敲低Runt相关转录因子3(RUNX3)抑制低氧诱导的内皮细胞间质转分化

目的探讨敲减Runt相关转录因子3(RUNX3)对低氧诱导人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)向间质转分化的影响及具体机制。方法低氧条件下培养HCMEC,使用RUNX3干扰慢病毒敲减HCMEC中的RUNX3基因,应用反转录PCR检测内皮细胞间质转分化(EndoMT)相关基因CD31、血管内皮钙黏素(VE-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异蛋白1(FSP-1)以及RUNX3的mRNA表达,应用Western blot法检测CD31、α-SMA、RUNX3、转化生长因子β2(TGF-β2)、Smad2/3、p-Smad2/3以及Notch-1、Hes1、Hey1蛋白表达,免疫荧光细胞化学染色检测CD31、α-SMA的表达和定位。结果低氧能够诱导HCMEC发生EndoMT;低氧时TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3以及Notch-1、Hes1、Hey1蛋白均上调;而RUNX3敲减后TGF-β2以及Notch-1蛋白水平增高,然而Smad2/3、p-Smad2/3以及Hes1、Hey1蛋白水平均不同程度下调。结论 RUNX3敲减可减轻低氧诱导的EndoMT,可能是通过部分抑制TGF-β及Notch信号通路。     

TGF-β/Smads通路参与EndoMT在HHPH中的作用及益气温阳活血化痰方的干预效应

目的:探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smads信号通路与低氧高二氧化碳性肺动脉高压(HHPH)中肺动脉内皮-间充质转化(Endo MT)的关系及益气温阳活血化痰方的调控作用。方法:取健康雄性清洁级SD大鼠为研究对象,随机分为5组:常氧对照(N)组、低氧高二氧化碳(HH)组及益气温阳活血化痰方高剂量(YH)组、中剂量(YM)组和低剂量(YL)组。N组置于常氧环境下饲养,其余4组置于低氧高二氧化碳(9%~11%O2和5%~6%CO2)环境下饲养4周。各中药组在放入氧舱前以相同体积不同浓度的益气温阳活血化痰方灌胃,YH、YM和YL组浓度分别为200 g/L、100 g/L和50 g/L。术中测平均肺动脉压和平均颈动脉压,术毕取右心室游离壁及左心室加心室间隔称重,以此计算右心室肥大指数。HE染色和免疫荧光法观察肺组织形态学的变化,采用RT-PCR和Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、CD31、TGF-β1和Smad2/3的m RNA和蛋白表达以及p-Smad2/3的蛋白水平。结果:与N组比,其余4组肺动脉平均压、α-SMA、TGF-β1和Smad2/3的m RNA和蛋白表达以及pSmad2/3的蛋白水平上升,CD31 m RNA和蛋白表达水平降低,镜下观察到组织形态学损伤;与HH组比,YH、YM和YL组肺动脉平均压、α-SMA、TGF-β1和Smad2/3的m RNA和蛋白表达以及p-Smad2/3的蛋白水平下降,CD31m RNA和蛋白表达水平上升,肺组织形态学的损伤显著减轻。结论:在HHPH中,TGF-β/Smads通路可能参与了Endo MT;益气温阳活血化痰方可通过抑制TGF-β/Smads通路的表达降低肺动脉高压。     

不同氧浓度对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响

目的:观察不同低氧环境对在向成骨细胞分化培养系中的骨髓基质细胞核心结合因子α1(Cbfα1/Runx2)、骨形态发生蛋白2(BMP2)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPAR-γ2)表达的影响,探讨低氧环境对成骨细胞分化的影响。方法:取4月龄雌性SD大鼠骨髓基质细胞在生长培养基中培养传代后,随机分成4组,每组样本数为8,加入分化培养基,分别将细胞放入4个不同氧浓度中继续培养,3d后进行下面的实验:用Trizol提取细胞总RNA,用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测(Cbfα1/Runx2)、BMP2和PPARγ2mRNA的表达;用Western blotting检测(Cbfα1/Runx2)、BMP2蛋白的表达。结果:1.与常氧组(20%)相比,各低氧组Runx2mRNA和Runx2蛋白的表达明显增加。2.与常氧组(20%)相比,各低氧组BMP2mRNA的表达明显增加,低氧可促进BMP2蛋白的表达。3.与常氧组(20%)相比,各低氧组PPARγ2mRNA的表达明显降低。结论:低氧能明显促进Runx2mRNA、BMP2mRNA和Runx2蛋白的表达,且氧浓度越低,Runx2mRNA、BMP2mRNA和Runx2、BMP2蛋白表达越多,相反,低氧能明显抑制骨髓基质细胞PPARγ2mRNA的表达,且氧浓度越低,PPARγ2mRNA的表达越低,表明低氧明显抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞分化而促进其向成骨细胞分化。     

