抗B7-H4-scFv / PE38KDEL 重组免疫毒素的表达和功能性检测

目的:构建基于抗B7-H4 单链抗体(scFv)的重组毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,检测毒素蛋白的抗肿瘤作用。方法:通过重叠延伸PCR(SOE-PCR )技术将anti-B7-H4-scFv 基因和毒素PE38KDEL 基因进行连接,重组基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达,蛋白经变复性和镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化后进行Western blot 鉴定;间接ELISA 和流式分析技术进行特异性鉴定。利用MTT 法和皮下移植瘤模型实验,检测毒素对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。结果:酶联后得到重组表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,纯化后的毒素蛋白对肿瘤细胞具有一定杀伤力,并且在肿瘤模型实验中能抑制体内肿瘤的生长。结论:成功构建了基于抗B7-H4 单链抗体的重组毒素表达体系,经鉴定重组毒素蛋白有良好的生物学功能活性和抗肿瘤活性。     

重组单链Fv段融合TNFα(mscFv25-TNFα)的导向治疗

目的 希望能得到具有临床应用价值的抗肝癌重组单链Ｆv段－免疫毒素。方法 将抗肝癌重组单链Ｆv段－免疫毒素mscFv25-TNFα在大肠杆菌ＪＭ１０９中以ＩＰＴＧ诱导进行表达。将包涵体形式的表达与产物溶解和折叠后,以GST亲合层析色谱纯化。用间接免疫荧光染色测定纯化后目的蛋白的活性。MTT试验鉴定 mscFv25-TNFα对靶细胞SMMC－7721的杀伤活性。通过对荷肝癌（SMMC－7721）裸鼠进行体内初步抑瘤实验。检测mscFv25-TNFα的导向治疗的效果。结果 纯化的目的蛋白间接免疫荧光染色呈阳性,MTT实验提示,在放线菌素D存在的情况下,体外mscFv25-TNFα对靶细胞SMMC－7721具有细胞毒作用。实验组14只裸鼠中4只的移植瘤的生长完全得到抑制,而TNFα对照组无完缓解。结论 间接免疫荧光染色表明,mscFv25-TNFα的特异性和亲和力与亲本抗体HBb25相比较没有明显下降。荷肝癌裸鼠体内的抑瘤实验显示,mscFv25-TNFα对荷肝癌裸鼠体内直径2－4mm左右的肿瘤具有一定的杀伤作用,初步证明mscFv25-TNFα具有一定的临床应用潜力。     

单克隆抗体在导向药物中的应用

单克隆抗体导向药物用于治疗已经取得了令人振奋的成果，为了改进以单克隆抗体携带免疫毒素（Immunotoxins,ITs)治疗的缺点，人们做了许多不懈的努力。本文将单抗导向药物近些年的发展情况作以概括，简述了它们的功能特点及发展前沿。     

单克隆抗体在导向药物中的应用

单克隆抗体导向药物用于治疗已经取得了令人振奋的成果 ,为了改进以单克隆抗体携带免疫毒素(Immunotoxins ,ITs)治疗的缺点 ,人们做了许多不懈的努力。本文将单抗导向药物近些年的发展情况作以概括 ,简述了它们的功能特点及发展前沿     

新型重组免疫毒素DT390-mRantes治疗小鼠EAE的初步研究

目的:构建一种含有重组免疫毒素DT390-mRantes(白喉杆菌外毒素390片段-活化T细胞表达与分泌调节因子)的真核表达质粒,并用于治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。方法:利用自提的MBP诱导C57BL/6小鼠产生EAE,将mRantes导入含有DT390的真核表达质粒SRα中,经阳离子纳米脂质体包被后,治疗小鼠EAE,同时对其临床症状、脑部病理改变、外周血相关细胞因子及T/B细胞比例进行检测,了解该重组免疫毒素的治疗效果。结果:成功构建真核表达质粒DT390-mRantes-SRα,治疗组小鼠临床症状减轻,脑部特异性淋巴细胞浸润减少,外周T细胞相关细胞因子表达降低,T/B细胞比例降低。结论:新型重组免疫毒素DT390-mRantes治疗小鼠EAE有较为明显的效果,为治疗人的多发性硬化(MS)提供有益的借鉴。     

