抗人CD80单链抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人CD80单链抗体(ScFv),并初步研究其生物学功能。方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80mAb的杂交瘤细胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压筛选。纯化抗CD80-ScFv,并分析其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗CD80-ScFv对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。结果:构建的抗CD80-ScFv基因全长为828 bp,经测序含有信号肽和连接肽。实验获得稳定表达细胞株SA-Ⅱ,其培养上清与L929-CD80细胞的阳性结合率达98%以上。抗体纯化后产率约为15.12 mg/L,其能够识别Raji和Daudi细胞天然表达的CD80分子,结合率分别为96.6%和95.0%。抗CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。结论:成功建立了抗CD80-ScFv CHO细胞的表达株(命名为SA-Ⅱ),该抗体能够特异识别细胞表面膜型CD80分子并介导相应的生物学功能。     

抗人CD86单链抗体的基因克隆、表达及结合活性分析

目的 构建并在CHO细胞中表达抗人CD86单链抗体(CD86-scFv),研究该抗体与抗原的结合特性及介导的生物学功能.方法 从分泌鼠源CD86抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL基因,构建含有前导肽L-VH-Linker-VL抗体编码基因的表达载体并转染CHO细胞.经筛选高分泌株并扩大培养后收集上清进行纯化.流式细胞术分析CD86-scFv对不同细胞膜型CD86分子的识别及与鼠源亲本抗体1D1的竞争抑制效应.MTT法分析CD86-scFv与Raji细胞表达的CD86结合后对细胞生长的影响.结果 获得了稳定表达抗人CD86-scFv的CHO细胞株及相应抗体.CD86-scFv与CD86基因转染细胞株L929-CD86、天然表达CD86分子的人B系淋巴瘤细胞Raji和Daudi细胞的阳性结合率分别为67.0％、72.3％和80.5％.CD86-scFv对鼠源亲本抗体1D1具有竞争结合能力,将CD86-scFv(终浓度20μg/mL)加入Raji细胞共同培养72 h时的细胞生长抑制率为28.3％.结论 成功构建了稳定分泌抗人CD86-scFv的CHO细胞株(命名为SA-IV).该抗体能够识别CD86分子并具有良好的生物学活性.     

抗人CD86双价抗体的表达及与抗原的结合特性

目的:用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达抗人CD86双价抗体(CD86-diabody),鉴定该抗体对表达CD86分子肿瘤细胞的识别及介导的生物学效应.方法:从分泌抗人CD86小鼠源抗体的杂交瘤1D1中克隆抗体重、轻链可变区基因VH及VL.SOE-PCR构建VH-(GGGGS)-VL双价抗体基因,整合到真核表达载体plRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,FCM筛选G418加压培养的阳性克隆.IMAC纯化并定量抗体.免疫荧光法分析抗体对人B系淋巴瘤细胞株Raji及Daudi膜型CD86分子的阳性结合率,将抗体加入到Raji细胞的培养体系中,培养72 h,MTT法分析抗体对细胞体外增殖的影响.结果:获得了稳定分泌抗人CD86-diabody的CHO细胞株.培养上清中抗体纯品的得率为5.24 mg/L.抗体与Raji及Daudi细胞的阳性结合率分别为77.2％及70.6％.经抗体孵育72 h,Raji细胞体外增殖抑制率为37％.结论:成功制备了抗人CD86-diabody,可特异性结合细胞膜型CD86分子,并对表达该分子的肿瘤细胞体外增殖具有抑制效应.     

微型双功能抗体抗CD3／抗CD20的构建和表达

目的：构建和表达抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并测定微型双功能抗体的生物学活性。方法：采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot和分了排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果：DNA序列测定结果表明：抗CD3／抗CD20微型双功能抗体已构建成功,表达可溶性产物的产量达1mg/ml以上,纯化产物中二聚体的比例达90％,具有与Jurkat(CD3^ 0和Daudi细胞（CD20^ ）结合的活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环。结论：利用Diabody形式,首次成功地构建了抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并获得较高表达,表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。     

抗人CD3嵌合抗体基因的构建、表达及表达产物的初步功能研究

目的：构建并表达抗人CD3嵌合抗体，以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性。方法：采用基因工程技术，将抗体VL、VH因分别克隆入嵌合抗体表达载体VL Express及VH Express中。共转染COS-7细胞后，用ELISA检测培养上清中嵌合抗体的表达水平；采用Protein A亲和层析法纯化抗体，并进行Western blot鉴定。用FACS检测嵌合抗体结合抗原的活性；混合淋巴细胞培养检测抗体的功能。结果：成功地构建了VH Express-VH及VL Express-VL表达载体并表达纯化。Westem blot的结果显示，表达的抗人CD3抗体为人鼠嵌合抗体。FACS的结果显示．该抗体具有良好的结合抗原活性；混合淋巴细胞培养结果显示．该抗体具有一定的免疫抑制功能。结论：成功地构建、表达了抗人CD3嵌合抗体，为进一步的研究打下了基础。     

CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究

目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能.方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;Protein G亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用.结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56 mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖.结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性.     

