聚合酶链反应检测卡氏肺孢子虫

特殊染色方法检测卡氏肺抱子虫（PC），需技术人员有较高的识别虫体能力，虫体量较少时易漏诊。我们应用聚合酶键反应（PCR）检测PC虫体并探讨其可行性，评估其敏感性和特异性。材料与方法雌性清洁级SD大鼠60只，体重180－220g，采用皮下注射可的松方法诱导PC肺炎。3－4个月后处死并解剖，支气管肺泡灌洗（BAL）法参照文献[1]。BAL液（BALF）行细菌及真菌培养，离心沉渣涂片行吉姆萨染色查找PC虫体。4％甲醛溶液固定肺脏，肉眼观察无明显病变则两肺各取3块肺组织，若肉眼见明显异常改变则在病变处取材，同时另一侧取3块肺组织行病…     

用半巢式PCR检测无创性标本诊断卡氏肺孢子虫肺炎的实验研究

目的无创性诊断卡氏肺施子虫肺炎。方法采用一对半引物进行半巢式DHFR－PCR检测实验大鼠无创性标本——支气管液、血清及活检标本——肺及肝脏组织中的卡氏肺孢子虫DNA。结果从59只经病理学检查证实的卡氏肺孢子虫肺炎大鼠中采集到的上述4种标本，卡氏肺孢子虫DNA的半巢式DHFR－PCR检出率分别为72.7％（32／44），37.3％（22／59），94．9％（56／59）和36．4％（8／22），而DHFR－PCR的检出率则仅为25％，13．6％，71．2％和9．1％。12只轻度感染的PCP大鼠的无创性标本中卡氏肺孢子虫DNA的检出率由刚提高至41．7％。正常鼠标本及各种病原体对照的半巢式DHFR－PCR均为阴性。结论用半巢式DHFR－PCR无创性地诊断大鼠卡氏肺孢子虫肺炎具有敏感、特异、省时、省力等优点；本文在血和肝中检出卡氏肺孢子虫DNA，提示在卡氏肺孢子虫肺炎大鼠模型中存在虫血症和肺外卡氏肺孢子虫感染。     

卡氏肺孢子虫肺炎

本文就卡氏肺孢子虫肺炎的病原体 ,感染途径 ,临床表现 ,诊断治疗及预防等方面作一概述 ,为卡氏肺孢子虫肺炎的预防控制提供参考。     

卡氏肺孢子虫肺炎5例

卡氏肺孢子虫肺炎５例安春丽，陈殿学，陈平，田边将信卡氏肺孢子虫肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｃｖｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ＰＣＰ．）是ＡＩＤＳ患者常见的最严重的机会性感染性疾病，也是肿瘤化疗，器官移植等细胞免疫功能低下宿主容易感染的一种寄生虫病。...     

PCR检测大鼠卡氏肺孢子虫的研究

目的探讨PCR技术检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值。方法SD大鼠和Wistar大鼠均随机分成实验组和对照组,实验组每周两次皮下注射醋酸可的松,诱导产生卡氏肺孢子虫;8week后,收集肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF),用PCR技术检测卡氏肺孢子虫DNA,并与Giemsa染色法比较。结果实验组两种大鼠肺组织卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为9643%和100%,BALF阳性率亦分别为9643%和100%,它们之间均无显著性差异(P>005);BALF的PCR阳性检出率显著高于Giemsa病原染色法,肺组织的两种方法检出率无显著性差异。结论PCR是一种检出率较高的方法,可作为早期诊断PCP的常规方法,特别适用于BALF检测卡氏肺孢子虫DNA。     

卡氏肺孢子虫肺炎实验诊断研究进展

随着卡氏肺孢子虫肺炎（PcP)作为AIDS、器官移植和肿瘤化疗等免疫功能低下患者的并发症越来越突出，对其作出正确、及时的诊断也越来越重要，本文就PcP的实验诊断研究概况及进展作一综述，并重点论述了分子生物学诊断方法的进展，为PcP诊断提供参考。     