073 单克隆抗体在导向药物中的应用

单克隆抗体导向药物用于治疗已经取得了令人振奋的成果，为了改进以单克隆抗体携带免疫毒素(Immunotoxins，ITs)治疗的缺点，人们做了许多不懈的努力。本文将单抗导向药物近些年的发展情况作以概括，简述了它们的功能特点及发展前沿。     

人表皮生长因子—PE40重组毒素的构建

用ＰＣＲ方法扩增人表皮生长因子（ＥＧＦ）片段，并将其与绿脓杆菌外毒素（ＰＥ４０）片段分别插入质粒ｐＥＴ－１７ｂ中，经酶切分析和ＰＣＲ检测证明成功地构建了表达质粒ｐＥＧＦ４０，旨在表达一种对癌细胞有特异杀伤作用的融合蛋白，以探索其作为新型导向药物的可能性。     

抗胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40的GST融合表达

目的：以GST融合蛋白的形式表达SZ39（ScFv)-PE40，为抗胶质瘤重组免疫毒素的下游研究与开发准备一条可供选择的路径。方法：将已构建的SZ39（ScFv)-PE40基因克隆入大肠杆菌GST融合表达载体pGEX-5X-1中，并在大肠杆菌BL21（DE3）中以IPTG诱导表达。结果：SDS－PAGE分析显示表达产物以包涵体形式存在，分子质量为95000u左右，与融合蛋白GST－SZ39（ScFv)-PE40的分子质量理论推算值相符；Western blot证实在相应的分子质量处出现特异性显色印迹；凝胶灰度扫描显示其表达量约占菌体总蛋白的25％。结论：重组免疫毒素SZ39（ScFv)-PE40也可以与GST融合表达的形式在大肠杆菌中高效表达。     

大鼠IP-10-PE38 KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达

目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况.方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PTKL459K-IL-4-PT38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1( )-rIP-10-PE38KDEL.重组质粒经限制性性内切酶,PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH 3T3细胞的表达.结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆人真核表达质粒载体pcDNA3.1( ),免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH 3T3细胞表达.结论 rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH 3T3细胞中表达,为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础.     

重组免疫毒素的纯化及鉴定

目的构建能特异性杀伤银屑病皮损中T淋巴细胞的重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1。方法应用PCR扩增目的基因片段hIL2-Luffin P1,然后克隆到表达载体pET32a(+)中,并对重组质粒进行酶切鉴定及基因测序。测序正确的重组质粒转化到表达菌BL21中,进行诱导表达。诱导表达正确的蛋白,经过蛋白的纯化、复性、脱盐、肠激酶酶切、再纯化,最后用兔抗人IL-2多克隆抗体对目的蛋白进行Western blot鉴定。结果构建了pET32a(+)-hIL-2-Luffin P1表达载体。最后得到了表达正确的hIL2-Luffin P1蛋白。结论重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1的成功构建为银屑病的治疗奠定了实验基础。     

用于肿瘤靶向治疗的EGF-IL-18融合蛋白在昆虫细胞中的表达及活性鉴定

目的：制备能用于肿瘤靶向治疗的重组表皮生长因子受体干扰序列-白细胞介素18(EGF-IL-18)融合蛋白，并鉴定其生物学活性。方法：利用Bac-to-Bae表达系统在昆虫细胞Sf9中表达融合蛋白，用离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等方法纯化表达产物，并以IFN-γ诱导实验和EGFR竞争结合实验初步评价融合蛋白的生物活性。结果：经SDS-PAGE和Westem blot检测，Sf9细胞中表达的重组蛋白与预期的EGF-IL-18融合蛋白分子量一致，纯化后融合蛋白具有较高纯度和良好的免疫原性。IFN-γ诱导实验和EGFR竞争结合实验显示，该融合蛋白具有肿瘤导向性和抗肿瘤活性。结论：成功表达并纯化了具有肿瘤导向性的抗肿瘤蛋白——EGF-IL-18融合蛋白，该蛋白具有较好的肿瘤导向性和抗肿瘤活性，可用于肿瘤的生物治疗研究。     

Cell type specific and inducible promoters for vectors in gene therapy as an approach for cell targeting

