过表达Sox2基因可增强人骨髓干细胞向神经元分化（英文）

目的:研究Sox2对于人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经元跨分化能力的影响。方法:利用Western Blot检测hBMSCs中Sox2、Oct4和c-Myc的表达,将携带Sox2和rhGFP编码序列的Tet-On慢病毒感染hBMSCs,通过多西环素(Dox)处理10 d诱导Sox2和rhGFP表达;利用神经诱导培养基诱导感染慢病毒的hBMSCs分化,通过免疫荧光染色技术检测神经元标记物Tuj1的表达;利用Western Blot技术检测Smad 2/3信号通路蛋白在hBMSCs向神经元分化过程中的表达水平。结果:Western Blot结果显示hBMSCs不仅表达Sox2和Oct4,同时还表达c-Myc;光镜下发现Sox2的过表达促进hBMSCs的形态向神经元样细胞转化,同时通过免疫荧光染色发现Tuj1的表达水平增加; Western Blot证实Sox2基因过表达引起hBMSCs中磷酸化Smad 2/3的表达水平降低。结论:Sox2可通过Smad 2/3信号通路增强人骨髓间充质干细胞向神经元分化。     

无血清悬浮分离培养法分离、培养、鉴定脊髓源性神经干细胞

背景：目前临床上尚未发现完全治愈脊髓损伤,使其达到结构及功能恢复的治疗方法。已有的神经营养因子治疗方法促进神经细胞再生的效果有限,而干细胞移植治疗可能是现阶段修复脊髓损伤的有效方法之一。 目的：无血清悬浮分离培养法培养胎鼠脊髓源性神经干细胞,采用形态学、免疫荧光技术和多向分化能力进行神经干细胞鉴定。 方法：应用悬浮分离培养法,培养纯化孕13.5 d C57BL/6胎鼠的脊髓源性神经干细胞。倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8法检测细胞的增殖能力。免疫荧光技术检测Nestin和Sox2表达;使用自然分化法验证第4代脊髓源性神经干细胞多向分化特性,明确其分化能力。 结果与结论：采用无血清悬浮分离培养法可以顺利获取脊髓源性神经干细胞。培养的脊髓源性神经干细胞增殖活性良好,高表达Nestin和Sox2,且两种标记物与DAPI核染高度均匀吻合,说明细胞纯度高。进一步诱导分化显示,细胞可以向GFAP和Tuj1阳性细胞分化,证明脊髓源性神经干细胞分化潜能较好。该实验可建立一套体外培养脊髓源性神经干细胞分离、培养、纯化及鉴定体系,为后续神经干细胞的应用研究奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程      

小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为神经元的体外实验研究*

 目的： 探讨源于小鼠的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）体外定向分化为神经元的方法,为大量稳定地获得神经元及提供种子细胞治疗脊髓损伤奠定体外实验基础。方法: 源于小鼠的iPSCs在不同的诱导培养基中经悬浮、贴壁、再悬浮和再贴壁培养。免疫荧光检测iPSCs多能性标志物、神经干细胞及其分化细胞标志物的表达。RT-PCR检测神经元及胶质细胞基因表达并行神经元基因测序鉴定,流式细胞术检测iPSCs定向分化为神经干细胞及进一步分化为神经元的比例。结果: 源于小鼠的iPSCs表达干细胞多能性标志物Sox2、Oct4和SSEA1。悬浮培养可以形成类球形拟胚体;经诱导及机械分离后的细胞可形成神经球,神经球经诱导后可分化为神经元。免疫荧光显示iPSCs可诱导出表达nestin的神经球,贴壁培养的神经球可分化为分别表达微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）及髓磷脂碱性蛋白(MBP)的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。RT-PCR及基因鉴定结果显示形成小鼠神经元;流式细胞术检测结果显示分化细胞中神经干细胞和神经元的比例分别为63.93%±1.47%和21.40%±1.70%。结论: 源于小鼠的诱导多能干细胞能够稳定地在体外定向分化为神经元,为脊髓损伤的治疗提供了一个可靠的细胞来源。     

