hFAm92 A1在人宫颈癌细胞不同周期时相的表达

目的：探讨hFAm92A1在人宫颈癌HeLa细胞不同周期时相的表达差异。方法：常规培养Hela细胞,应用血清饥饿法将HeLa细胞同步化于G1期,胸腺嘧啶核苷双阻断法同步化于S、G2期,秋水仙素阻断法同步化于m期,应用流式细胞术检测同步化效率,应用RT-PCR方法检测hFAm92A1在人宫颈癌HeLa细胞不同周期时相的表达水平。结果：流式细胞仪检测细胞同步化效率G1期为77.5%、S期为85.5%、G2期为61.9%、m期为44%;FAm92A1基因在各期均有表达,但存在差异,以S期表达最高。结论：FAm92A1基因在HeLa细胞不同周期时相的表达有较大差异。     

血管平滑肌细胞不同细胞周期中Mfn2的表达变化

目的 探讨血管平滑肌细胞不同细胞周期中线粒体融合蛋白 2(mitofusin 2,Mfn2)表达水平的变化.方法 通过血清饥饿法、胸腺嘧啶核苷(thymidine)和诺考达唑(nocodazole)干预,使血管平滑肌同步化在不同的细胞周期(G0/G1期、G1/S期、S期、G2/M期);流式细胞仪鉴定细胞周期;Western blot检测Mfn2在不同细胞周期中的表达水平.结果 (1)流式细胞仪鉴定各组DNA含量百分比显示G0/G1期、G1/S期、S期、G2/M期均已同步化,符合本次实验要求.(2)Western blot示:同步化干预后,Mfn2在G0/G1期(静止期)的表达量显著高于G1/S期及S期(增殖期);自然状态下,Mfn2在G0/G1期表达量亦明显高于S期.结论 Mfn2表达量随细胞周期的变化而变化,Mfn2在细胞周期的静止期的表达量明显高于增殖期.     

多聚乙烯亚胺介导肿瘤细胞基因转染

目的:利用阳离子多聚物多聚乙烯亚胺(PEI)纳米凝胶将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)转入同步化的肿瘤细胞中并检测绿色荧光蛋白的表达率,探讨PEI作为载体介导肿瘤细胞基因转染中细胞周期对转染效率的影响?方法:通过6 MV X线照射及药物阻滞使Hela及A549细胞同步化,在5个PEI/DNA梯度比(2/2?4/2?6/2?8/2?10/2 ?滋g/?滋g)下利用PEI介导EGFP报告基因转染进入上述同步化细胞,流式细胞仪和荧光显微镜下测定绿色荧光蛋白表达率,通过梯度试验分析细胞周期时相与表达率之间的关系?结果:在不同增殖状态及PEI/DNA比值梯度下,一定剂量-时间的X射线和顺铂可以使Hela细胞同步化于S期,一定剂量-时间的艾素可以使A549细胞同步化于G2/M期,而血清饥饿法培养则可以使细胞阻滞于G0/G1期,在不同细胞周期时相下EGFP的转染效率不同,两种同步化细胞均表现出S期及G2/M期细胞的转染率显著高于对照组(P < 0.05)和G0/G1期细胞(P < 0.0001)?结论:PEI导入基因的表达效率受细胞周期制约,PEI介导的基因转染受到宿主细胞摄取?转运入核及转录能力的影响,而该进程都是细胞周期依赖性的?     

Cyclin B1的启动子在HeLa细胞cyclin B1蛋白调控中的作用

目的 通过检测细胞周期素B1(cyelin B1)的启动子在HeLa细胞的不同细胞周期的活性变化,探讨其对cyclin B1蛋白的调味控作用.方法 采用PCR法获得HeLa细胞cyclin B1的启动子,通过基因重组插人pGL3 promoter vector 从而获得质粒pGL3/cyelin B1 promoter.采用羟基脲(hydroxyurea,HU)对HeLa细胞进行细胞周期G_1、S、G_2/M期的同步化,通过流式细胞术法确认.用短暂转染的方法,将重组的质粒转染至HeLa细胞.通过双萤光素酶活性检测分析cyelin B1的启动子在HeLa细胞周期G_1、S、G_2/M期的活性的变化.结果 双荧光素酶活性检测cyelin B1的启动子活性在G_1期最高,S期最低,G_2期中等.结论 在HeLa细胞巾cyclin B1的启动子活性和cyclin B1蛋的的表达并不同步.     