PCR技术对大鼠卡氏肺孢子虫DNA的检测

目的　探讨诊断卡氏肺孢子虫感染的最佳方法。方法　建立大鼠动物模型,肺涂片用吉氏染色法查肺孢子虫包囊,支气管灌洗液、肺组织和血液标本,用ＰＣＲ技术进行卡氏肺孢子虫ＤＮＡ的检测,共计实验组大鼠１２ 只及对照组８ 只。结果　实验组大鼠,吉氏染色法卡氏肺孢子虫包囊检出率为６６－７％ ,ＰＣＲ技术支气管灌洗液、肺组织和血液标本,卡氏肺孢子虫ＤＮＡ检出率分别为８１－８ ％ 、５０％ 和５０％ 。比肺印片提前２ 周检出。对照组大鼠,吉氏染色法未检出卡氏肺孢子虫包囊,在支气管灌洗液和血液标本中,ＰＣＲ技术测出了卡氏肺孢子虫ＤＮＡ。结论　在血液标本中ＰＣＲ的成功应用,为卡氏肺孢子虫感染的流行病学调查及人类卡氏肺孢子虫肺炎的诊断,提供了一种有用的、非创伤性的方法。     

PCR及GMS染色法对肺孢子虫肺炎的临床诊断价值

目的 评价PCR及六胺银（GMS）染色法对肺孢子虫肺炎（PCP）的临床诊断价值。方法用PCR及GMS染色法检测临床拟诊PCP患者及非PCP患者的痰液标本，比较两种方法的敏感性和特异性。结果在40例临床拟诊PCP患者的痰标本中，用PCR方法检测肺孢子虫DNA，结果均为阳性，其中有12例患者用SMZ治疗后复检，PCR全部转阴；而用GMS染色镜检，阳性率仅为35．0％（14／40）。20例非PCP呼吸道感染者的痰液PCR和GMS染色镜检结果均为阴性。结论用GMS染色法诊断PCP，特异性高但敏感性差；PCR的敏感性高于GMS染色法，适于临床筛查和疗效考核。     

用PCR扩增技术检测卡氏肺孢子虫DNA

本文报道了用ＰＣＲ扩增技术检测卡氏肺孢子虫感染大鼠的肺组织，支气管灌洗液和外周血病原体ＤＮＡ，并和肺印片结果进行比较。共检测了实验感染鼠３４只及正常大鼠６只，肺印片阳性者１８例，ＰＣＲ检测肺组织样品出现特异的扩增条带者１９例，检测支气管灌洗液样品出现特异的扩增条带者１６例，外周血样品全部阴性。根据实验结果，认为引法用于检测卡氏肺孢子虫病原体ＤＮＡ有很好的应用前景。     

应用聚合酶链反应快速检测临床标本中的肺炎支原体

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测临床标本中的肺炎支原体（ＭＰ）。在１４０例非细菌性肺炎患者的标本中，ＰＣＲ试验阳性３０例。其中间接血凝试验阴性面ＰＣＲ试验阳性者２１例。ＰＣＲ阳性标本经ＭＰ５－４寡核苷酸探针检测验证，均为阳性结果。     

卡氏肺孢子虫特异性DNA探针的制备及其实验应用

目的制备特异、敏感的卡氏肺孢子虫(Pc)DNA探针,用于检测卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)患者临床标本中的PcDNA。方法PCR扩增获得Pc的线粒体核糖体RNA大亚基基因,以其为模板,采用随机引物法制备半抗原地高辛标记的探针。检测探针的敏感性和特异性后,用斑点杂交法检测实验大鼠肺组织和PCP患者临床标本中的PcDNA。结果敏感性检测显示该探针可检出2pg水平的PcDNA,特异性检测显示该探针仅与PcDNA杂交,而不与伯氏疟原虫、恶性疟原虫、弓形虫、人白细胞及正常大鼠肺组织DNA反应。斑点杂交检测PCP大鼠肺组织中的PcDNA,检出率为73.7%,低于PCR结合斑点杂交的检出率94.7%。用该探针从1例肾移植术并发PCP患者的支气管肺泡灌洗液中检测到PcDNA。结论制备的PcDNA探针具有敏感性高、特异性好、无放射性污染等优点,对PcDNA有良好的检测效果。     

