抗旋毛虫肌幼虫ES抗原IgY的制备及鉴定

目的制备抗旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(excretory-secretory,ES)抗原的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),测定其效价及用于检测抗原的敏感性。方法 4只24w龄罗曼母鸡用旋毛虫肌幼虫ES抗原经大腿外侧与胸部肌肉免疫4次(首次剂量为500μg/只,加强剂量为250μg/只),每次间隔10d。取免疫前和首次免疫后42d的鸡蛋卵黄,用水稀释法提取IgY,考马斯亮蓝法测定蛋白含量,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blot)及间接荧光抗体试验(IFAT)对IgY进行分析,ELISA检测纯化后IgY的效价及检测抗原的敏感性。结果罗曼鸡经ES抗原免疫后,每枚鸡蛋经提纯后均可得到约70mg抗体,SDS-PAGE表明纯化的IgY有2条主要蛋白带,分子量为67kDa、23kDa,Western blot与IFAT发现提纯的IgY可识别肌幼虫虫体与ES抗原。IgY的抗体效价为1∶107,IgY-夹心ELISA检测旋毛虫抗原的敏感性为1.17ng/mL。结论制备的抗旋毛虫ES抗原的IgY具有较高的效价与敏感性。     

抗旋毛虫肌幼虫ES抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备分泌抗旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)抗原单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并对其及分泌的McAb进行鉴定。方法用旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌特异性、高滴度McAb的杂交瘤细胞株,制备腹水,进行纯化。ELISA间接法、夹心法和竞争法分别测定McAb滴度、相对亲和力和相加效应,琼脂双扩散试验鉴定免疫球蛋白类型,检测McAb与其他寄生虫抗原的交叉反应。电镜观察杂交瘤细胞超微结构,计数染色体数目及观察杂交瘤细胞分泌McAb的稳定性。结果筛选出2株(B2C12和E11F11)分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原McAb杂交瘤细胞株。电镜显示,杂交瘤细胞具有肿瘤细胞和浆细胞的特征,胞浆内可见大量分泌颗粒;杂交瘤细胞染色体数目平均为98.6条,均能稳定分泌McAb(属IgM)。B2C12株培养上清液和腹水McAb滴度分别为1∶1280和1∶2.048×104,E11F11株为1∶640和1∶1.024×104,其中前者的相对亲和力较后者稍高。2株McAb识别ES抗原不同的抗原决定簇;且不与其他寄生虫抗原发生交叉反应。结论获得2株抗旋毛虫肌幼虫ES抗原杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高滴度、特异性的IgM类McAb,并识别不同的抗原决定簇,为研制旋毛虫病诊断试剂盒和制备基因工程抗体奠定了基础。     

旋毛虫成虫排泄分泌抗原检测唾液中抗旋毛虫IgG抗体的研究

目的 评价旋毛虫(Trichinella spiralis)成虫排泄分泌抗原(adult worm excretory-secretory antigen,AWESA)作为诊断抗原检测旋毛虫感染日本大耳兔唾液中抗旋毛虫IgG抗体的可行性. 方法 建立旋毛虫感染日本大耳兔和对照组兔动物模型,采集感染前和感染后1～6周兔唾液和血清以及对照组兔唾液和血清.制备AWESA,建立AWESA作为诊断抗原的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),以市售旋毛虫IgG抗体检测试剂盒作为对照,测定感染前和感染后1～6周兔唾液和血清以及对照组兔唾液和血清中抗旋毛虫IgG抗体.AWESA和试剂盒测得的唾液A值和血清A值进行线性相关分析,AWESA和试剂盒测得的唾液阳性率和血清阳性率分别进行x2检验.结果 AWESA检测唾液和血清特异性IgG抗体阳性率依次为0、5%、20%、40%、60%、85%、90%,0、30%、60%、85%、95%、100%、100%,除感染后0、1、2周外其余各周唾液A值与血清A值呈显著线性相关(P＞0.05、P＞0.05、P＞0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05).市售旋毛虫IgG抗体检测试剂盒检测旋毛虫感染前和感染后兔唾液和血清中特异性IgG抗体阳性率依次为0、15%、20%、40%、55%、75%、90%,0、35%、60%、95%、95%、100%、100%,除0、1、3周外其余各周唾液A值与血清A值呈线性相关(P＞0.05、P＞0.05、P＜0.05、P＞0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05). 结论 AWESA与市售试剂盒检测唾液和血清中抗旋毛虫IgG抗体的阳性率具有一致性.     

旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原诊断早期旋毛虫病的研究

目的评价旋毛虫肌幼虫排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原诊断早期旋毛虫病的价值。方法应用旋毛虫肌幼虫ES抗原Western blot对旋毛虫感染后6~11d的小鼠血清及19d的早期旋毛虫病人血清进行检测,并与感染后35d的晚期旋毛虫病人和其他寄生虫病人血清的检测结果进行比较。结果 Western blot分析显示,肌幼虫ES蛋白中的2条蛋白带(41.5、55kDa)可被旋毛虫感染后7~11d的小鼠血清识别,6条蛋白带(41.5、44.1、45、55、61和65.2kDa)能被早期和晚期旋毛虫病人血清识别,阳性反应率均为100%(15/15);这6条蛋白带与裂头蚴病人和健康人血清无交叉反应,但与其他寄生虫病(血吸虫病、并殖吸虫病、华支睾吸虫病、棘球蚴病及囊尾蚴病)患者血清具有明显的交叉反应(19.12%~38.23%)。结论旋毛虫肌幼虫ES抗原中的41.5kDa~65.2kDa蛋白带可与旋毛虫感染早期血清反应,但与其他蠕虫病患者有明显的交叉反应。     

旋毛虫成虫可溶性抗原和排泄分泌抗原对小鼠免疫保护作用的比较研究

目的　比较旋毛虫成虫可溶性抗原和排泄分泌抗原对小鼠的免疫保护作用。方法　收集人工感染大鼠小肠内的成虫, 经研磨和冻融制备成虫可溶性抗原。采用体外培养的方法从培养液中提取旋毛虫成虫排泄分泌抗原。分别用两种抗原免疫小鼠, 间隔１ 周共免疫３ 次, 末次免疫后１ 周, 每只小鼠攻击感染１００ 条旋毛虫感染性肌肉幼虫。感染后１ 周检查小鼠小肠内成虫数量和雌虫生殖力, 感染后５ 周检查肌肉幼虫负荷。结果　成虫可溶性抗原诱导的成虫减虫率、新生幼虫减虫率和肌肉幼虫减虫率分别为７９５５ ％ 、６２２５ ％ 和６５０ ％ 。成虫排泄分泌抗原诱导的成虫减虫率、新生幼虫减虫率和肌肉幼虫减虫率分别是９７２７ ％ 、８６６０ ％ 和９００ ％ 。结论　实验结果表明旋毛虫成虫可溶性抗原和成虫排泄分泌抗原均能够诱导宿主产生较强的抗攻击感染的免疫力, 但后者的免疫原性更强。     

旋毛虫成虫可溶性抗原和排泄分泌抗原对小鼠免疫保护作用的 …

目的 比较旋毛虫成虫可溶性抗原和排泄分泌抗原和排泄分泌抗原对小鼠的免疫保护作用。方法：收集人工感染大鼠小肠内的成虫，经研磨和冻融制血成虫可溶性抗原。采用体外培养的方法从培养液中提取旋毛虫成虫排泄分泌抗原。分别用两种抗原免疫上是隔１周共免疫３档次免疫后１周，每只小鼠攻击感染１００条旋毛虫感染性肌肉幼虫。感染后１周检查小鼠小肠内丰虫数量和雌虫生殖力，感染后５周检查肌肉幼虫负荷。结果 成虫可溶性原诱导的     

旋毛虫肌幼虫特异性抗原的鉴定

目的 寻找诊断旋毛虫病的特异性抗原。方法 应用SDS—PAGE和Western blot对旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的蛋白组分进行研究。结果 旋毛虫肌幼虫可溶性抗原经SDS—PAGE后显示29条蛋白带，分子量范围在112—12kDa之间，其中65、43、42、31、30、20、17、16kDa为主带。112、110、108、102、97、95、65、63、58、55、53、49、45、43、42kDa蛋白组分与并殖吸虫感染的大鼠及患者血清、华支睾吸虫病、血吸虫病及囊尾蚴病患者血清均具有明显的交叉反应带；24—20kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应，而不与其它寄生虫感染的动物或患者血清、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应。结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中24—20kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原，可用于旋毛虫病的免疫学诊断及血清流行病学调杏。     