过表达BMP9对人肺鳞状细胞癌细胞NCI-H520迁移和侵袭的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对人肺鳞状细胞癌细胞NCIH520迁移和侵袭的影响及其机制。方法:采用RT-PCR和Western blot法分别检测NCI-H520细胞和正常人支气管上皮(HBE)细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达水平;用Ad BMP9感染NCI-H520细胞,RT-PCR和Western blot法验证BMP9的变化;应用划痕愈合实验检测各组细胞的迁移能力,Transwell小室检测迁移和侵袭能力,并用RTPCR和Western blot法检测迁移相关因子基质金属蛋白酶2(MMP2)的mRNA和蛋白水平。Western blot法检测BMP-Smad经典通路中Smad1/5的磷酸化水平(p-Smad1/5)。用BMP特异性拮抗剂Ad Noggin与Ad BMP9共处理NCI-H520细胞,检测p-Smad1/5及细胞迁移能力的变化。结果:BMP9在NCI-H520细胞中的mRNA和蛋白水平均比在HBE细胞中低;Ad BMP9感染的NCI-H520细胞中BMP9的mRNA和蛋白水平均明显升高,细胞迁移和侵袭能力均明显下降,MMP2的mRNA和蛋白水平下降,且p-Smad1/5的表达水平明显上调。在NCI-H520细胞中,Noggin能有效逆转BMP9导致的p-Smad1/5升高和细胞迁移抑制能力。结论:外源性BMP9转入肺鳞癌细胞NCI-H520可明显抑制其迁移侵袭的能力,该抑制作用可能与BMP-Smad信号通路的激活有关。     

环状RNA-42398通过调控TGF-β1/Smads信号通路抑制肝星状细胞活化

目的:探讨小鼠环状RNA-42398(mmucirc42398)对肝星状细胞活化的影响及机制是否与调节TGF-β1/Smads信号通路有关。方法:小鼠肝星状细胞株JS1,分成正常对照组、空载体阴性对照组(vector组)和mmucirc42398过表达组(mmucirc42398组),体外构建mmucirc42398过表达载体,通过脂质体瞬时转染法转入JS1细胞,48 h后RT-qPCR检测mmucirc42398的表达变化,PCR产物经一代测序验证其环化位点,Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原(Col I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达。结果:与vector组相比,mmucirc42398组的mmucirc42398表达增加(P<0.01),PCR产物测序验证了其环化位点,提示mmucirc42398过表达质粒成功转入JS1细胞并高效表达;在JS1细胞中过表达mmucirc42398后,α-SMA和Col I蛋白表达显著降低(P<0.01),TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表达无显著变化(P>0.05),但p-Smad2和p-Smad3蛋白水平显著降低(P<0.01)。结论:mmucirc42398能抑制肝星状细胞的活化,其机制与调控TGF-β1/smads信号通路有关。     

柴胡皂甙D通过调控TGF-β1/Smads信号通路抑制人胚肺成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生

目的研究柴胡皂甙D(SSD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖、转分化以及TGF-β1/果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白家族(Smads)信号通路的影响。方法体外培养HELF,设立正常对照组、 1 ng/mL TGF-β1处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合0.5μmol/L SSD处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合1μmol/L SSD处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合2μmol/L SSD处理组。采用CCK-8法检测HELF的增殖情况,荧光定量PCR法检测Smad2、 Smad3、 Smad7的mRNA水平, Western blot法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、 1型胶原蛋白(Col1)、 Smad2、 Smad3、磷酸化的Smad2(p-Smad2)、 p-Smad3、 Smad7的蛋白水平。结果与正常对照组比较, TGF-β1处理组细胞增殖明显, Col1、α-SMA蛋白水平增加, Smad2和Smad3 mRNA和蛋白磷酸化水平显著增加, Smad7 mRNA和蛋白水平显著降低;与TGF-β1处理组比较,不同浓度SSD处理组细胞增殖降低,可逆转以上各指标的改变,呈一定的量效关系。结论 SSD通过调控TGF-β1/Smads信号通路,发挥抗肺纤维化的作用。     