S100A4促进脑源性神经营养因子表达影响神经干细胞的分化

文题释义：神经干细胞电穿孔：即通过高强度的电场作用,瞬时提高细胞膜的通透性,从而吸收周围介质中外源分子的方法进行转染,通过研究发现在230 V、350 μF条件进行电转染效率较高,可以在后续实验中采用。 神经干细胞成神经诱导分化：神经干细胞是一类多能干细胞,可以向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化。脊髓损伤部位常常表现为瘢痕愈合,难以恢复脊髓的正常生理功能,通过提高神经干细胞向神经元分化的比例,尽可能减少其向胶质细胞分化,进而减少损伤部位瘢痕的形成,对于治疗脊髓损伤、恢复脊髓生理功能具有重要的临床意义。 背景：如何促进神经干细胞大量向神经元分化是研究的难点。研究发现,S100A4 蛋白可能通过多种途径在中枢神经系统修复中发挥作用。 目的：研究S100A4是否通过上调脑源性神经营养因子表达进而影响神经干细胞向神经元样细胞的分化。 方法：购买鉴定合格的小鼠胚胎大脑海马和室管膜下区来源的神经干细胞,体外培养传代,电穿孔法向神经干细胞中转染S100A4表达载体和/或脑源性神经营养因子siRNA,转染48 h后向神经元方向诱导分化,诱导分化3 d后采用Western blot检测细胞中脑源性神经营养因子及Tuj1蛋白表达,免疫荧光检测Tuj1阳性神经元比例。 结果与结论：①与转染无关序列质粒组比较,转染S100A4组神经干细胞中Tuj1阳性细胞比例及相应的Tuj1、脑源性神经营养因子的表达量显著增高(P < 0.01);②与S100A4+siRNA无关序列共转染组比较,S100A4+脑源性神经营养因子siRNA共转染组神经干细胞中Tuj1阳性细胞比例及相应的Tuj1、脑源性神经生长因子的表达量显著降低(P < 0.01);③结果表明,S100A4的过表达可促进神经干细胞向神经元样细胞分化,其可能通过脑源性神经营养因子发挥作用。 ORCID: 0000-0002-1131-3497(杜晓文) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

类胚体诱导脐带间充质干细胞向生殖细胞的分化

背景：脐带间充质干细胞能否在体外和体内微环境条件下衍生为卵母细胞,对女性生殖的维持及卵母细胞的再生均具有十分重要的意义。 目的：进一步验证体外微环境类胚体对脐带间充质干细胞向生殖细胞分化的影响。 方法：将脐带间充质干细胞进行悬滴培养,使其形成类胚体,进而采用将类胚体与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养、卵泡液条件培养基培养等方法,体外诱导脐带间充质干细胞向早期生殖细胞分化。 结果与结论：①将脐带间充质干细胞进行悬滴培养,其能够形成类胚体。②流式细胞仪检测结果：类胚体形成5 d后,其中SSEA-1阳性细胞占15.61%。③免疫组织化学检测结果：形成5 d的类胚体与人或小鼠的卵巢颗粒细胞共培养,10 d后生殖系标记物SCP3、生长分化因子9阳性表达,而颗粒细胞及采用卵泡液培养的类胚体均无表达。结果表明,脐带间充质干细胞体外悬滴培养可形成类胚体,与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养后均表达生殖系特异性标记物。     

人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的方法探讨

目的:探讨人诱导性多能干细胞(iPS细胞)体外定向分化为神经干细胞(NSCs)的方法。方法:人iPS细胞悬浮培养4 d形成的拟胚体(EB)经维甲酸(RA)诱导4 d,诱导后的EB在无血清培养基中筛选并扩增培养。倒置显微镜下观察诱导后细胞的形态变化,RT-PCR检测iPS细胞多能性基因Nanog、Oct4和Sox2的表达,免疫荧光法检测NSCs特异性标志物Nestin、神经元标志物β-tubulinⅢ和神经胶质细胞标志物GFAP的表达。结果:(1)人iPS细胞在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性基因Nanog、Oct4和Sox2,去除饲养层后悬浮培养能形成球形EB;(2)经RA诱导后的EB在无血清培养基中筛选培养第1 d贴壁生长,周围爬出细胞;第3 d,在高倍镜下可见中央聚集的细胞呈环形的rosette结构,rosette结构增多到第7 d达高峰。对照组未观察到rosette结构。随后大部分rosette细胞脱离瓶壁悬浮生长,形成神经球样克隆。免疫荧光显示神经球呈nestin阳性表达。贴壁培养的神经球能分化成β-tubulinШ和GFAP阳性细胞。结论:RA诱导结合无血清培养基筛选法能诱导iPS细胞高效分化为NSCs。     

颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定

目的:研究颅脑手术患者废弃脑组织中神经干细胞的培养与鉴定,为立体定向自体神经干细胞移植治疗脑出血、脑梗塞及颅脑损伤后遗症提供临床前基础。方法:通过改进原代培养方法,从颅脑手术患者废弃脑组织中培养和鉴定神经干细胞(NSCs)。收集颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织各约500 mg以上,按改良方法进行原代培养并传代,通过免疫荧光检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达,传代培养5代时开始进行诱导分化。结果:培养约3～10 d后,多数患者废弃脑组织中均可见干细胞球生长,经Nestin免疫荧光检测均呈阳性表达。选取第6代诱导分化后的贴壁细胞分别经β-Tubulin(神经元标志物)、Sox10(少突胶质细胞标志物)与GFAP(星形胶质细胞标志物)免疫荧光检测,可见少量神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞阳性表达。取第3代与第6代细胞行免疫印迹鉴定,第3代细胞仅见Nestin与少量β-Tubulin表达,第6代细胞可见不同程度的Nestin、β-Tubulin、Sox10及GFAP等表达。结论:本研究成功从颅脑手术患者不同脑区废弃脑组织中分离培养获得成人NSCs,并可向神经元及神经胶质细胞分化,使立体定向自体神经干细胞移植促进神经功能修复从实验室到临床应用成为可能。     

多模态影像分子体外验证触液神经元的神经干细胞特性

背景：最近研究发现位于脊髓中央管附近的接触脑脊液神经元(简称触液神经元)具有神经干细胞潜能,但触液神经元在体外研究中纯度不高,且目前尚无体外示踪技术证明其神经干细胞特性。目的：通过多模态影像分子筛选并在体外验证触液神经元的神经干细胞特性。方法：根据触液神经元特异性表达Pkd2l1基因,针对Pkd2l1基因上游启动子设计一种使触液神经元特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)的多模态影像分子慢病毒(Lentivirus-Pkd2l1-GFP-puromycin-luciferase)。从出生24 h内C57BL/6小鼠延髓组织中提取出原代神经干细胞贴壁培养,用多模态影像分子病毒转染含有触液神经元的原代神经干细胞,通过嘌呤霉素筛选并纯化触液神经元。对筛选纯化的触液神经元进行体外悬浮培养并连续传代4代以上,免疫荧光检测第3代触液神经元与神经干细胞标记物Nestin、Sox2共表达情况。通过对第3代触液神经元诱导分化培养,免疫荧光检测触液神经元与神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物S100β、少突胶质细胞标记物O4的共表达情况。结果与结论：成功构建出多模态影像分子慢病毒,并且筛选纯化后的触液神经元...     

人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化

探讨从人胚脑分离培养的神经干细胞在增殖和分化方面的生物学特点。用无血清培养技术从 4月龄人胎中脑组织中分离培养出神经干细胞 ,用有限稀释法获得单细胞克隆球 ,消化后用含 Brd U的培养液培养 ,待形成神经干细胞球后 ,进行 Brd U和nestin免疫荧光检测。取第 4代神经干细胞球用含 10 % FBS的培养液诱导分化 ,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物 MAP-2、GFAP和 CNP免疫荧光检测。结果显示 ,单细胞悬液培养 2周后可形成神经干细胞球 ;神经球 Br-d U和 nestin免疫荧光检测均呈阳性 ;神经干细胞分化后呈 MAP-2、GFAP和 CNP阳性的三种类型细胞 ,但分化的神经元数量较少、胞体较小、突起较少。提示从人胚中脑组织中分离得到的神经干细胞具有增殖和自我更新能力 ,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能 ;与啮齿类动物相比 ,人神经干细胞增殖速度较慢 ,分化的神经元较少且稍欠成熟     

Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为神经干细胞

目的:探讨Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)直接重编程为神经干细胞的方法,为诱导神经干细胞(induced neural stem cells,i NSCs)作为种子细胞治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)奠定实验基础。方法:逆转录病毒感染Sox2转录因子的MEFs在神经干细胞培养基中贴壁培养10 d。随后,悬浮、贴壁反复循环培养3次。Real-time PCR检测神经干细胞标志基因和多潜能标志基因的表达。i NSCs在分化培养基中贴壁培养7~14 d,免疫荧光分别检测神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。将i NSCs显微注射至小鼠大脑皮质,7~14 d后免疫荧光检测神经细胞标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。结果:Real-time PCR显示i NSCs的多种神经干细胞标志基因nestin、Blbp、Pax6和zbtb16表达较诱导前显著增高(P0.05),且i NSCs不表达多潜能相关基因Nanog、Oct4和zfp42。免疫荧光显示i NSCs高表达神经干细胞标志物nestin。免疫荧光同时表明i NSCs可在体内外存活并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:Sox2可以诱导MEFs直接重编程为神经干细胞。i NSCs具有自我更新的能力,且在体内外都具有三向分化潜能,可作为修复SCI合适的种子细胞。     

Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid: a new source for stem cell research?