过氧化氢诱导同步化HepG2细胞DNA损伤和凋亡的敏感时相研究

目的:探讨过氧化氢(H2O2)诱导HepG2细胞的DNA损伤和凋亡效应在细胞周期不同时相的敏感性.方法:利用胸腺嘧啶核苷(TdR)阻断肝癌HepG2细胞于G1期末后,去除胸苷,培养不同时间,分别得到同步化的G1期、S期和G2/M期细胞,150 μmol/L的H2O2处理12 h,采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)测定细胞的DNA损伤;将各期细胞用200 μmol/L的H2O2处理,采用流式细胞术测定细胞凋亡.同时实验设立未同步化和正常对照组.结果:①分别获得 88.6%的G1期细胞、78.1%的S期细胞、66.8%的G2/M期细胞.② SCGE结果显示,同步化于S期和G2/M期细胞的DNA尾长明显增长,尾部DNA百分比含量和尾矩明显增加,其中S期细胞效应最为显著.③凋亡检测结果显示,同步化各组细胞的凋亡率明显高于未同步化组,以S期最为显著.结论:H2O2诱导HepG2细胞DNA损伤和细胞凋亡在细胞周期的不同时相效应敏感性不同,主要诱导S期细胞的DNA损伤和凋亡.     

高温阻滞HeLa细胞于G1期并引起G1期细胞凋亡

目的探讨高温阻滞HeLa细胞周期进程及其与细胞凋亡的关系。方法HeLa细胞经培养增殖后分为37℃、40℃、43℃和45℃共4个温度组。每组分别在0．5、1、2和4h共4个时间点取材，经PI染色在流式细胞仪上检测4种温度条件下，4个时间段时HeLa细胞的凋亡指数和在各细胞周期时相中的指数。结果37℃时，60％的细胞处于G，期，S期及Gz／M期的HeLa细胞分别为17％和18％，约5％细胞凋亡。40℃时，细胞周期受到抑制，G1期的HeLa细胞明显增加，达73％，S及G2／M期的细胞分别为9％和15％，凋亡细胞占3％。43℃时，不但细胞周期受阻，而且凋亡细胞极明显地增加，达19％，G1期细胞为61％，S期细胞为9％，G2／M期细胞为11％。45℃时，细胞凋亡数和在细胞周期各时相的细胞数与40℃时的分布相似。结论温度升至40℃时对HeLa细胞的增殖活动有明显的抑制，使HeLa细胞滞留于G1期。43℃时除了细胞周期受抑制外，凋亡细胞明显增加，这可能是由于细胞周期受阻和高温启动了凋亡机制而诱发了细胞凋亡，凋亡的细胞主要为G1期的细胞。45℃以上的高温对HeLa细胞的杀伤失去对周期时相的选择性，均等地杀伤细胞周期各时相的细胞。     

羟基脲对体外Hela细胞周期同步化作用的研究

目的 探讨利用羟基脲(HU)对Hela细胞进行细胞周期同步化.方法 培养Hela细胞,采用Hu处理Hela细胞24 h,然后除去HU,让Hela细胞进入细胞周期G1、S、G2/M期,通过流式细胞术确认.结果 流式细胞仪检测证实Hela细胞在HU祛除后3.5 h处于S期,8.5 h处于G2/M期,18 h处于G1期.结论 HU处理可以有效地将Hela细胞同步化于特定的细胞周期,而且方法简单,易于操作.     