抗转铁蛋白受体双价抗体的构建、表达及鉴定

目的：抗转铁蛋白受体（TfR）双价抗体（bsFv）构建、表达及其与细胞结合的活性鉴定。方法：以抗TfR的单链抗体（scFv）为模板，设计引物引入中问连接肽（G4S）及酶切位点AscI，通过PCR方法扩增两条scFv片段，将其连接并克隆至原核表达载体pAB1，转化大肠杆菌TG1，阳性菌经IPTG诱导表达，FCM检测bsFv与K562，HepG2肿瘤细胞结合的活性及特异性。结果：酶切鉴定及DNA测序证明该bsFv构建成功；SDS-PAGE、Westernblot鉴定表明表达蛋白分子量与bsFv理论值一致；FCM结果证明bsFv可与K562，HepG2肿瘤细胞特异性结合，且结合的阳性率较scFv有所提高。结论：成功构建了抗转TfR的bsFv，且能与K562，HepG2肿瘤细胞特异性结合。     

人源鼻咽癌双价抗独特型抗体疫苗的制备及活性鉴定

目的:构建全人源鼻咽癌双价抗独特型抗体原核表达载体,并对其产物作初步鉴定。方法:利用分子克隆技术依次将G22,I50插入到原核表达载体pET25b(+)中,经菌落PCR,双酶切验证并测序。阳性重组子转化入表达菌株E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达后,表达的重组蛋白经His-tag纯化试剂盒纯化后复性。用Westernblot方法鉴定G22-I50双价蛋白的表达,ELISA方法分析其蛋白活性,并进一步观察其对外周血单个核细胞的刺激增殖情况。结果:构建的原核表达载体pET25b-G22-I50经测序验证,序列正确。双价蛋白G22-I50以包涵体形式高效表达,经纯化后纯度达90%以上。Westernblot鉴定表达的蛋白相对分子质量(Mr)约42000,与预期相符。ELISA鉴定复性后的蛋白已恢复活性,并能在体外刺激外周血单个核细胞的增殖。结论:成功获得了有活性的双价抗独特型抗体,为临床对鼻咽癌进行主动免疫治疗提供了理论基础。     

小鼠抗人CD52功能性抗体的制备与鉴定

目的 鼠抗人CD52抗血清的制备与功能鉴定.方法 由人Hut-78细胞提取细胞总RNA,运用RT-PCR方法扩增CD52基因,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),用脂质体转染法转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、FACS、免疫组织化学技术检测目的蛋白的表达.用CD52合成肽免疫小鼠,通过间接ELISA和流式细胞术分析抗血清,用MTS实验鉴定抗体对白血病LCL细胞系的增殖抑制作用.结果 建立了稳定转染的CHO细胞系.鉴定出有高效价抗体存在.MTS实验检测免疫血清有抑制LCL细胞生长作用.结论 功能性抗体制备成功并建立了稳定转染CD52的CHO细胞系.     

抗人CD25嵌合抗体的稳定表达及鉴定

目的:构建抗人CD25嵌合抗体稳定细胞株,并对表达产物进行相关鉴定。方法:构建CD25嵌合抗体稳定表达质粒VEC-VTacH和3.3-VTacL并稳定转染CHO-DHFR-细胞,经选择性培养、有限稀释法克隆和MTX加压选择后扩大培养构建的工程细胞,Protein A纯化回收目的抗体后分别进行质谱分析、蛋白质N端测序和平衡解离常数(Kd)的测定。结果:CD25嵌合抗体稳定细胞株的抗体表达水平约为3.74～7.07μg/ml,质谱分析结果表明其含有鼠源成分和人源成分,蛋白质N端测序表明其与亲本抗体N端序列完全一致,其Kd为2.35×10-10mol/L,而亲本抗体的Kd为1.88×10-10mol/L。结论:抗人CD25嵌合抗体保留了亲本抗体的抗原结合活性和亲和力。     

肝癌靶向性SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定

目的:构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体。方法:首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttleCMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2。将AFP增强子、启动子、SEA及CD80基因分别从已构建的pKSEP载体和pMD18TBIS载体上,分别亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转化E.coliBJ5183。以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepa16和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3。采用间接免疫荧光法,激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达。采用3H掺入法检测膜表达的SEA诱导淋巴细胞增殖的活性。结果:以制备的重组腺病毒感染肿瘤细胞后,SEA和CD80能够靶向性地共表达在高表达AFP的Hepa16细胞膜上,而在不表达AFP的B16、NIH3T3细胞膜上不表达。结论:成功地构建肝癌靶向性SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究SEA和CD80在肝癌靶向基因治疗中的联合应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

