胞红蛋白表达纯化及抗氧化活性研究

研究人胞红蛋白(Cytoglobin,CYGB)的表达纯化、复性和抗氧化活性。人胞红蛋白基因工程菌pET28a/hC YGB/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,包涵体分离,复性,透析和Sephacryl S-200层析分离,获得纯化的rhC YGB。SDS-PAGE和HPLC检测表明rhC YGB纯度达95%以上,紫外光谱分析证明rhC YGB分子含有血红素,圆二色谱分析表明该复性蛋白质具有正确的α-螺旋结构。生化分析及细胞水平试验表明rhC YGB具有过氧化物酶活性和抗氧化活性。小鼠急性乙醇肝损伤模型试验表明rhC YGB能有效保护乙醇所致的肝损伤。研究结果表明经添加血红素复性和纯化所得的rhC YGB具有正确的空间结构和抗氧化活性。     

外源蛋白在CHO细胞株中高效表达的策略

目的:随着基因工程技术的不断发展,目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质.真核细胞中CHO细胞与其他表达系统相比具有许多优点,是目前重组糖基蛋白生产的首选体系.本文着重阐述外源蛋白在CHO细胞中高效表达的策略.     

胞红蛋白酵母表达载体构建与表达纯化

胞红蛋白是脊椎动物珠蛋白超家族的一员,具有重要的生物学功能,已在大肠杆菌中成功表达。酵母表达系统作为常用的真核表达系统,具有外源蛋白表达蛋白量大且活性高等优点。该研究通过PCR扩增技术获得胞红蛋白编码基因并通过DNA重组技术构建并鉴定了胞红蛋白毕赤酵母分泌型表达载体CYGB-pGAPZαA。将重组载体经单酶切线性化后通过电转化法转入毕赤酵母GS115,利用梯度浓度的Zeocin抗生素和PCR技术筛选得到阳性转化子。工程菌经发酵培养后,发酵上清液经镍柱分离得到较高纯度的目的蛋白,并经电泳等方法验证鉴定。     

人EPO cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人红细胞生成素（ＥＰＯ）的工程细胞株。方法：用 ＤＮＡ磷酸钙共转染法,将人ＥＰＯ ｃＤＮＡ的表达质粒 ｐＣＤＢ与标志质粒 ｐＳＶ－ｄｈｆｒ共转染到 ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞中。用 ＥＬＩＳＡ法检测到 ７０个克隆的细胞培养上清,筛选出５０个克隆细胞系。结果：经ＭＴＸ加压扩增,获得４系高效表达ＥＰＯ的细胞系（Ｂ４、Ｃ３、Ｆ１０、Ｇ７）,表达量为 ２． ２～１０ μｇ／（１０６ ｃｅｌｌ· ２４ ｈ）,ＥＰＯ的分泌量在上述细胞系扩增了 １１～３１倍。 Ｆ１０细胞系表达量为最高,并进一步亚克隆纯化。其中Ｆ１０－６亚克隆细胞株的平均表达水平为１０ ｕｇ／（１０６ｃｅｌｌ·２４ ｈ）,细胞冻存后复苏传代１５次,ＥＰＯ的表达水平无明显改变。结论：以Ｆ１０－６亚克隆细胞株建立了工程细胞株。     

壮药红鱼眼黄酮类化合物的提取及其抗氧化活性研究

目的:研究壮药红鱼眼黄酮类化合物的提取工艺及其抗氧化活性.方法:用乙醇回流提取法通过正交设计试验确定黄酮提取工艺的最佳条件,用氧化法测定其清除超氧自由基和DPPH·自由基的能力.结果:红鱼眼黄酮提取的最佳条件为:8倍量60%乙醇提取3次,每次1 h.所得黄酮在一定浓度范围内具有较强的清除自由基和抗氧化能力.结论:优选的提取工艺效率高,所制备的黄酮有较强的清除超氧自由基和DPPH·自由基活性,具有很好的抗自氧化效果,是一种较好的天然抗氧化剂.     

