体外组织工程血管支架内皮化的实验研究

目的：研究兔血管内皮细胞种植于组织工程血管支架内腔面的生长状况。方法：（1）将聚羟基乙酸（Plyglycolic acid,PGA)纤维无纺网和胶原纤维相混合，设计构建组织工程血管支架材料。（2）采用酶消化法从兔主动脉中分离培养兔血管内皮细胞并传代，纯化，接种于组织工程血管支架的内腔面，体外培养，并行电镜等观察。结果：该支架具有一定弹性和韧性，内皮细胞在其内表面形成较完整内皮细胞层，生长状况良好。结论：胶原包埋处理的PGA支架可以作为组织工程人工血管研究的较理想支架材料。为组织工程方法构筑具有分层结构的组织工程血管打下实验基础。     

组织工程人工血管支架的预构

目的：探讨具有血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）活性的组织工程人工血管支架的构建方法。方法：①将聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶原纤维相混合，构建组织工程血管。②将VSMCs置入胶原凝胶中，观察VSMCs的生长状况。③观察VSMCs胶原悬液滴入该支架材料中的生长。结果：①VSMCs在胶原凝胶中的位置固定，分布于不同层次，约3－4h逐渐形成多个胞质突起。随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈梭形、纺锤形。②VSMCs胶原悬液滴入胶原包埋处理的PGA支架中后，大部分细胞随胶原凝胶状态的形成，滞留于支架材料网孔中，细胞可沿PGA纤维表面生长。结论：胶原包埋处理的PGA纤维无纺网是良好的携带VSMCs的多孔生物降解材料。     

组织工程血管模型体外构建的实验研究

目的：在体外环境下，探索构建分别含内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞的三层结构的组织工程化血管，三种细胞相互作用，相互支持，形成一个在形态和功能与正常血管近似的组织工程化血管。方法：通过用胶原分别包埋处理的三个管径大小不同，但能相互嵌套的聚羟基乙酸（PGA）管形支架，并种植人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞进行三维立体生长培养，观察细胞生长分化情况。采用酶消化法和组织块法分离培养人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞并传代，纯化，将聚羟基乙酸（PGA）无纺网用胶原溶液包埋，真空冷冻干燥，形成多孔状PGA＋胶原管型支架；接种3代－7代人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞及人成纤维细胞与其内腔面，采用动脉旋转培养技术体外培养3周，行扫描电镜观察。结果：构建后的血管模型，层与层结构紧密，内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞分泌细胞外基质，相互进行物质交换，类似于生理条件。结论：该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状。此方法的进一步应用组织工程方法构筑具有分层结构的人造血管打下基础。     

纳米仿生组织工程血管体外构建的实验研究

目的 利用静电纺丝 (electrospinning,ELSP) 技术构建具有纳米结构的纳米仿生组织工程血管 (nano-biomimetic-tissue engineered blood vessel,NBTEBV). 方法 6 月龄新西兰雄性家兔 30 只,体重 2.15～3.10 kg.制备兔血管内皮细胞 (vascular endothelial cell,VEC) 体外培养育种管型模具采用多排喷头ELSP混纺兔平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell,VSMC)悬液及仿 ECM (mimic ECM,MECM) 溶液构建 NBTEBV. NBTEBV 用生物反应器体外培养,MTT 检测静置 24 h和动态培养7 d后NBTEBV 上 VECNSMC 的成活和增殖能力,行 HE 染色、扫描电镜观察及最大抗张力检测. 结果 动态培养第7天的 NBTEBV 长 57 mm,外径 4 mm,壁厚 0.4 mm,色乳白,质地均匀,具有良好的柔韧性及弹性.静置孵育 24 h MTT 检测血管上成活细胞相对数为 3.5×105/mg,动态培养7 d 后为 8.9×106/mg.扫描电镜及 HE染色观察示NBTEBV与天然血管有相似的纳米结构及组织学特点;电镜结构呈现由100 nm 支架纤维构成的孔径约600 nm的网状结构;HE 染色示VEC 和 VSMC分层构建成血管状.动态培养第7天组织工程血管最大静水压为950 mmHg,拟生理血压下(110/70 mmHg) 管径顺应变化率 3.0%;20 mm × 5 mm 组织片最大抗张强度为 18.5 MPa. 结论 利用 ELSP技术可以将VSMC 和 MECM的支架材料同步构建成具有与天然血管相似纳米结构的组织工程血管.     