卡氏肺孢子虫PCR方法敏感性研究

目的从3种PCR方法中选择出一种检测卡氏肺孢子虫(Pc)敏感性最高的PCR方法,供以后的实验中应用。方法Wistar大鼠30只,皮下注射地塞米松,每周二次,制备PCP动物模型,8周后全部剖杀作大鼠肺印片,六亚甲基四胺银染色。各鼠取肺组织02g,均浆后提取DNA,用三种PCR方法作PCR试验。选取六亚甲基四胺银染色和三种PCR检测均为阳性的大鼠DNA标本20份,对每份标本作对倍稀释1/2、1/4、1/8、1/16……至1/2048,同时用三种PCR方法做扩增试验直到某一稀释度时PCR试验阴性为止,选择出最为敏感的一组PCR方法,并做统计学分析。结果三种方法最低稀释度的均数DHFR-PCT为1/7879±174;TS-PCR为1/4371±207;MT-PCR为1/10975±136。结论三种检测Pc的PCR方法中以MT-PCR方法最为敏感。     

PCR-ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA的研究

目的　建立卡氏肺孢子虫 (P.c )DNA的聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)方法 ,并探讨其应用价值。　方法　实验组患卡氏肺孢子虫肺炎的SD大鼠和Wistar大鼠各 2 8只 ,采用PCR法扩增大鼠肺组织DNA和支气管肺泡灌洗液 (BALF)DNA ,用PCR ELISA检测其扩增产物。 2 8只患病大鼠分别制作肺组织印片及BALF涂片 ,姬姆萨 (Giemsa)染色镜检 10 0个视野中有无P .c包囊 (或滋养体 ) ,与PCR ELISA检测扩增产物结果比较。　结果　两种方法检测大鼠肺组织DNA阳性率及BALFDNA阳性率 ,结果相同 ,均分别为 96.4% (27/28)和100% (28/28)。Giemsa染色镜检P.c包囊 (或滋养体 ) ,结果为阳性的大鼠 ,PCR ELISA检测扩增产物结果也均为阳性。阴性对照组 ,两种大鼠的肺组织和BALF各10份标本 ,均有1只大鼠阳性。　结论　PCR ELISA检测大鼠卡氏肺孢子虫DNA ,敏感性较高 ,特异性较好 ,操作简便 ,具有实用价值。     

Real-time polymerase chain reaction for microbiological diagnosis of parapneumonic effusions in Canadian children

BACKGROUND:

Community-acquired pneumonia (CAP) complicated by parapneumonic effusion/empyema is an infectious syndrome commonly encountered by physicians caring for children in Canada.

OBJECTIVE:

To investigate the incremental benefit of novel molecular testing for the microbiological diagnosis of pediatric CAP complicated by parapneumonic effusion/empyema in Canada.

METHODS:

A convenience sample of pleural fluid from 56 children who had been admitted to hospital in Ontario with CAP complicated by parapneumonic effusion between 2009 and 2011 was examined. Multiple uniplex real-time polymerase chain reaction (PCR) testing was performed on these pleural fluids and compared with traditional culture-based testing of blood and pleural fluid samples.

RESULTS:

Molecular methods detected a pathogen in 82% of cases, whereas traditional cultures of blood and pleural fluids detected a pathogen in only 25%. The majority of parapneumonic effusions were associated with pneumococcal infection; Streptococcus pneumoniae was detected in 62% of the samples using molecular methods but in only 14% of samples using culture-based methods. Streptococcus pyogenes, detected in 16% of samples using PCR, was the second most common pathogen found. No patients were found to have empyema caused by Staphylococcus aureus.