Gene therapy is used to correct genetic defects or to deliver new therapeutic functions to the target cells. Viral vectors are employed mainly as a gene delivery system. A great variety of viral expression systems have been developed and assessed for their ability to transfer genes into somatic cells. In particular, retroviral and adenoviral mediated gene transfer have been extensively studied and improved. Preclinical and clinical studies covering a large range of genetic disorders are currently underway to solve basic issues dealing with gene transfer efficiencies, regulation of gene expression, and potential risks of the use of viral vectors. The majority of clinical gene therapy trials that employ viral vectors perform ex vivo gene transfer into target cells. The main issue in potential clinical application of gene therapy is the need for increased gene transfer efficiency and target specificity associated with regulated gene expression at therapeutically relevant levels in vivo. Gene regulatory elements, such as promoters and enhancers, possess cell type specific activities and can be activated by certain induction factors (e.g., hormones, growth factors, cytokines, cytostatics, irradiation, heat shock) via responsive elements. A controlled and restricted expression of these genes can be achieved using such regulatory elements as internal promoters to drive the expression of therapeutic genes in viral vector constructs. In addition to high level and efficient gene expression, minimizing or excluding inappropriate gene expression in surrounding nontarget cells is of great importance for numerous gene therapeutic approaches. This contribution furnishes insight into the field of cell type specific promoter and enhancer systems which have been used for targeted and inducible expression of therapeutic genes in certain genetic disorders, viral infections, and malignancies. We also discuss promoters that represent attractive candidates for the construction of viral vectors.Abbreviations ADA Adenosine deaminase - AFP -Fetoprotein - AIDS Acquired immunodeficiency syndrome - CAT Chloramphenicol acetyltransferase - CD Cytosine deaminase - CEA Carcinoembryonic antigen - DMD Duchenne muscular dystrophy - 5-FC 5-Fluorocytosine - HIV Human immunodeficiency virus - LAD Leukocyte adherence deficiency - LCR Locus control region - LTR Long terminal repeats - MCK Muscle creatinine kinase - MLV Moloney murine leukemia virus - MMTV Mouse mammary tumor virus - PEPCK Phosphoenolpyruvate carboxykinase - PSA Prostate-specific antigen - SCLC Small cell lung cancer cells - SLPI Secretory leukoprotease inhibitor - SPA/B/C Human surfactant protein A/B/C - TAR Trans-activation-responsive - TNF Tumor necrosis factor-     

Cytotoxicity against human peripheral blood mononuclear cells and T cell lines mediated by anti-T cell immunotoxins in the absence of added potentiator.

Several in vitro assays have indicated that anti-T cell immunotoxins (IT), composed of monoclonal antibodies (MoAbs) conjugated to ricin A chain (RTA), are maximally effective against T cells only in the presence of potentiators. It was thought that such IT might not be sufficiently cytotoxic to deplete T cells in vivo upon administration to patients. Therefore, we have re-evaluated the in vitro assays and report herein that even with a short exposure time (2 h), the two anti-T cell IT, H65-RTA (anti-CD5 MoAb coupled to RTA) and 4MRTA (anti-CD7 MoAb coupled to RTA30), were specifically cytotoxic for peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in the absence of potentiators. Moreover, as has been reported for IT when tested against T cell lines, prolonging the exposure time of the IT with PBMC from 2 h to as long as 90 h, without added potentiators, enhanced their cytotoxicity from 2- to 40-fold. In contrast, most T cell lines were more sensitive to IT in the presence of potentiator, and IT cytotoxicity was much less enhanced by prolonging the exposure time. Thus, T cell lines may not serve as accurate models to determine the efficacy of IT against PBMC in vitro or in vivo. We conclude that IT-induced cytotoxicity of PBMC can be demonstrated in vitro at pharmacologically achievable concentrations in the absence of added potentiators.     