BACKGROUND: It is the hope of investigators and patients alike that in future the isolation of pluripotent human stem cells will allow the establishment of therapeutic concepts for a wide variety of diseases. A major aim in this respect is the identification of new sources for pluripotent stem cells. Oct-4 is a marker for pluripotent human stem cells so far known to be expressed in embryonal carcinoma cells, embryonic stem cells and embryonic germ cells. METHODS: Cells from human amniotic fluid samples were analysed for mRNA expression of Oct-4, stem cell factor, vimentin and alkaline phosphatase via RT-PCR. Oct-4 protein expression was investigated by Western blot analysis and immunocytochemistry. Oct-4-positive cells were also analysed for the expression of cyclin A protein via double immunostaining. RESULTS: Performing RT-PCR, Western blot and immunocytochemical analyses revealed that in human amniotic fluid in the background of Oct-4-negative cells a distinct population of cells can be found, which express Oct-4 in the nucleus. Oct-4-positive amniotic fluid cell samples also express stem cell factor, vimentin and alkaline phosphatase mRNA. The Oct-4-positive amniotic fluid cells are actively dividing, proven by the detection of cyclin A expression. CONCLUSIONS: The results presented here suggest that human amniotic fluid may represent a new source for the isolation of human Oct-4-positive stem cells without raising the ethical concerns associated with human embryonic research.     

Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol

BACKGROUND: The aim of this study was to isolate mesenchymal stem cells (MSCs) from amniotic fluid obtained by second-trimester amniocentesis. METHODS: A novel two-stage culture protocol for culturing MSCs was developed. Flow cytometry, RT-PCR and immunocytochemistry were used to analyse the phenotypic characteristics of the cultured MSCs. Von Kossa, Oil Red O and TuJ-1 stainings were used to assess the differentiation potentials of MSCs. RESULTS: Amniotic fluid-derived MSCs (AFMSCs) were successfully isolated, cultured and enriched without interfering with the routine process of fetal karyotyping. Flow cytometry analyses showed that they were positive for SH2, SH3, SH4, CD29, CD44 and HLA-ABC (MHC class I), low positive for CD90 and CD105, but negative for CD10, CD11b, CD14, CD34, CD117, HLA-DR, DP, DQ (MHC class II) and EMA. Importantly, a subpopulation of Oct-4-positive cells was detectable in our cultured AFMSCs. Under specific culture conditions, AFMSCs could be induced to differentiate into adipocytes, osteocytes and neuronal cells. CONCLUSIONS: We demonstrate that human multipotent MSCs are present in second-trimester amniotic fluid. Considering the great potential of cellular therapy using fetal stem cells and the feasibility of intrauterine fetal tissue engineering, amniotic fluid may provide an excellent alternative source for investigation of human MSCs.     

大鼠羊膜上皮细胞体外诱导可分化为类神经干细胞

背景：以往研究发现修复神经损伤的细胞来源主要有许旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、激活的巨噬细胞等,但这些细胞存在着来源困难、有成瘤性、异体排斥等缺点。而羊膜上皮细胞不存在以上缺陷,且具有多向分化潜能,经诱导后可向心肌样细胞、神经干细胞、肝细胞、成骨和软骨细胞等分化。 目的：体外培养大鼠羊膜上皮细胞,并诱导其向类神经干细胞方向分化。 方法：取妊娠晚期大鼠,采用胰酶消化法获得羊膜上皮细胞,用无血清的神经干细胞条件培养基对细胞进行诱导分化,并用免疫细胞化学法和RT-PCR对诱导前后的细胞相关标志物进行鉴定。 结果与结论：形态学观察结果显示,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,这些突起可交织成网状,细胞贴壁牢靠。免疫细胞化学检测结果显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白荧光强度较强,而特异性胚胎抗原4、波形蛋白荧光强度较弱。RT-PCR检测显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞的巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白mRNA的表达增强,而平滑肌22α、Sox-2及Nanog mRNA的表达减弱。说明体外诱导的大鼠羊膜上皮细胞可成功分化为类神经干细胞。     