人VIGILIN参与调控肝癌细胞H19和IGF2印记基因表达的研究

目的 探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因H19和胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的调控.方法 通过流式细胞术检测人肝癌细胞HepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检测各周期点VIGILIN、H19、IGF2基因表达.结果 ① HepG2细胞周期约为20 h;其中0～9 h、20～28 h约为S期,9～20 h、28～39 h约为G2/M、G1期,并选定6 h、20 h、43 h、60 h,分别代表S期中期、G1～S期、S期中期和G1期末; ②细胞周期同步化后加入血清,刺激VIGILIN转录,上调VIGILIN的表达,从G2/M至G1期,逐渐增加,G1期末达高峰,S期逐渐减少;与之相反,H19的表达,在S期逐渐增加,在G2/MG1期逐渐减少,在S期中期达到高峰.而IGF2的表达也增加但没有明显的周期性.H19与VIGILIN mRNA表达呈负相关(r=-0.6941,P<0.05).③用VIGILIN shRNA(pSIREN-VIG shRNA)重组载体转染HepG2细胞48 h后,相对于3个对照组(未转染组, 脂质体转染组和转染pSIREN-GFP shRNA组), 实验组VIGILIN mRNA的表达受到明显抑制,此时,IGF2 mRNA表达增加30.13%,H19 mRNA表达减少12.08%.结论 VIGILIN和H19 mRNA表达与细胞周期有关;VIGILIN参与调控H19、IGF2印记基因的表达.     

As2O3诱导NB4细胞凋亡的周期选择性与活性氧水平相关

目的研究三氧化二砷(As2O3)诱导NB4细胞凋亡的周期选择性与细胞活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)水平的关系.方法以碘化丙啶(PI)标记DNA,流式细胞仪检测As2O3单独或联用二甲萘醌(DMNQ)作用后细胞周期的变化,以7-氨基放线菌素D(7AAD)标记DNA,双氢罗丹明123(DHR)或双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)捕获ROS,流式细胞仪双参数法检测细胞周期不同阶段ROS水平.结果 2μmol/L As2O3可选择性诱导NB4 G2/M期细胞凋亡,DMNQ可增强这一效应;G2/M期细胞ROS水平明显高于G1、S期.结论As2O3诱导NB4 G2/M期细胞凋亡与G2/M期ROS水平较高相关.As2O3诱导NB4细胞凋亡的周期选择性与细胞ROS水平有关.     

多药耐药基因MDR1表达与肝癌细胞周期的关系

目的探讨多药耐药基因MDR1表迭与耐药肝癌细胞株SMMC7721细胞周期的关系。方法血清饥饿法,药物双阻断法和分裂中期阻断摇落法同步化细胞;RT—PCR检测MDR1mRNA的表达。结果3种细胞同步化方法可分别得到高度同步化的G0／G1期．S期,G2／M期细胞IMDR1在SMMC7721细胞S期有表达,而在G0／G1和G2／M期无表达。结论S期MDR1基因的表达可能在肿瘤多药耐药出现的早期发挥了重要作用。     

PTTG ESP1在A549 SPC-A-1细胞株S G2/M期的表达

目的探讨PTTG(pituitary tumortransforming gene)、ESP1(estradiol-stimulated protein 1)在A549、SPC-A-1细胞S、G/M期的表达.方法用双胸苷同步化法同步化A549、SPC-A-1细胞及MRC-5细胞,分别收集S、G2/M期总RNA,做Realtime PCR.结果PTTG在A549细胞和SPC-A-1细胞的S期表达比G2/M期表达高,在MRC-5细胞的在S、G2/M期中P1TG均无表达;ESP1在A549细胞与SPC-A-1细胞及MRC-5细胞的S期表达均比G2/M期表达低.结论PTTG在MRC-5的S、G2/M期都无表达,在A549、SPC-A-1的S期比G2/M期表达增高,提示肿瘤细胞的染色体非整倍体与PTTG的表达增高有关;ESP1在MRC-5和A549、SPC-A-1的S期比G2/M期表达低,说明细胞中姐妹染色体的分离主要依靠于ESP1在G2/M期被激活,而导致姐妹染色体的分离.     