rhIL-2与阿霉素白蛋白磁微球靶向治疗肿瘤的协同作用

目的：观察重组人白细胞介素-2(rhIL-2)瘤内注射和阿霉素白蛋白磁微球(ADM-MAM)联合外磁场联合治疗H22荷瘤小鼠的协同作用，并探讨其抗肿瘤作用机制。方法：以荷瘤小鼠的瘤重为指标，观察药物的抗肿瘤活性。以乳酸脱氢酶释放法测NK细胞的杀伤活性。以MTT比色法测淋巴细胞的转化率。以流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡及p53、Fas和FasL的表达。用RT—PCR法测定IL—2及IL—12的表达。探讨抗肿瘤机制。结果：ADM—MAM靶向治疗与rhIL—2联用，可显著减小荷瘤小鼠的瘤重；提高NK细胞的杀伤活性和脾脏淋巴细胞的转化率；减小肿瘤细胞的增殖指数，上调肿瘤细胞p53、Fas和FasL的表达，以及增加脾脏淋巴细胞上IL—2及IL—12的表达。结论：ADM—MAM联合外磁场，具有显著增强抑瘤的作用。rhIL—2能增强ADM—MAM靶向治疗的抗肿瘤作用，其抗肿瘤协同作用主要是通过促进T细胞增殖，刺激NK细胞增长等提高机体的免疫功能而实现的。     

重组人白细胞介素-10诱导瘤细胞凋亡

目的 研究重组人白细胞介素-10诱导瘤细胞凋亡的作用。方法利用基因工程技术制备的rhIL-10,分别作用于体外培养的ScaBer、NCIS446、U937瘤细胞,观察瘤细胞的形态改变,MTT法检测rhIL-10对瘤细胞增殖的抑制作用,电泳观察rhIL-10诱导瘤细胞凋亡的情况,TUNEL法检测瘤细胞凋亡百分率。结果电泳出现典型的DNA“lader”,ScaBe,、NCIS446、U937三种瘤细胞的凋亡率为48．5％、45．6％、47．1％,IC50分别为0．043、0．052、0．058mg／mL。结论rhIL-10具有显著抑制瘤细胞生长活性、诱导瘤细胞凋亡的作用。     

静磁场靶向药物递送系统在肿瘤诊疗中的研究进展

化疗是治疗肿瘤的传统手段之一,但其具有组织非特异性,在抑制肿瘤细胞生长的同时也会对正常细胞产生毒副作用.磁靶向药物递送系统可通过具有生物相容性的、稳定的磁性纳米颗粒载体将抗癌药物在外磁场的引导下,靶向运输和浓聚在肿瘤组织.该技术不仅提高了药物运输的效率和药物的抗癌活性,还能降低药物用量和减轻毒副作用.载药磁性纳米颗粒和所应用的外磁场的性质是影响磁性纳米颗粒靶向肿瘤组织的重要影响因素.载药磁性纳米颗粒的靶向递送是否有效,主要依赖靶向目标位置处所应用的磁场和磁场强度是否足够吸引束缚载药磁性纳米颗粒在肿瘤组织中停留以及释放.对静磁场在引导磁性纳米颗粒靶向肿瘤组织研究的新进展进行综述,为静磁场在靶向肿瘤治疗方面提供一定的科研基础支持.     

双歧杆菌在肿瘤治疗中的应用

双歧杆菌作为机体肠道内数量占绝对优势的生理性菌群，对维持机体的健康发挥重要的功能。双歧杆菌能够刺激机体的免疫器官且自身具有抗肿瘤活性。此外，双歧杆菌专性厌氧的特性使其在肿瘤的基因治疗中起重要的作用。     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性及体内抗肿瘤研究

目的 :研究感染hIL 2重组病毒的人肺腺癌细胞 (Anip973)的体外生物学特性及小鼠体内抗肿瘤作用。方法 :将携带有hIL 2基因的重组腺病毒 (rAd hIL 2 )感染人肺腺癌细胞系 ,通过细胞生长实验、克隆形成实验等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用 ;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL 2的分泌量 ;通过肿瘤局部注射rAd hIL 2的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果 :rAd hIL 2经扩增、纯化后 ,滴度可达 10 1 0 PFU ml,当病毒量为30MOI时 ,对Anip973细胞的转染率达 90 %以上。转染的Anip973肿瘤细胞其生长能力、克隆形成率等无明显变化。 2 4小时细胞培养上清IL 2的分泌量为 2 0pg 1ml 2× 10 5细胞。体内实验表明注射rAd hIL 2的小鼠肿瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组 (P <0 0 5 ) ,生存期显著延长。结论 :腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2转染的Anip973肿瘤细胞体外生物学特性未见明显变化 ,而体内实验则有明显的抗肿瘤作用。