CARM1维持羊水干细胞干性的机制

BACKGROUND:Studies have shown that methylation modification using CARM1-catalyzed histone H3R17/R26 can maintain the stemness of embryonic stem cells. However, mechanism underlying CARM1 effect on the stemness of amniotic fluid-derived stem cells is still unclear. OBJECTIVE:To investigate the function and underlying molecular mechanism of CARM1 to maintain stemness in the amniotic fluid-derived stem cells. METHODS:Amniotic fluid-derived stem cells from term pregnancy were isolated and cultured. RT-PCR was used to identify the stem cell mark and CARM1 gene expression. CARM1 expression in amniotic fluid-derived stem cells was knocked down by using two shRNA. RT-qPCR was used to detect the silencing efficiency, and western blot employed to examine the methylation level of Arginines 17 at N terminus of histone 3 (H3mR17). Moreover, the expression of embryonic stem cell markers, including OCT4, SOX2 and NANOG, were detected. RESULTS AND CONCLUSION:Amniotic fluid-derived stem cells from term pregnancy could express CARM1 and stem cell markers, including OCT4, SOX2, Nanog and KLF4. Both of the shRNAs could knock down the expression of CARM1 efficiently. When CARM1 was knocked down, the H3mR17 level was decreased and OCT4, SOX2 expression was also reduced, but NANOG expression had no change. All these indicate that CARM1 is required for amniotic fluid-derived stem cells to maintain stemness through regulating OCT4 and SOX2 expression.     

Activation of ectopic Oct-4 and Rex-1 promoters in human amniotic fluid cells

Recently, amniotic fluid was suggested as a new source for stem-cell research and tissue engineering approaches. In order to enable isolation of stem cells and establishment of lines of such cells with an undifferentiated phenotype we have introduced green fluorescent protein regulated by the promoters of the stem cell-specific genes, Oct-4 or Rex-1, into human amniotic fluid cells. For the introduction of DNA into human amniotic fluid cells, we have optimized a specific transfection protocol. We found that human amniotic fluid contains cell populations which are able to activate these promoters. These undifferentiated cells expressing green fluorescent protein can be analysed on a flow cytometer. In addition, we have introduced a plasmid harboring a neomycin-resistance gene under the control of the Oct-4 promoter. G418 selection allowed the isolation of undifferentiated stem cells expressing Oct-4 protein out of human amniotic fluid samples. Our findings confirm the existence of stem cells within amniotic fluid. In addition, the ability to transfect human amniotic fluid cells and to isolate stem-cell marker-positive cells will provide the means to study and manipulate these cells for the purpose of basic and applied research.     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性及向神经前体细胞分化的实验研究

目的 观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的生物学特性,并探讨使其转分化为神经前体细胞(NPCs)的方法.方法以密度梯度离心和贴壁法相结合分离成人骨髓间充质干细胞,并观察细胞形态、生长、表面标记以及成骨和成软骨及成脂肪能力的情况.选用第3代细胞进行诱导,先经胚胎干细胞培养液扩增,再用加有5-氮胞苷和曲古菌素A的神经诱导液诱导,7d后,一部分样本进行Nestin、Sox2免疫荧光染色和RT-PCR检测;另一部分样本在含有B27的神经培养液中继续培养7d,然后进行NF-L的免疫荧光检测.结果分离培养的hMSCs纯度较高,CD29、CD44的阳性率均在90%以上;具有明显的成骨、成软骨和成脂肪能力;经5-氮杂胞苷和曲古菌素A作用后能向神经前体细胞分化,免疫荧光染色及RT-PCR结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经前体细胞标志物Nestin和Sox2;在神经培养液中继续培养后检测神经细胞标记物NF-L,可见较多阳性细胞.结论 hMSCs可在体外进行分离培养扩增,经药物修饰后具有向神经前体细胞分化的潜能.     

依达拉奉干预永久性脑缺血大鼠神经干细胞增殖及分化

目的 探讨依达拉奉对永久性脑缺血大鼠脑内内源性神经干细胞的影响.方法 采用电凝法建立大鼠永久性脑缺血模型.将30只SD大鼠随机分为假手术组、脑损伤组与依达拉奉组,每组10只,模型制作成功后6 h,1.5 g/L依达拉奉组腹腔注射依达拉奉(10 ml/kg),每天1次,假手术组与脑缺血组腹腔注射等体积的生理盐水,连续注射...