白藜芦醇对TNF-α诱导的离体大鼠肺动脉内皮细胞损伤及MCP-1表达的影响

目的:探讨中药单体白藜芦醇(resveratrol,Res)对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的离体大鼠肺动脉内皮细胞(rat pulmonary artery endothelial cells,RPAECs)中单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的作用。方法:采用组织贴块法培养RPAECs,随机分为空白对照组(control组)、溶剂对照组(solvent组)、TNF-α(10μmol/L)组和Res(50μmol/L)+TNF-α组(Res组),每组又分成1、4和8 h三个时点(n=6),在8 h增加TNF-α+C1142(MCP-1特异性中和抗体)组(C1142组)。采用Western blot方法检测RPAECs中MCP-1蛋白表达,real-time PCR方法检测MCP-1 mRNA表达。结果:C1142可显著减少TNF-α诱导的RPAECs凋亡(P0.05)。相同时点solvent组的MCP-1蛋白和control组比较差异无统计学显著性;TNF-α组的MCP-1蛋白及mRNA较control组增高(P0.05);Res组的MCP-1蛋白及mRNA表达较TNF-α组降低(P0.05)。结论:MCP-1参与TNF-α诱导的RPAECs损伤;Res可降低TNF-α诱导的RPAECs中MCP-1表达,从而减少内皮细胞损伤。     

丹皮酚通过抑制miR-21表达减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

目的研究丹皮酚(PAE)通过抑制微小RNA-21(miR-21)减轻博莱霉素(BLM)诱导肺纤维化的相关机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、BLM组、阳性对照(PC)组、PAE组,比较各组大鼠的肺纤维化相关指标,miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平,及Smad7、TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平;将制备好的纤维细胞分为对照组,TGF-β1组,PAE-L组,PAE-M组,PAE-H组,miR-21抑制剂组,检测各组细胞中miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平及Smad7、COLIA1、α-SMA蛋白水平,并验证miR-21与Smad7的靶向关系。结果与对照组相比,BLM组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度,miR-21mRNA表达水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白表达水平显著升高均显著升高(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P0.01),与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度均显著降低(P0.01);与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠肺组织中miR-21 mRNA水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低,Smad7的mRNA及蛋白水平显著升高(P0.01);与对照组相比,TGF-β1组成纤维细胞中miR-21的mRNA及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著升高(P0.01),Smad7的m RNA及蛋白水平显著降低(P0.01);与TGF-β1组相比,PAE-L组、PAE-M组、PAE-H组、miR-21 inhibitor组成纤维细胞中miR-21的mRNA水平及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P0.01);靶基因数据库预测及双荧光素酶报告实验表明,miR-21靶向抑制Smad7。结论 PAE可能通过抑制miR-21表达靶向促进Smad7表达,并抑制TGF-β1表达来减轻BLM诱导的肺纤维化。     

Kv1.5对大鼠低氧高二氧化碳性PASMCs增殖、凋亡的影响及与MAPK通路的关系

 目的：探讨电压依赖性钾离子通道Kv1.5对大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖、凋亡的影响及其与丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路的关系。方法：体外培养大鼠PASMCs,复制低氧高二氧化碳模型,随机分组如下：常氧组（N组）;低氧高二氧化碳组（HH组）;低氧高二氧化碳+溶剂DMSO对照组（HD组）;低氧高二氧化碳+ERK1/2通路抑制剂U0126组（HU组）;低氧高二氧化碳+p38 MAPK通路抑制剂SB203580组（HS组）;低氧高二氧化碳+MAPK通路激动剂茴香霉素（anisomycin）组（HA组）。采用CCK-8法检测细胞活性,蛋白免疫印迹法检测Kv1.5、增殖细胞核抗原（PCNA）及Bax蛋白的表达水平。结果：与N组相比,HH组和HD组细胞活性增加（P<0.01）,PCNA蛋白表达上调,Kv1.5及Bax蛋白表达均明显降低（P<0.01）,HH组和HD组间各指标变化均无显著差异（均P>0.05）;较之HD组,HU组、HS组及HA组细胞活性降低（P<0.05或P<0.01）,PCNA蛋白表达下调,Kv1.5及Bax蛋白表达均明显增加,差异均显著（P<0.01）,其中以HA组各指标变化最明显。结论：钾离子通道Kv1.5对低氧高二氧化碳性大鼠PASMCs增殖、凋亡的调节可能与MAPK通路的激活有关。     

慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化

目的:构建携带线粒体融合蛋白2(Mfn2)基因的慢病毒载体,并探讨Mfn2过表达对大鼠肝星状细胞活化的抑制作用及其减少肝纤维化相关因子生成的机制。方法:构建含Mfn2的慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP,转染肝星状细胞;荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达及转染效率;RT-qPCR和Western blot法检测转染后细胞中Mfn2的mRNA和蛋白表达水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、α-SMA、TGF-β1、Smad2和Smad3的水平;ELISA检测Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白水平。结果:与各对照组相比,慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP转染后,细胞促凋亡蛋白表达增多,TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad和p-Smad3的蛋白水平均降低,纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的水平降低(P0.01)。结论:转染慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP在体外可有效抑制肝星状细胞活化,并可能通过抑制TGF-β1/Smad通路减少肝纤维化相关因子的生成。     

抗IGFBPrP1抗体对小鼠肝纤维化的预防作用及其机制的研究

目的: 明确抗胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)抗体能否预防硫代乙酰胺(TAA)诱导的小鼠肝纤维化的形成,同时探讨其机制。方法: 将24只雄性C57BL/6野生型小鼠随机分为正常对照组、TAA 4周组和TAA+抗IGFBPrP1抗体4周组,每组8只,观察肝组织形态学改变,免疫组织化学染色和Western blotting检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)、Smad3、磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen Ⅰ、Ⅲ)及IGFBPrP1的表达。结果: TAA 4周组肝损伤严重,α-SMA、TGF-β₁、Smad3、p-Smad2/3、FN、collagen Ⅰ、Ⅲ及IGFBPrP1的表达明显高于正常对照组(P＜0.01),TAA+抗IGFBPrP1抗体4周组肝损伤减轻,上述各指标表达均低于TAA 4周组(P＜0.01)。IGFBPrP1与TGF-β₁、Smad3、p-Smad2/3 、FN及collagen Ⅰ的表达呈正相关(P＜0.01)。结论: 抗IGFBPrP1抗体可预防TAA诱导的小鼠肝纤维化的形成,其机制为抑制肝星状细胞的活化和减少细胞核内p-Smad2/3的表达、抑制TGF-β₁/Smad3信号通路,进而导致细胞外基质在肝组织中沉积减少。     

糖尿病大鼠肾组织中miR-21和SnoN表达的变化

目的探讨糖尿病(DM)大鼠肾组织中微小核糖核酸-21(miR-21)和核转录共抑制因子(SnoN)在肾纤维化过程中的表达变化及其可能机制。方法用链脲佐菌素复制DM大鼠模型,并设对照组(NC),每组n=8。10周后处死大鼠,观察肾组织形态变化;免疫组织化学染色、Western blot及RT-q PCR检测miR-21、SnoN、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad3(Ser423/425)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ)的表达。结果与对照组相比,DM组肾组织p-Smad3(Ser423/425)、TGF-β1和α-SMA蛋白表达增加(P0.05),SnoN、E-cadherin蛋白表达减少(P0.05),但SnoN mRNA和miR-21表达明显上调(P0.05),并伴有collagenⅠ、collagenⅢ和FN在间质沉积增多。结论 TGF-β1可能上调miR-21表达,抑制SnoN翻译水平的表达,促进DN的纤维化病变。     