TRF1 219位磷酸化在细胞周期调控中的作用研究

目的:研究端粒结合因子-1(TRF1)丝氨酸219位磷酸化对细胞周期的影响。方法:突变TRF1的219位氨基酸,构建模拟磷酸化和非磷酸化状态的突变体TRF1S219D-GFP和TRF1S219A-GFP,核苷酸测序和免疫印迹验证目的基因序列及蛋白表达。将野生型和突变体质粒用脂质体转染法转入H eLa细胞,观察它们在细胞中的定位、流式细胞仪检测各细胞周期的细胞数量、免疫印迹检测转染后ATM蛋白水平的改变。结果:测序证实突变成功,GFP抗体免疫印迹证实了突变体的蛋白表达。荧光显微镜下观察到TRF1S219A-GFP和TRF1S219D-GFP均呈点状定位于细胞端粒。流式细胞仪结果显示,过表达野生型和非磷酸化突变体的H eLa细胞产生G 2/M期的阻滞(P<0.05)。转染野生型和突变体后H eLa细胞中ATM蛋白含量均比对照组增高。结论:ATM激酶对TRF1丝氨酸219位的磷酸化可以抑制由于TRF1过量表达而引起的细胞周期G 2/M期的阻滞。     

照射和加温对Hela S3细胞周期及DNA含量的影响

用流式细胞分析和图象分析技术,测定照射和加温后HeLa S_3细胞周期及DNA含量的变化。结果表明照射后HeLa S_3细胞DNA含量增加,照射及加温后HeLa S_3细胞出现G_2+M期延搁现象,提示DNA含量增加是G_2+M期延搁的结果。G_2+M期显著延搁时,细胞克隆源性存活率亦明显降低,X线照射细胞存活低于1％,加温处理细胞存活低于2.65％,提示G_2+M延搁现象不仅是细胞周期受阻的结果,也是细胞严重杀伤的后果。本实验证实,流式细胞分析和图象分析技术是快速测定受照和加温细胞反应的有效手段。     

Flow cytometry for analyzing changes in irradiated and heated HeLa S3 cells.

In the present study, we have compared the distribution in various phases, DNA content, cell survival and ultrastructure of HeLa S3 cells after irradiation and/or hyperthermia. After 220 KV X-ray irradiation, the Do of the survival curve was 0.94 Gy, Dq was 1.3 Gy, and N was 4.26. After Ir-192 gamma-ray irradiation, the Do of the survival curve was 2.26 Gy, Dq was 3.9 Gy, and N was 5.7. The Do of the survival curve of HeLa S3 cells after treatment at 43.5 degrees C and 44 degrees C was 2.2 min and 1.6 min, respectively. Ultrastructural changes were also observed. The marked increase of the DNA content after 6 Gy irradiation corresponded with changes of distribution in various phases, which indicated a delay in the G2 + M phase. The survival fraction after 6 Gy irradiation was less than 1%. The changes of cell cycle distribution after Ir-192 irradiation were similar to those seen after X-ray exposure. The delay of G2 + M phase after hyperthermia was dose-dependent. An obvious delay of the G2 + M phases was also observed at 24 h after treatment with X-rays plus hyperthermia.     