抗人CD86人-鼠嵌合抗体的构建及在CHO细胞的表达

从分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:1D1)中抽提总RNA,采用简并引物,经RT-PCR扩增单抗VH和VL的DNA编码区基因。通过SMART-PCR扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。采用基因重组技术,将单抗VH、VL基因及其相应信号肽序列,与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/1D1。转染293T细胞进行瞬时表达,采用流式细胞术分析,转染上清与L929-CD86基因转染细胞的阳性结合率为97.6%。既而转染CHO细胞,经G418筛选,获取稳定分泌嵌合抗体的基因转染细胞株(CHO-ch1D1)。收集无血清培养基的培养上清,采用Protein G亲和层析柱分离纯化,经Lowr法定量。从上清中获取的嵌合抗体蛋白的得率为3.066 mg/L。经进一步间接免疫荧光及流式细胞术分析,纯化嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞,及Daudi细胞膜型CD86分子的阳性结合率分别为98.5%和95.7%。将嵌合抗体(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(P<0.05)。本研究获取的嵌合抗体在CD86分子的基础和应用研究中具有重要的价值。     

抗人CD20纳米抗体的筛选、表达及特性分析

目的 筛选出抗人CD20纳米抗体序列,并获得具有高亲和力与特异性的抗CD20-人IgG Fc纳米抗体.方法 利用天然噬菌体纳米抗体库,以生物素化的CD20抗原为靶标进行4轮液相亲和筛选,采用ELISA鉴定阳性克隆;将筛选到的阳性克隆基因序列与人IgG Fc片段偶联,构建到原核表达载体pCZN1中,并转化至大肠杆菌Arc...     

小鼠TERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达鉴定

目的:构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中的表达情况。方法:采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染肝癌细胞系Hepa1-6和成纤维细胞系NIH3T3。采用免疫荧光染色法检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。结果:重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS感染的Hepa1-6肝癌细胞膜上能够共表达SEA和CD80;而病毒感染的NIH3T3细胞不能表达SEA和CD80。结论:成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在肝癌细胞中的靶向表达,为进一步研究肝癌的靶向基因治疗奠定了基础。     

CD80和CD86介导的共刺激信号的比较及其生物学作用

共刺激信号在T细胞的活化中具有重要的作用,CD80和CD86是两个重要的共刺激分子。尽管两者存在许多相似之处,但随着研究的深入,发现两者在分子结构、所介导的生物学功能等方面均存在着诸多的不同。研究两者区别对于更好的了解它们的功能具有重要的意义。     

CD80 and CD86 IgC domains are important for quaternary structure,receptor binding and co-signaling function

CD86 and CD80, the ligands for the co-stimulatory molecules CD28 and CTLA-4, are members of the Ig superfamily. Their structure includes Ig variable-like (IgV) domains, Ig constant-like (IgC) domains and intracellular domains. Although crystallographic studies have clearly identified the IgV domain to be responsible for receptor interactions, earlier studies suggested that both Ig domains are required for full co-signaling function. Herein, we have used deletion and chimeric human CD80 and CD86 molecules in co-stimulation assays to study the impact of the multimeric state of IgV and IgC domains on receptor binding properties and on co-stimulatory function in a peptide-specific T cell activation model. We report for the first time the presence of CD80 dimers and CD86 monomers in living cells. Moreover, we show that the IgC domain of both molecules inhibits multimer formation and greatly affects binding to the co-receptors CD28 and CTLA-4. Finally, both IgC and intracellular domains are required for full co-signaling function. These findings reveal the distinct but complementary roles of CD80 and CD86 IgV and IgC domains in T cell activation.     

Integration of CD28 and CTLA-4 function results in differential responses of T cells to CD80 and CD86

CD80 and CD86 have the capacity to either stimulate or inhibit T cell responses through their receptors CD28 and cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4). Blockade of CD80 and CD86 in autoimmune disease settings has revealed distinct outcomes, yet the differential functions of CD80 and CD86 are still unclear. We have studied the ability of individual ligands to stimulate primary responses in human CD4(+) T cells. Our data reveal both quantitative and qualitative differences between the ligands. Both CD80 and CD86 demonstrated the capacity to costimulate T cell proliferation. However, CD80 committed a greater number of T cells to divide with faster kinetics, consistent with it being a superior ligand for CD28. Once cell division had been initiated, all T cells undergoing cell division expressed CTLA-4, irrespective of whether CD80 or CD86 costimulation was used. However, only in the presence of CD80 was evidence of CTLA-4 engagement and inhibitory function observed. Finally, differences between CD80 and CD86 costimulation extended to the T cell phenotype, in particular the levels of CD40 ligand expression.