氧化苦参碱抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化及其机制研究

 目的：探讨氧化苦参碱(OM)对高糖诱导的大鼠肾小管上皮-间充质转化（EMT）的抑制作用及其可能机制。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮NRK52E细胞,随机分为：对照组、高糖组、高糖+OM不同浓度组和高糖+0.50 g/L OM动态观察组。采用real-time PCR和Western blotting方法检测转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏素（E-cadherin）mRNA和蛋白的表达。结果：（1）与对照组相比,高糖组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达水平均进行性增高,Smad7蛋白表达进行性降低,E-cadherin mRNA和蛋白表达进行性降低,呈时间依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达进行性增高（P＜0.05）;（2）与高糖组相比,高糖+ OM不同浓度组随OM剂量增加,TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达均逐渐降低,Smad7蛋白表达水平逐渐增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达水平逐渐增高,且呈剂量依赖性（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异;（3）与高糖组相比,高糖+0.50 g/L OM动态观察组TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表达持续降低,Smad7蛋白表达持续增高,E-cadherin mRNA和蛋白表达持续增高（P＜0.05）,而Smad7 mRNA表达无明显差异。结论：OM可抑制高糖诱导的NRK52E细胞发生EMT,其机制可能与OM下调TGF-β1表达及上调Smad7蛋白表达,进而抑制TGF-β1/Smads信号通路的致纤维化效应有关。     

Smad2/3与Smad7在大鼠化疗性卵巢早衰卵泡中的表达和意义

目的 探讨顺铂对大鼠卵巢结构和功能损伤的影响及其可能的分子机制。方法 3月龄SD 雌性大鼠随机分为对照组（C组,5只）和化疗组（H组,5只）。H组给予每只大鼠腹腔注射顺铂2 mg/（kg.d）,C组给予腹腔注射等体积生理盐水,连续注射7 d后检测大鼠卵巢指数（卵巢湿重/体重）;酶联免疫吸附法检测血清雌二醇（E₂）和促卵泡刺激素（FSH）水平;苏木素-伊红染色观察卵泡发育并计数各级卵泡;免疫组织化学和Real-time PCR法检测各组Smad2、磷酸化Smad2（p-Smad2）、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、Smad4和Smad7的蛋白和mRNA表达。结果 与C组相比,H组大鼠卵巢体积减小,生长卵泡数明显减少（P<0.05）,大鼠卵巢指数下降（P<0.05）,血清中E2水平降低和FSH水平上升（P<0.05）。免疫组织化学和Real-time PCR结果显示,Smad2（p-Smad2）、Smad3（p-Smad3）、Smad4和Smad7蛋白在卵巢各级卵泡均有表达,H组Smad2蛋白和mRNA表达增加（P<0.05）,Smad2磷酸化水平（p-Smad2）表达增高（P<0.05）;Smad3、Smad4和Smad7蛋白和mRNA表达减少（P<0.05）,p-Smad3 表达降低（P<0.05）。结论 顺铂诱导大鼠卵泡损伤并促进卵巢早衰,引起卵泡细胞内Smad2表达增加,Smad3、Smad7表达降低,Smad细胞内信号通路参与了化疗性卵巢损伤的过程。     

Smad交互蛋白1在增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响

目的研究Smad交互蛋白1（SIP1）在人增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响。方法收集临床整形手术切取的9例患者增生性瘢痕标本及其自体正常皮肤标本。分离培养原代人增生性瘢痕成纤维细胞（HSFBs）,取第3-5代细胞用于实验。（1）免疫组织化学法检测增生性瘢痕组织标本及其自体正常皮肤组织标本中SIP1的表达情况。（2）真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/SIP1转染HSFBs。按照随机数字表法将细胞分为6组：对照组;pcDNA3.1（＋）组（空载体组）;pcDNA3.1（＋）/SIP1组;对照＋TGF-β1组;pcDNA3.1（＋）＋TGF-β1组;pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组。于转染后第48 h和72 h分别提取细胞总RNA和细胞总蛋白。应用实时荧光定量PCR法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA表达水平;采用Western-blotting检测α-SMA的蛋白表达水平。结果 （1）免疫组织化学染色结果显示：增生性瘢痕组织中SIP1表达明显低于自体正常皮肤组织。（2）pcDNA3.1（＋）/SIP1转染HSFBs后纤维化相关因子的表达：①α-SMA的mRNA和蛋白表达水平：与对照组和pcDNA3.1（＋）组相比,pcDNA3.1（＋）/SIP1组在mRNA和蛋白表达水平均显著下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。当细胞给予TGF-β1刺激后,各组α-SMA表达均上调,但pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组mRNA和蛋白表达水仍低于对照＋TGF-β1组,差异有统计学意义（P〈0.05）。②CTGF的mRNA表达水平：与对照组和pcDNA3.1（＋）组相比,pcDNA3.1（＋）/SIP1组在mRNA表达水平显著下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。当细胞给予TGF-β1刺激后,各组CTGF表达均显著上调,但pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组mRNA表达水仍低于对照＋TGF-β1组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论与正常皮肤组织相比较,SIP1在增生性瘢痕组织中低表达。SIP1基因转染HSFBs可降低纤维化相关因?     