DISCUSSION:

The results showed that multiple uniplex real-time PCR performed substantially better than traditional culture methods for microbiological diagnosis of CAP complicated by effusion/ empyema. S pneumoniae and S pyogenes were found to be responsible for the majority of infections. The approach detected pathogens in a similar proportion of pleural fluid samples as previously reported nested PCR assays; furthermore, the real-time closed-well approach also minimized the risk of nonspecificity due to cross-contamination relative to nested PCR.

CONCLUSIONS:

Real-time PCR for the detection of bacterial DNA in pleural fluids has the potential to better define the microbiological cause of pediatric CAP. This approach could help clinicians provide targeted antimicrobial therapy.     

青蒿素衍生物对卡氏肺孢子虫基因的影响

目的　研究双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯对卡氏肺孢子虫 5SrRNA基因、线粒体rRNA大亚基基因 (mtLSUrRNA)、胸腺嘧啶核苷酸合成酶 (TS)基因的影响。方法　以上述 3种药物治疗实验大鼠肺孢子虫肺炎 ,治疗结束后收集鼠肺 ,以酚 -氯仿抽提法抽提肺总DNA。以PCR方法扩增肺孢子虫的上述 3基因 ,以双脱氧末端终止法测定PCR产物的核苷酸序列 ,并研究双氢青蒿素对基因序列的影响。结果　 3种药物作用过的虫体均未见TS基因扩增产物 ,部分虫体无 5SrRNA基因、mtLSUrRNA基因扩增产物。经双氢青蒿素作用过的与正常肺孢子虫的 5SrRNA基因、mtLSUrRNA基因分别有16 5 %、15 .2 %序列差异。结论 3种青蒿素衍生物可破坏肺孢子虫TS基因。双氢青蒿素可致 5SrRNA基因、mtLSUrRNA基因序列发生变异     

卡氏肺孢子虫超微结构观察

目的 观察Wistar大鼠肺组织中卡氏肺孢子虫生长发育的超微结构。 方法 45只雌性Wistar大鼠随机分为2组，实验组（35只）每周2次经皮下注射地塞米松（1mg/次），对照组（10只）不作处理同步饲养。分别于首次注射地塞米松后第1～10周内，每周取两组鼠肺组织，电镜下观察卡氏肺孢子虫的感染情况及其生长发育的超微结构。 结果 电镜下观察，卡氏肺孢子虫虫体主要寄生于Wistar大鼠肺泡腔内，也见于肺泡膈、肺巨噬细胞和中性粒细胞，虫体表面有管状突起，内含细胞核、线粒体、空泡、粗面内质网和丰富的核糖体。许多卡氏肺孢子虫滋养体附着于肺Ⅰ型上皮细胞，偶见附着于肺Ⅱ型上皮细胞，有的伸出1或多个较宽大的伪足，部分细胞质内发现核相关细胞器和纺锤微管。囊前期有早、中、晚3种类型，在其内发现代表减数分裂的联会复合体。包囊壁上有一增厚处，内有一孔隙。 结论 卡氏肺孢子虫生活史由滋养体、囊前期和包囊等构成，包囊壁增厚处孔隙的存在提示为囊内小体逸出的一种模式。     

卡氏肺孢子虫体外无细胞培养的建立

目的建立卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinli，Pc)的体外无细胞系培养体系。方法建立Wistar大鼠卡氏肺孢子虫肺炎模型，Pereoll不连续密度梯度离心方法分离、纯化卡氏肺孢子虫。用添加s-腺苷甲硫氨酸(SAM)、N-乙酰氨基葡萄糖苷、腐胺等辅助剂的IMDM培养基体外培养虫体，用四胺银染色和姬姆萨染色方法计数虫体生长增殖情况，并以透射电镜观察培养虫体的超微结构形态。结果添加s-腺苷甲硫氨酸(SAM)等辅助剂的IMDM培养基(在37℃，pH8．0，5％CO2、95％O2条件)能支持Pc的体外生长。Pc包囊原代培养10天可增殖8～9倍，滋养体可增殖11～12倍。原代与传代培养、新鲜分离的与冻存复苏的虫体在培养基内的生长增殖有差别。结论建立了一个比较稳定的Pc体外无细胞系培养体系。