ELISA检测小鼠肉汁中旋毛虫抗体实验条件的研究

目的建立检测小鼠肉汁中旋毛虫抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。方法应用棋盘滴定方法,选择适宜的旋毛虫肌幼虫排泄-分泌(ES)抗原的包被浓度、酶结合物的种类及肉汁稀释液的种类。结果旋毛虫肌幼虫ES抗原的包被浓度为5.0μg/ml。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG对感染旋毛虫小鼠血清及肉汁的抗体检出率均为100%(10/10),HRP标记的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)的检出率均为0(0/10),两者相比其差异有显著性(P<0.05)。对感染旋毛虫的小鼠肉汁分别用磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸盐缓冲液-Tween20(PBS-T)、生理盐水及含3%脱脂奶粉的PBS-T稀释后进行检测,发现含3%脱脂奶粉的PBS-T在各稀释度的P/N值均明显高于其他3种稀释液(P<0.05)。结论建立了检测小鼠肉汁中旋毛虫抗体的ELISA方法,合适的酶结合物为HRP标记的羊抗小鼠IgG,肉样的最佳稀释液为含3%脱脂奶粉的PBS-T,而HRP-SPA不适合于ELISA检测小鼠抗体IgG。     

建立和评价ELISA法检测血清和唾液中旋毛虫IgG抗体的研究

目的 建立检测血清和唾液中旋毛虫抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.方法 应用方阵滴定法,筛选适宜的旋毛虫抗原(肌肉幼虫可溶性抗原、肌肉幼虫排泄分泌抗原、成虫可溶性抗原、成虫排泄分泌抗原)浓度、血清和唾液稀释度、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗人IgG抗体稀释度.共有20份旋毛虫感染兔、10份旋毛虫病患者血清和唾液用于这4种抗原的敏感性试验,20份健康兔与38份其他寄生虫感染兔和患者的血清和唾液用于这4种抗原的特异性试验.结果 这4种抗原适宜包被浓度依次为8.0 μg/ml、6.0 μg/ml、10.0 μg/ml、9.0 μg/ml.适宜的血清稀释度依次为1:100、1:200、1:50、1:200,唾液均用原液.适宜的山羊抗兔、山羊抗人IgG稀释度分别为1:2 500和l:2 000.这4种抗原检测旋毛虫感染兔血清和唾液的敏感性分别为100%和80%~100%,检测旋毛虫病患者血清和唾液的敏感性分别为100%和60%~80%;检测血清和唾液的特异性依次为81.03%、89.65%、77.59%、82.76%和93.10%、96.55%、89.65%、91.35%.结论 建立了检测兔和人血清及唾液中旋毛虫lgG抗体的ELISA方法.当采集血清标本有困难时,可将唾液替代血清用于检测旋毛虫病.     

双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测布氏菌抗原的实验研究

目的建立检测布氏菌抗原特异、敏感和快速的试验方法。方法在制备高滴度布氏菌抗体辣根过氧化物酶结合物及其冻干制品基础上，建立检测布氏菌抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验(DAbS-ELISA)，包括常规DAbS—ELISA及快速DAbS-ELISA。用建立的两种DAbS-ELISA法对布氏菌菌体抗原及可溶性抗原进行有关其特异性及敏感性对比观察；同时对模拟的这些抗原污染的饮用水标本进行对比观察。结果常规DAbS—ELISA检测布氏菌544A、16M、133OS及104M的菌体抗原以及布氏菌16M可溶性抗原的敏感性分别为0．22万菌／ml、120万菌／ml、190万菌／ml、2万菌／ml和0．012μg／ml；用快速DAbS—ELISA法的敏感性分别为22万菌／ml、120万菌／ml、1900万菌／ml、20万菌／ml和1．2μg／ml；同时用这两种DAbS—ELISA检测上述抗原污染的饮用水标本其敏感性分别为0．22万菌／ml、1900万菌／ml、20万菌／ml和0．012μg／ml；以及22万菌／ml、120万菌／ml、1900万菌／ml、200万菌／ml和1．2μg／ml。而且这两种DAbS—ELISA法检测不含布氏菌抗原的所有对照均为阴性反应。结论双抗体夹心酶联免疫吸附试验是检测布氏菌抗原的特异、敏感、快速和适用的试验方法。     