Imbalance of receptor-regulated and inhibitory Smads in lung fibroblasts from bleomycin-exposed rats

Transforming growth factor (TGF)-beta plays a central role in lung fibrosis, stimulating extracellular matrix deposition. Intracellular signaling of TGF-beta is mediated by Smad proteins. We questioned whether the expression and activation of Smads would be altered in lung fibroblasts from rats exposed to bleomycin, an agent used to provoke an experimental model of lung fibrosis. Fibroblasts were isolated from rat lungs 14 d after intratracheal instillation of bleomycin (BLF) or saline (NLF), and cell cultures established. Whole cell lysates were obtained at baseline, and after stimulation with TGF-beta1 (10 ng/ml). Western blot analysis was performed to measure levels of phosphorylated Smad3 (p-Smad3) and Smad7. Real-time PCR was used to determine changes in Smad7 mRNA after TGF-beta stimulation. We found increased baseline levels of p-Smad3 in BLF versus NLF (P < 0.05). In contrast, baseline levels of Smad7 were comparable. The ratio of stimulatory to inhibitory Smads was increased in BLF compared with NLF (P < 0.05). After stimulation with TGF-beta, levels of p-Smad3 were increased in both groups, with maximal responses at 30 min (P < 0.01). While Smad7 mRNA levels were significantly upregulated (at 1 h) after TGF-beta in both groups, the increase in Smad7 protein was significant in NLF only. We conclude there is sustained activation of Smad signaling in lung fibroblasts isolated from bleomycin-exposed rats, with an imbalance between the levels of p-Smad3 and Smad7. Insufficient levels of the inhibitory Smad7 at baseline, and inadequate response to TGF-beta, may contribute to the fibrotic phenotype characteristic of BLF.     

IgA肾病患者血清IgA1对人肾小球系膜细胞转化生长因子β1/Smads信号通路的影响

目的 研究IgA肾病(IgAN)患者血清IgA1对人肾小球系膜细胞(HMC)转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸化Smad3(p-Smad3)和纤连蛋白(FN)的刺激作用,探讨IgA1对TGF-β1/Smads信号通路的影响.方法 体外培养HMC,分5组.即健康对照组、健康人IgA1(NIgA1)刺激组、健康人聚合IgA1(aNIgA1)刺激组、IgAN患者IgA1(PIgA1)刺激组和IgAN患者聚合IgA1(aPIgA1)刺激组.RT-PCR检测各组细胞TGF-β1、p-Smad3和FNmRNA的表达.Western免疫印迹检测HMC p-Smad3蛋白水平.ELISA检测HMC培养上清液中TGF-β1、FN蛋白水平.结果 PIgA1和aPIgA1能显著上调TGF-β1,P-Smad3、FN mRNA和蛋白的表达(P<0.05).aPIgA1上调三者mRNA表达的能力分别为PIgA1的1.5倍、1.3倍和1.5倍(均P<0.05).aPIgA1上调TGF-β1和p-Smad3蛋白表达的能力分别为PIgA1的2.1倍和1.6倍(均P<0.01).在aPIgA1刺激不同时间,TGF-β1和p-Smad3 mRNA表达于12 h达高峰(0.866±0.055和0.891±0.251),于24h回到基线水平.FNmRNA表达于24 h达高峰(0.968±0.031).TGF-β1和p-Smad3蛋白表达逐渐升高,TGF-β1于12 h达高峰[(246.960±1.270)ng/L],p-Smad3于6 h达高峰(0.490±0.046)后开始下降.FN蛋白表达逐渐升高,24 h达高峰[(1.804±0.038)mg/L](均P<0.01).结论 PIgA1和aPIgA1能显著上调HMC TGF-β1、p-smad3、和FNmRNA表达和蛋白水平.且aPIgA1的作用强于PIgA1,提示IgAN患者血清的IgA1,主要是aIgA1可通过TGF-β1/Smads信号通路在IgAN进展中起作用.