293细胞，用RT—PCR法及Westem-blot法检测其表达情况；利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB／c小鼠体内细胞，测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFN-γ、IL-4含量，并观察攻毒试验后小鼠存活情况，以评价其免疫保护力。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段，成功构建重组表达质粒pVAC-GRA4；转染GRA4的HEK-293细胞，RT—PCR检测可见一条约987bp的目的条带，表达产物经Western—blot鉴定，其分子量约为41kD，能被特异性免疫血清所识别；经pVAC-GRA4免疫后的小鼠，其CD4^＋T细胞百分率无明显变化（P〉0．05），CD8^＋T细胞百分率明显增加（与pVAC对照组比较P〈0．05，与空白对照组比较P〈0．01）。CD4^＋／CD8^＋比值也较空白对照组明显降低（P〈0．01）；pVAC-GRA4免疫鼠IFN-γ的A值比对照组略高，但差异无显著性（P〉0．05）。IL-4A值各组间无明显变化（P〉0．05）；pVAC-GRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组，死亡小鼠的平均存活时间延长（与空白对照组比较P〈0．05）。结论构建的真核表达质粒pVAC-GRA4能在HEK-293细胞中和小鼠体内细胞中轰基．为弓形出癌苗的进一步研究打下基础．     

阴道毛滴虫沉默信息调节因子2同源基因的原核表达载体构建及表达

提取阴道毛滴虫（T.vaginalis）LX006细胞株传代培养细胞总RNA，RT-PCR扩增Tv-Sir2-like全长cDNA链，扩增产物连接到T-A克隆载体并转化大肠埃希菌（E.coli）JM109。提取重组克隆质粒，并用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ进行双酶切，将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-41b，并在E.coli BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果显示目的基因定向克隆于原核表达质粒pET-41b获得了表达重组子，IPTG诱导该原核表达载体在E.coli BL21中表达相对分子质量（Mr）约为59 000的重组融合蛋白，表达量占菌体总蛋白量的30%。     

HBV X 蛋白真核表达质粒的构建及其对反式转录激活作用的影响

目的　构建HBVX蛋白真核表达质粒并了解其对反式转录激活作用的影响。方法　用亚克隆方法构建HBVX蛋白真核表达质粒 ,以氯霉素乙酰转移酶转化率分析 (CAT试验 )揭示HBX蛋白的反式转录激活作用。结果　HBVX蛋白真核表达质粒转染HepaG2细胞后 ,以WesternBlot检测发现 2 μg、5 μg和 10 μg的 p5SGUTPLHBXDNA均能有效表达 ;CAT试验揭示 2 μg、5 μg、10μg的 p5SGUTPLHBXDNA对报道基因 pHE2×CAT的14 C -标记乙酰化氯霉素转化率分别为 (4 5 .5± 2 5 .9) %、(6 5 .6± 14.4) %和 (6 8.8± 19.7) %。结论　本结果为进一步研究HBVX蛋白的反式转录激活作用打下了基础     

弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4的构建

目的构建弓形虫抗原基因真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。方法根据弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因序列分别设计一对特异引物(分别含有HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ内切酶位点),PCR扩增目的基因,并将这两段基因分别克隆至PEGM-T Easy载体,经菌落PCR和双酶切鉴定;用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/XbaⅠ分别双酶切PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4和pVAX1,得到含内切酶位点的SAG1和SAG4基因片段,分别与pVAX1连接,构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4真核表达质粒,经菌落PCR和双酶切鉴定。结果PCR扩增得到目的基因SAG1和SAG4,测序结果分别与弓形虫RH标准株SAG1和SAG4基因比较,符合率均为100%。构建PEGM-T Easy-SAG1、PEGM-T Easy-SAG4克隆质粒和pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,分别经菌落PCR和双酶切鉴定,显示722bp的SAG1基因片段和511bp的SAG4基因片段均插入载体PEGM-T Easy和pVAX1中。结论成功克隆了pVAX1-SAG1、pVAX1-SAG4真核表达质粒,为弓形虫基因疫苗应用研究奠定了基础。     

HBx基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建重组HBx蛋白的真核表达载体pIRES2-AcGFP-HBx.方法 设计合成HBx基因的特异性PCR引物.PCR扩增获得HBx基因序列;将HBx基因序列克隆人T载体(pGEM-T-HBx);再用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切下目的片段,将其亚克隆人真核表达载体pIRES2-AcGFP;双酶切(Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ)和序列测定鉴定重组子;脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染入HepG2细胞,G418筛选得到稳定表达HBx的细胞克隆,Western blot检测HBx蛋白在转染细胞中的表达情况.结果 PCR扩增获得全长HBx基因序列;双酶切筛选得到阳性重组子,测序分析证实插入序列正确;转染plRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞,荧光显微镜可观察到GFP的表达,Western blot 证实表达HBx蛋白.结论 成功构建重组HBx基因真核表达载体,获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞株,为深入研究HBx蛋白的生物学功能提供实验条件.     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的 克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法 从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果 克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78.0%(39/50)。结论 构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。     