稳定高效表达人血栓调节蛋白的CHO细胞株的建立

目的:构建稳定高效表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的CHO细胞株,以便于大量生产纯化hTM蛋白。方法:利用脂质体li-pofectamine 2000将包含hTM基因全长序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞。转染后用G418的选择性培养液筛选、挑取抗性克隆。采用流式细胞术和Western blotting检测hTM在CHO细胞膜表面的表达情况,筛选建立稳定高效表达hTM的CHO细胞株并对其稳定性进行观察。结果:重组表达质粒pThr402转染CHO细胞后,流式细胞术证实hTM稳定高效表达于随机挑选的5个抗性克隆细胞株的细胞膜表面,但表达量有差异。Western blotting分析检测显示hTM表达量较高的CHO-TM1、CHO-TM4与CHO-TM5细胞株的细胞裂解液出现了与预期值相符的约105000的特异性条带。CHO-TM5已经经过冻存复苏前后各20次传代,且无论有无G418选择压力存在,hTM表达水平无明显差异。结论:成功构建了稳定高效表达hTM的CHO细胞株,可望获得大量蛋白,为进一步研究hTM的生物学功能以及制备和筛选抗hTM的单抗开辟新的途径。     

杀菌/通透性增加蛋白23-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在CHO细胞中的表达及活性鉴定

<正>杀菌/通透性增加蛋白(BPI)是一种主要存在于中性粒细胞内的阳离子抗菌蛋白,具有杀菌、中和内毒素和抗真菌等作用,并且在发生生物学效应时,对机体不产生任何损害,在革兰阴性菌感染的治疗方面有很好的应用前景[1]。研究表明,     

人促红细胞生成素在CHO细胞上的表达

为了获得人促红细胞生成素(EPO)的高效表达,以EPO gDNA 为基础构建了两个真核表达载体pDE、pCE,将它们分别经脂质体转染CHO-dhfr-细胞,其48h瞬时表达量分别为27.5ng/ml与88.90ng/ml.然后用氨甲喋呤(MTX)对转染细胞进行加压并挑选细胞克隆,共获得3株高效表达EPO的工程细胞株A,B,C,其中A来自质粒pCE,B和C来自pDE,在2×10-6mol/L的MTX的压力下,它们48h的最高表达水平分别为A:8.7μg/ml,B:10.76μg/ml,C:16.44μg/ml.经网织红细胞法测得它们均具有体内生物活性.     

人5α-还原酶Ⅱ在CHO细胞中的表达及活性鉴定

类固醇5α还原酶(SRD5A)催化睾酮(T)转化为二氢睾酮(DHT)，DHT的升高可导致良性前列腺增生等疾病的发生，因此抑制SRD5A的活性将成为治疗该类疾病的重要途径。文章将5α还原酶Ⅱ(SRDSA2)基因克隆到pcDNA3载体，并转染至CHO细胞，经G418筛选后获得表达SRD5A2基因的CHO细胞系。应用新建立的表达SRBSA2的细胞系，检测了选择性和非选择性抑制剂对SRDSA2的抑制效应，结果表明外源性SRD5A2显示很高的酶活性，而且这种活性能被其特异抑制剂非那雄胺所抑制。这一结果不仅确证了人类固醇5α还原酶Ⅱ型在CHO细胞的表达和产物活性，同时也为该类抑制剂的体外筛选提供了一种简便可靠的方法。     

重组人CD40 L功能性片段在CHO细胞中的表达

克隆人CD40 L基因功能性片段(E107-L261),并在CHO细胞中进行表达.从健康人扁桃体组织中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增CD40 L胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-hCD40 L真核表达载体.将重组质粒pcDNA3.0-hCD40 L转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离并western blot-ting鉴定其特异性,通过小鼠脾淋巴细胞增值实验检验其生物学活性.结果,CD40 L胞外区功能性片段(E107-L261)cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO中成功表达,具有免疫学和生物学活性.结论:真核表达载体peDNA3.0-CD40 L的成功构建并在CH0中成功表达.     

采用定点整合表达技术构建t-PA表达CHO工程细胞株

运用Flp InTM 定点整合表达系统构建表达组织型纤溶酶原激活剂 (tissue type plasminogenactivator ,t PA)的CHO工程细胞株。将pcDNA5 /FRT载体和携带t PA基因的 pJOD S载体用Hind/KpnI双酶切 ,再将回收的 2 .0kbt PAcDNA片段和pcDNA5 /FRT载体连接 ,构建 pcDNA5 /FRT/t PA质粒 ;应用Flp InTM定点整合表达系统 ,将t PAcDNA定点插入Flp lnTM CHO细胞基因组中的 1个单拷贝位点上 ,以潮霉素B筛选定点整合t PAcDNA的细胞克隆。经筛选和体外纤维蛋白溶解活性检测 ,获得了t PA表达水平为 15 0 0～ 2 0 0 0IU/ (10 6cells·day)的CHO工程细胞株。     