含内皮祖细胞的组织工程皮肤体外构建及裸鼠移植研究

目的构建含内皮祖细胞（EPC）和成纤维细胞的组织工程复合皮，初步研究EPC在组织工程皮肤移植中促血管发生的作用。方法采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CD133＋血管内皮祖细胞，以聚羟基乙酸（PGA）为真皮基质，接种EPC和成纤维细胞，其上覆盖表皮细胞膜片，构建组织工程复合皮，覆盖裸鼠背部全层皮肤缺损创面。结果EPC和成纤维细胞能均匀贴附于PGA支架纤维材料上，并逐渐伸展为梭形或多极状。裸鼠移植实验表职，实验组创面愈合早于对照组，可见EPC参与大量新生小血管形成，真皮支架5周完全降解。结论EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。应用PGA＋纤维蛋白凝胶，制备含EPC和成纤维细胞的活性真皮替代物，具有良好的生物相容性、降解特性。     

采用组织工程方法体外构建血管模型的初步实验研究

目的　探索体外构建组织工程化人工血管的可行性。方法　通过酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞,培养、传代,纯化。采用交联胶原包埋处理聚羟基乙酸纤维无纺网(PGA),将第3～7代血管内皮细胞接种于上述材料上,通过特制的旋转装置,缓慢动态旋转培养10天,使内皮细胞在管腔内表面附着生长,扫描电镜观察,采用6-酮-前列腺素-1α放射免疫测试药盒测定管形材料中内皮细胞释放前列环素量。结果　培养血管内皮细胞VIII因子相关抗原抗体染色呈阳性,内皮细胞在管腔内表面贴附良好,细胞之间融合成片,经10天培养,形成较完整内膜层,覆盖率为(91.2±1.5)%,前列环素生成率为（4.6±0.5）μg/cm     

复合可降解基质膜片制备及血管内皮细胞在其吸附生长的实验研究

目的　制备几种复合可降解基质膜片 ,观察血管内皮细胞在其上的生长情况。方法　用胶原酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞 (VEC) ,另采用两步盐析法提取牛骨 型胶原。将交联胶原包埋处理聚羟基乙酸 (PGA)、聚乳酸 (PL A)及聚β羟基丁酸 (PHB)形成可降解基质材料膜片 ,并接种牛 VEC,采用 MTT法比较 VEC在几种可降解基质材料膜片的生长情况。结果　胶原、PGA/胶原、PL A/胶原膜质地均匀柔韧 ,固定成形 ,具有一定弹性和吸水性 ;MTT比色实验表明 VEC在胶原、PGA/胶原、PL A/胶原上均生长良好 ,优于 PHB/胶原组。尤以 PGA/胶原所形成的基质材料固定成形 ,弹性和韧性好 ,VEC在其上贴附生长良好。结论　通过生物材料与人工可降解材料有机结合 ,PGA/胶原物理性能互补 ,是组织工程再造血管较理想的基质材料之一。     

兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯(PHB)的细胞相容性实验研究

目的：探索血管平滑肌细胞和新型可降解材料聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性，为组织工程血管的构建寻找理想的支架材料。方法：将组织块法体上培养与兔血管平滑肌细胞种植在PHB膜片和PHB三维微孔支架上，在相差显微镜下观察细胞的粘附和生长情况。用MTT法测定细胞粘附率和细胞增殖指数，复合培养7天后进行扫描电镜观察并用流式细胞仪（FCM）的测定细胞周期，DNA指数。结果：兔血管平滑肌细胞在PHB膜片上粘附率为77％，细胞增殖符合细胞的生长曲线，在PHB三维微孔支架上生长情况良好，并被证实为二倍体细胞。结论：兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性较好，但细胞与材料间的粘附有待进一步改善。     

胎猪脱细胞主动脉作为小口径组织工程血管替代物的体内试验研究

目的:研究胎猪脱细胞主动脉(decellularized aorta of fetal pigs,DAFP)的生物相容性,确定其是否有作为支架材料用于小口径组织工程血管移植的潜力。方法:利用胰酶和核酸酶联合的脱细胞方法来制备胎猪主动脉脱细胞基质(DAFP),将其作为小口径组织工程血管的生物支架材料移植在成年犬单侧颈总动脉处,并监测其移植处的血流通畅情况,后期又通过组织学染色观察组织工程血管的组织学结构;扫描电镜观察血管的内表面结构;透射电镜观察其内表面的内皮细胞再生情况。结果:组织学染色结果表明构建的小口径组织工程血管具有完整的内膜层及中膜层结构;扫描电镜结果显示组织工程血管内表面覆盖着完整的内皮细胞层。结论:DAFP有作为小直径组织工程血管支架用于体内移植的潜力。     