免疫层析试纸条检测轻度感染小鼠肉汁抗旋毛虫抗体的研究

目的观察免疫层析试纸条对轻度感染小鼠肉汁中抗旋毛虫抗体的检测效果。方法以胶体金标SPA和旋毛虫肌幼虫ES抗原制备免疫层析试纸条。将70只雄性昆明小鼠随机分为7组(每组10只),每组分别经口感染30、25、20、15、10、5、3条旋毛虫幼虫,感染后6周用试纸条进行血清及肉汁抗体检测,并与ELISA、镜检法及消化法的检测结果进行比较。结果30、25、20、15、10条旋毛虫幼虫感染的小鼠,试纸条与ELISA的血清及肉汁抗体阳性率均为100(10/10),镜检法与消化法的幼虫检出率均为100%(10/10)。5条旋毛虫感染的10只小鼠,镜检法和消化法的幼虫检出率分别为70%(7/10)和100%(10/10),消化法检查时10只小鼠的每克肌肉虫荷为0.88~3.14条幼虫(平均为1.58条),试纸条与ELISA检测时的血清及肉汁抗体阳性率均为100%(10/10)。3条旋毛虫感染的10只小鼠,4种方法检测时均为阴性。结果表明,试纸条检验肉类中旋毛虫的敏感性与ELISA和消化法相同,且明显高于镜检法(P<0.05)。低剂量旋毛虫感染小鼠后6周的肉汁抗体水平与感染剂量呈正相关(P<0.05),肉汁与血清抗体水平均具有相关性(P<0.05)。结论每克小鼠肌肉仅含0.88条旋毛虫幼虫时也可被试纸条检出,试纸条可用于轻度感染肉类中旋毛虫检疫的初筛。     

循环抗体与循环抗原组合检测诊断血吸虫病的应用观察

目的探讨血吸虫病循环抗原与循环抗体组合检测的诊断效能以及在血吸虫病疫区中的应用价值。方法采用夹心ELISA法和间接ELISA法对不同类型人群的血清标本进行循环抗原和抗SEAIgG抗体检测,比较抗原抗体组合检测的敏感性、特异性,以及在重疫区的检测效果。结果循环抗原与循环抗体平行检测敏感性和特异性分别为97.9%、92.2%;序列检测敏感性和特异性分别为76.0%、99.2%。对血吸虫病疫区粪检阳性人群平行检测阳性率为94.6%(35/37),序列检测阳性率为67.6%(25/37);疫区粪检阴性人群平行检测阳性率为69.8%(97/139),序列检测阳性率为39.6%(55/139)。结论组合检测方案中平行检测在重疫区对有效检出病人具有更高的应用价值。     

免疫层析试纸条检测感染小鼠肉汁中抗旋毛虫抗体的研究

目的建立一种肉类旋毛虫感染的快速免疫学检测方法。方法以胶体金标SPA和旋毛虫肌幼虫ES抗原制备免疫层析试纸条,对不同剂量旋毛虫幼虫感染小鼠后不同时间的血清及肉汁抗体进行检测,并与ELISA、镜检法及消化法的检测结果进行比较。结果用100、300、500条旋毛虫幼虫感染小鼠后6周,3组小鼠的血清及肉汁抗体阳性率均达100%;试纸条法对血清与肉汁的抗体检出率差异无统计学意义（χ2=0.22,P〉0.05）。试纸条法和ELISA检测100条幼虫感染小鼠肉汁的阳性率分别为91.3%和100%（χ2=2.09,P〉0.05）,检测300、500条幼虫感染小鼠肉汁的阳性率均为100%;试纸条法和镜检法对3组小鼠感染后5-7周的肉汁和膈肌检测的阳性率均为98.6%。消化法检查每克肌肉虫荷〈33条幼虫的6份标本,试纸条5份阳性,每克肌肉中含有6条幼虫时可被试纸条法检出。感染旋毛虫小鼠肌肉4℃保存1-7 d及-20℃保存1-7个月的肉汁抗体阳性率均为100%。结论免疫层析试纸条可用于新鲜肉、冷藏肉及冷冻肉中抗旋毛虫抗体的检测。     