用7-AAD检测细胞DNA含量的流式细胞技术

目的：探索利用荧光染料7～AAD检测细胞DNA含量的流式细胞技术。方法：利用7一AAD和PI两种荧光染料标记小鼠胸腺T淋巴细胞通过流式细胞仪检测其G0／G1期、S期和G2／M期的DNA含量,比较2种方法测定结果。结果：通过流式细胞仪对细胞周期进行分析显示：用7一AAD和PI两种荧光染料标记的小鼠胸腺T淋巴细胞呈现完整的细胞周期,G0／G1期细胞含量为73．2％±1．93％、73．9％±1．79％,S期细胞含量为23．6％±1．04％、22．6％±1．50％,G2／M期细胞含量为3．2％±0．28％、3．5％±0.21％,两种标记方法测定结果基本一致。结论：本文探讨的7-AAD染色检测DNA含量法与常用的PI标记法相比较结论一致,且操作上更为简单快捷,是—种值得推广的DNA周期分析染色方法。     

siRNA-FAM92A1-289对HeLa细胞增殖的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)沉默基因FAM92A1-289对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法:化学合成法合成小干扰RNA(siRNA),阳离子脂质体转染FAM92A1-289 HeLa细胞;实时定量RT-PCR检测其mRNA表达,MTT法和流式细胞仪检测转染后HeLa细胞增殖、细胞周期和凋亡变化。结果:转染合成FAM92A1-289 siRNA后,HeLa细胞中FAM92A1-289 mRNA表达下降(P<0.01),细胞增殖均明显增强(P<0.01);细胞周期分布改变,S期细胞明显增多,而G2/M期细胞减少,凋亡率无变化。结论:FAM92A1-289基因调节细胞增殖活动。     

人端粒结合因子在端粒酶阳性和阴性细胞中的定位与周期性表达的研究

目的:研究人端粒结合因子1(telomere repeat binding factor 1,TRF1)在端粒酶阳性和阴性细胞中的定位以及在细胞周期中的表达.方法:应用分子克隆技术扩增TRF1基因全长(TRF1FL)和N、C端缺失突变体(TRF1ΔNC)序列,并克隆入pEGFP-C2真核表达载体,表达绿色荧光(GFP)融合蛋白;将含目的基因质粒转染端粒酶阳性Hela细胞和端粒酶阴性WI38-2RA细胞,Western Blot验证目的蛋白分子量,荧光显微镜观察TRF1在间期细胞和染色体的定位;利用药物阻断HeLa细胞于不同周期,流式细胞仪检测细胞周期,半定量Western Blot检测TRF1在不同细胞周期中的表达.结果:TRF1FL、TRF1ΔNC序列长度分别为1.3 kb和0.9 kb;GFP融合TRF1FL、TRF1ΔNC分子量大小分别为80 kD和60 kD.TRF1FL在间期细胞胞核内呈点状表达,在染色体则表达于染色体未端,TRF1ΔNC在细胞核内呈弥散性表达;TRF1在端粒酶阴性细胞中与早幼粒细胞白血病小体(promyelocytic leukemia body,PML)共定位,在端粒阳性细胞中则没有共定位.TRF1在HeLa细胞中以M期表达量最高,G1/S表达最低,M期表达量是G1/S期的3.9倍(t=12.92,P<0.01).结论:TRF1在端粒酶阳性和阴性细胞中有不同的定位模式,在HeLa细胞中TRF1呈周期性表达.     

Genistein抑制Livin基因对恶性黑色素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响

目的观察genistein抑制Livin基因对恶性黑色素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响。方法应用RT-PCR检测不同浓度genistein作用LiBr细胞48 h后Livin的表达变化;取最适浓度的genistein作用LiBr细胞后应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用Western blot检测其对凋亡效应蛋白Ccaspase-3表达的影响及应用MTT比色法检测其对细胞增殖的作用。结果 Genistein可增加LiBr细胞早、晚期凋亡率[分别为(27.87±5.38)%和(11.87±3.86)%],诱导LiBr细胞凋亡(P<0.01);引起细胞G0/G1期阻滞[G0/G1=(72.11±5.89)%、S=(14.53±3.47)%、G2/M=(12.36±2.64)%];下调caspase-3蛋白表达及抑制细胞增殖(P<0.01)。结论 Genistein可诱导LiBr细胞凋亡、使细胞增殖周期进展受阻、抑制细胞增殖。