胶原复合支架在血管组织工程中的应用

目的综述胶原与可降解高分子材料复合支架在血管组织工程中的应用,介绍近年来基于胶原材料制备的多层血管支架。方法查阅近年来胶原复合支架作为组织工程血管支架材料的相关文献,并进行综述。结果作为天然血管的结构蛋白之一,胶原因其良好的组织相容性、可降解性以及具有细胞识别信号等特点,广泛应用于血管组织工程。胶原复合高分子材料可制备具生物活性、力学性能良好的血管支架,其中多层血管支架更可在结构和功能上模拟天然血管。结论胶原复合高分子材料是目前血管支架研究的热点,其中多层血管支架已成为研究的新趋势。     

血管组织工程的进展

血管组织工程就是在体外构建理想的血管移植物。在过去20余年中涌现出了许多制备血管替代物的方法，包括胶原胶、脱细胞、细胞接种可降解材料等技术，这些成果显示了组织工程血管在临床应用方面的巨大潜力。目前，血管组织工程面临的挑战在于机械性能和抗血栓性，该领域今后的发展方向为细胞来源、体外培养环境、细胞增殖、黏附性和支架材料等。     

脐血管去内皮细胞后血管顺应性及抗原表达量变化的实验研究

目的 评价酶原法、低温法去除脐血管内皮细胞的优劣，为研究开发符合生理、无排斥、结构和功能类似自体的血管支架提供理论依据。方法 自愿捐赠的健康、足月顺产、无损伤胎儿新鲜脐动、静脉各60根，每根长10cm，抗生素液37C灭菌24h后，分为正常组、酶原组和冷冻组（n=20）。分组时每根血管取0．5cm细菌培养。酶原组加入0．1％Ⅱ型胶原酶后夹闭两端，37C水浴消化5、10、15、20min，去除内皮细胞；冷冻组置入冷存管中，加入DMEM培养液，逐步冷冻，最后置入液氮中，贮藏24h以上，37C水浴30～60s快速复温，无菌生理盐水灌冲血管腔数次，去除残留血管内皮细胞；正常组4CKerb’s保存液恒温存放。将标本分别行HE、弹力纤维及胶原纤维染色及扫描电镜观察；比较各组血管顺应性差异；采用免疫组织化学染色测定人类白细胞抗原ABC（human leukocyte antigen ABC，HLA-ABC）和HLA-DR，分析抗原表达量的变化。结果 各组标本均无细菌生长。组织学观察：冷冻组，内皮细胞完全去除，脐动脉显示内皮下发达的纵行平滑肌层，脐静脉可见内弹力膜；酶原组，胶原酶作用20min，血管内皮细胞完全去除，脐动脉露出内层纵行平滑肌细胞，脐静脉显示内皮下层。血管顺应性：冷冻组脐血管顺应性大于正常组，正常组大于酶原组，但组间差异均无统计学意义（P〉0．05）；脐静脉的顺应性约为脐动脉的2～3倍。HLA-ABC、HLA-DR免疫组织化学染色：冷冻组、酶原组与正常组比较，脐动、静脉抗原性均明显降低（P〈0．01）；冷冻组与酶原组比较，脐动、静脉HLA-ABC、HLA-DR抗原表达量均降低，且差异有统计学意义（P〈0．01）。结论冷冻法及0．1％Ⅱ型胶原酶作用20min均可完整去除脐血管内皮细胞，低温冷冻法优于酶原法。     

应用脂肪干细胞构建组织工程化小口径血管平滑肌层的实验研究

目的探索利用脂肪干细胞在生物反应器内构建组织工程血管平滑肌层的可行性。方法用抽吸的脂肪获取脂肪干细胞,在生长因子TGF-β1和BMP4作用下诱导成平滑肌细胞,然后将诱导的平滑肌细胞接种于PGA上,将细胞-材料复合物置于生物反应器内进行培养,在模拟胚胎发育血流动力学的刺激下(搏动频率:75次/分;扩展量<5%),构建小口径的血管平滑肌组织。培养8周后,取材行组织学和生物力学检测并与正常血管对比。结果脂肪干细胞在TGF-β1和BMP4的诱导下,细胞呈现平滑肌细胞特有的"波峰-波谷"样生长特点,并表达平滑肌细胞的特异性标记物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC;反应器内培养8周后,构建的管状组织胶原分泌旺盛,具有一定的力学强度和弹性。结论利用脂肪干细胞可在体外生物反应器内构建组织工程化小口径血管平滑肌层,为临床上小血管病变的修复提供了一种新的可能的途径。