周期型马来丝虫CPI基因真核表达载体的构建和免疫学研究

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因真核表达载体pcDNA3.1-BmCPI,并观察其在小鼠体内的免疫应答反应。方法以周期型马来丝虫总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段。与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-BmCPI表达载体。将48只小鼠随机分为4组,每组12只,分别为健康对照组、空质粒组、pcDNA3.1-BmCPI组和pcDNA3.1-BmCPI/CpG组,分别注射PBS 100μl、空质粒pcDNA3.1 100μg、重组质粒pcDNA3.1-BmCPI100μg和重组质粒pcDNA3.1-BmCPI 100μg+佐剂CpG 30μg,采用左后腿胫前肌注射免疫。每2周1次,共3次,于末次免疫后第4周,用RT-PCR方法检测小鼠注射部位肌肉组织内目的基因转录情况。于末次免疫后第4和第6周,用噻唑蓝(MTT)法检测小鼠T淋巴细胞刺激增殖水平。于末次免疫后第2、4和6周,用ELISA法检测小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)水平。结果成功构建了...     

鼠白细胞介素3真核表达质粒的构建及鉴定

利用鼠白细胞介素3（IL－3）基因构建真核表达质粒,筛选获得的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序,证明小鼠IL－3基因正确克隆到pCDNA3真核表达载体上;将获得的真核表达质粒pCDNA3IL－3转化大肠杆菌细胞,增菌培养后大量提取pCDNA3IL－3质粒,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度,用于小鼠抗生育DNA疫苗在免疫小鼠模型的免疫增强佐剂。     

阴道毛滴虫RRas同源基因的克隆和序列分析

目的 克隆和分析阴道毛滴虫RRas同源基因，以探讨其在细胞内信号传导通路中的功能。 方法 从已构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离得到一个与人类RRas同源的cDNA克隆，用PCR扩增该cDNA克隆TvRRas相对应的基因组DNA，并对cDNA克隆及其对应的基因组DNA进行测序。利用BLASTP，RPS-BLAST和ClustalW等工具进行序列分析。 结果 TvRRas cDNA序列全长705对碱基，读码框含615对碱基，推测蛋白质序列具205个氨基酸。序列分析显示该基因的基因组DNA序列含有5′端ATG起始密码子和3′端的终止密码子，与cDNA序列完全一致，提示该基因无内含子；进一步分析表明该基因系RRas亚家族的同源基因，其氨基酸序列与人类和小鼠的RRas同源性最高（两者的一致性均为51%，相似性均为70%），同时拥有人类RRas基因高度保守的结合GTP的结构域和完全一致的效应结构域。进化树分析表明该基因与人类的RAS原癌蛋白基因分支及RRas分支聚类。 结论 获得了阴道毛滴虫RRas同源基因。     

阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因cap2037的克隆与表达

目的对阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因的克隆与原核表达。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板，根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TvV—T1序列设计一对引物，经RT—PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物，将其克隆到pMD-18T载体后测序，并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析，再将其克隆至表达载体pET28a。并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果目的基因片段长度为2037bp，与阴道毛滴虫病毒T1株（U08999）的同源性最高为82．9％，构建原核表达载体pET—Cap2037；IPTG诱导后，SDS—PAGE显示表达产物的大小约75kDa。结论成功克隆出阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因序列，与TVV—T1株序列有82．9％的同源性，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明，75kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达。     

脂联素球状结构域真核表达载体pcDNA3.0-gAd的构建

目的构建脂联素球状结构域(globular adiponectin,gAd)的真核表达载体,为研究gAd对糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的治疗奠定基础。方法从健康人全血中提取基因组DNA,PCR法获得脂联素球状结构域基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后与pcDNA3.0真核表达载体重组得到pcDNA3.0-gAd,分别用PCR法和DNA测序法鉴定pcDNA3.0-gAd。结果以从健康人全血中提取出的高纯度基因组DNA为模板,PCR扩增出gAd基因,真核载体pcDNA3.0经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与gAd基因进行体外重组,PCR法筛选出阳性克隆,DNA测序显示重组质粒pcDNA3.0-gAd的gAd基因与基因库中报道的脂联素基因序列(Gen-Bank:EU420013.1)中gAd序列完全一致,说明成功构建了pcDNA3.0-gAd,且序列正确。结论本研究为进一步从分子水平探究gAd基因和蛋白质的功能、深入探讨其生物作用机制创造了条件。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。     

乙型肝炎病毒preS1基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建含preS1基因真核表达质粒，探讨乙型肝炎病毒preS1基因在HBV入胞机制中的作用。方法：PCR法扩增含EcoR I与Pst I酶切点的preS1基因序列，PAS2-1载体及preS1基因PCR产物双酶切，经T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105，对重组质粒经序列测定，命名为PAS 2—1—preS1。经乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母茵AH109，Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒PAS2—1-preS1经序列测定合有完整的preS1基因片段，转入酵母后经Western Blot证实酵母细胞正确表达preS1-BD融合蛋白。结论：PAS2—1—preS1的构建为通过酵母双杂交体系筛选体内与preS1蛋白相互作用的preS1相关蛋白，为进一步深入探讨preS1在HBV致病机制中的作用奠定了基础。