头花蓼抗氧化活性研究

目的:研究头花蓼抗氧化活性。方法:分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇提取头花蓼,用清除DPPH自由基、清除ABTS自由基和铁离子还原/抗氧化能力测定法,对头花蓼体外总抗氧化活性进行评价,并与6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸及阳性对照丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)比较。结果:头花蓼有较好的体外抗氧化活性。其甲醇提取物具有很强的清除DPPH自由基、ABTS自由基及还原Fe3+的能力,总抗氧化能力远远超过BHT的作用。结论:在3种提取物中,头花蓼甲醇提取物具有最高的抗氧化能力,乙酸乙酯提取物次之。3种方法中,DPPH方法和ABTS方法相关性(r=0.9917)最高。     

Antioxidant Activity of 13 Medicinal Plants

The aqueous extracts of 13 medicinal plants widely used in oriental medicine were examined for their reducing power, scavenging ability toward superoxide and hydroxyl radicals, and their inhibitory effect on lipid peroxidation. The reducing power of Herba Lycopi and Cortex Gleditsiae was more apparent than with other plants. All extracts tested were found to be highly active on scavenging of superoxide radicals. Among them, Fructus Crataegi, Herba Leonuri, Cortex Gleditsiae, and Herba Lycopi composed the highly active group. Although the overall level of hydroxyl radical scavenging activities tended to be lower than those for super-oxide radicals, Fructus Crataegi and Cortex Gleditsiae were found to act most effectively. Inhibitory effects on lipid peroxidation were examined using a rabbit erythrocyte-ghost system, and a high inhibition was obtained by Rhizoma Rhei, Fructus Crataegi, and Cortex Gleditsiae. Reversely, strong pro-oxidant activity was found in five medicinal plants including Semen Thujae Orientalis in this assay system.     

菝葜多酚类成分抗氧化活性的研究

目的 对菝葜中天然多酚类化合物的抗氧化活性进行研究,探讨多酚类化合物在菝葜药效发挥中的作用机制. 方法 分别采用TEAC法和DPPH法对菝葜醋酸乙酯部位中分离得到的9个天然多酚类化合物单体（SCE 1～9）的抗氧化活性进行测定,并初步分析它们发挥抗氧化作用的构效关系. 结果 化合物SCE 1～9具有很强的抗氧化活性,均能有效地清除ABTS&#8226;+和DPPH自由基,其中化合物SCE 1的活性最强,其清除ABTS&#8226;+自由基的TEAC值为（3.11±0.04）mmol&#8226;L^-1,在浓度50 μmol&#8226;L^-1时对DPPH自由基的清除能力为（95.95±0.76）%. 结论 菝葜中天然多酚类化合物可能是菝葜根茎醋酸乙酯提取物发挥治疗作用的物质基础.     

Synthesis and Antioxidant Activity of New Pyridines Containing Gallate Moieties

Pyridines containing the galloyl moiety have been prepared utilizing 4‐acetyl pyrogallol. In addition, fused pyridines were synthesized from the obtained pyridines via further chemical transformations. The results indicated that compound 4a showed stronger DPPH scavenging activity than the other compounds, and the scavenging effect decreased in the following order 4a > t‐BHQ > 2a > 2b > 3a > 3b > 4b . Accordingly, other antioxidant assays were conducted for 4a . The results suggested that compound 4a could be a good antioxidant candidate. The absence of mortality of rats receiving 5000 mg/kg body weight of 4a as single oral dose may indicate that it could be a safe antioxidant and may be used for further studies.

     

人IL-24基因在CHO细胞中的表达及其抗肿瘤效应

目的构建人IL-24基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-24的抗肿瘤活性。方法将测序验证的人IL-24基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组真核表达载体pcDNA3-hIL-24,转染CHO细胞进行稳定表达,经RT-PCR鉴定后用MTT法、Ho-echst染色和流式细胞术检测CHO细胞表达的rhIL-24诱导A549人肺腺癌细胞凋亡的抗肿瘤效应,用ELISA检测其刺激免疫细胞分泌IL-6和IFN-γ的功能。结果经双酶切和PCR鉴定,重组真核表达载体构建正确,人IL-24在CHO细胞中获得稳定表达,且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549人肺腺癌细胞凋亡及上调免疫细胞表达IL-6和IFN-γ的免疫刺激活性。结论人IL-24基因的稳定表达和抗肿瘤效应的实验研究,为进一步研究人IL-24抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。