免疫层析试纸条检测实验感染猪肉汁抗旋毛虫抗体的研究

目的观察免疫层析试纸条对实验感染猪肉汁中抗旋毛虫抗体的检测效果。方法以胶体金标SPA和旋毛虫肌幼虫ES抗原制备了免疫层析试纸条。将30头家猪随机分为2组：实验感染组20头,每头经口感染5000条旋毛虫幼虫,正常对照组10头。感染后10w用试纸条进行血清及肉汁抗体检测,并与镜检法进行比较。结果应用试纸条检测旋毛虫幼虫感染的家猪血清及肉汁的抗体阳性率均为100%（20/20）,肌肉压片镜检法的幼虫检出率亦为100%（20/20）,每克腿肌虫荷为111～400条幼虫（平均为231.36条）。应用试纸条和镜检法对正常对照组肉汁及膈肌时均为阴性。感染猪肌肉-20℃保存8个月的肉汁抗体阳性率亦为100%（20/20）。结论试纸条检测肉汁中旋毛虫抗体可用于新鲜肉及冷冻猪肉中旋毛虫检疫的初筛。     

免疫层析试纸条检测感染小鼠肉汁中抗旋毛虫抗体的研究

目的 建立一种肉类旋毛虫感染的快速免疫学检测方法.方法 以胶体金标SPA和旋毛虫肌幼虫ES抗原制备免疫层析试纸条,对不同剂量旋毛虫幼虫感染小鼠后不同时间的血清及肉汁抗体进行检测,并与ELISA、镜检法及消化法的检测结果进行比较.结果 用100、300、500条旋毛虫幼虫感染小鼠后6周,3组小鼠的血清及肉汁抗体阳性率均达100%;试纸条法对血清与肉汁的抗体检出率差异无统计学意义(χ2=0.22, P＞0.05).试纸条法和ELISA检测100条幼虫感染小鼠肉汁的阳性率分别为91.3%和100%(χ2=2.09, P＞0.05),检测300、500条幼虫感染小鼠肉汁的阳性率均为100%;试纸条法和镜检法对3组小鼠感染后5～7周的肉汁和膈肌检测的阳性率均为98.6%.消化法检查每克肌肉虫荷＜33条幼虫的6份标本,试纸条5份阳性,每克肌肉中含有6条幼虫时可被试纸条法检出.感染旋毛虫小鼠肌肉4 ℃保存1～7 d及-20 ℃保存1～7个月的肉汁抗体阳性率均为100%.结论 免疫层析试纸条可用于新鲜肉、冷藏肉及冷冻肉中抗旋毛虫抗体的检测.     

Application of Toxocara canis excretory-secretory antigens and IgG subclass antibodies (IgG1-4) in serodiagnostic assays of human toxocariasis

A major problem in the serodiagnosis of human toxocariasis in tropical countries is cross-reaction with antibodies to other helminthic diseases and a lack of sensitivity. The majority of tests currently available use total IgG and, in this study, the use of peroxidase-conjugated anti-human IgG subclass antibodies (IgG1-4) was compared with total IgG for the diagnosis of human toxocariasis by using Toxocara excretory–secretory (TES) antigens in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) format. All four IgG subclass antibodies gave approximately 10-fold increases in optical density (OD) values for 50 toxocariasis patients compared to 29 healthy normals; this was significantly greater than the approximate doubling of OD values seen in the total IgG-ELISA format. IgG2 gave by far the greatest sensitivity (values: IgG, 50%; IgG1, 60%; IgG2, 98%; IgG3, 78%; IgG4, 64%). Significant cross-reactivity using all IgG subclasses in the TES ELISA was seen with 141 serum samples from patients with 10 other helminthic infections. However, IgG3 gave the best specificity (values: IgG, 73%; IgG1, 76%; IgG2, 71%; IgG3, 81%; IgG4, 71%). Thus, of the IgG subclass antibodies, IgG2 appeared best and employing this subclass can improve the serodiagnosis of human toxocariasis since it recognises carbohydrate epitopes of TES antigens.