家族性高胆固醇血症三个家系的基因测序研究

目的 检测3个家族性高胆固醇血症（fmilial hypercholesterolemia,FH)家系的基因突变位点，评价双脱氧链终止基因测序法诊断FH的价值。方法 应用双脱氧链终止基因测序法对各样本DNA进行低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor,LDLR)基因测序。结果 临床诊断3个家系43例中纯合子FH5例，杂合子FH者10例，正常28例；对照组30例，LDLR基因测序发现三个突变位点：Exon10TGG1448TAG(Trp-Stop),Exonll ATG1592AAG(Met-Lys),Exon4GAG683GCG(Glu-Ala)；后两者为首次发现，临床判断和基因测序结果69例一致。符合率为94.5%。对于4例不一致的结果，分析认为基因测序结果更合理。结论 双脱氧链终止基因测序法对LDLR基因进行突变的检测是确诊家族性高胆固醇血症的有效方法。     

家族性肥厚型心肌病致病基因的筛查分析

目的鉴定一个肥厚型心肌病家系的致病基因。方法根据肥厚型心肌病（HCM）已知的13个致病基因，每个基因选取3个微卫星（Marker）标记对该家系进行筛查分析，对不能排除的基因采取PCR一直接测序技术进行鉴定。结果13个候选基因中仅CRP3不能被排除，测序未发现该基因外显子有任何突变。结论已知的13个肥厚型心肌病致病基因不是该汉族家系的致病基因，该HCM家系很可能由一新的致病基因突变所致。     

纤维蛋白原α链剪切位点IVS2＋1G〉C突变导致的遗传性低纤维蛋白原血症

目的：探讨遗传性低纤维蛋白原（Fg）血症的分子发病机制。方法：检测凝血指标以明确诊断；用DNA直接测序法对患者Fg基因FGA、FGB和FGG的所有外显子及其侧翼序列进行测序以寻找基因突变，对有突变的序列反向测序证实；通过逆转录结合巢式PCR扩增的方法，检测患者外周血中的Fg异位转录产物；构建含有突变点的突变型FGA小基因（minigene）质粒和野生型FGA小基因质粒，将2种质粒分别转染人胚肾（HEK）293T细胞，抽提RNA．逆转录PCR（RT—PCR）后TA克隆测序。结果：先证者呈FGA基因剪切位点IVS2＋1G〉C杂合突变；对于该突变，逆转录结合巢式PCR的产物经克隆后测序只检测到正常转录本，而没有发现异常转录本：突变型FGA小基因质粒转染HEK293T细胞后．抽提RNA再经RT-PCR、TA克隆、测序，揭示剪接过程中发生了FGA基因2号内含子滞留，导致终止密码的提前出现．从而使异常转录的mRNA在体内很快被降解。结论：异位转录结合体外表达证明先证者FGA基因剪切位点IVS2＋1G〉C突变导致异常转录mRNA在体内很快被降解，是先证者低Fg血症的原因之一。     

恶性疟原虫海南株CTP基因测序重组质粒及真核表达重组质粒的构建

目的　构建恶性疟原虫CTP基因的测序重组质粒和真核表达重组质粒 ,以便进一步研究CTP基因的结构与功能。方法　根据已发表恶性疟原虫CTP基因的序列〔1〕,设计并合成一对引物。将扩增的CTP基因的PCR产物连接于测序载体pUC19上 ,经测序反应确定无误。用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将CTP基因从测序载体中切下 ,构建于真核表达载体pcDNA3上。 结果　构建了恶性疟原虫CTP基因的测序重组质粒 ,并对其进行了测序。并将恶性疟原虫的CTP基因从测序重组质粒中切下 ,克隆进真核表达重组质粒 pcDNA3。 结论　成功地构建了恶性疟原虫CTP基因的测序重组质粒和真核表达重组质粒 ,为进一步研究其结构与功能奠定了基础     

几种PCR方法在狂犬病毒基因测序中的应用

目的本研究在狂犬病毒全基因测序中应用了RT—PCR法、递减PCR法、嵌套PCR3-法及3’-Full RACE等方法，有效的解决了狂犬病毒在体外扩增时遇到的困难。成功地获得了狂犬病毒野毒株BRV的全基因的eDNA，为实现基因测序及下一步研究工作奠定了理论技术基础。     

华支睾吸虫成虫全长基因表达文库的构建和基因表达谱的建立

目的 获得尽可能多的华支睾吸虫UNIGENE及全长基因，建立成虫基因表达谱，为华支睾吸虫发育过程中基因表达的规律和功能基因组学研究奠定基础。方法 构建pBlueseript Ⅱ SK全长cDNA质粒文库，先对5’端进行随机EST大量测序，生物信患分析后归并UNIGENE，并对归并的结果进行了3’端的序列测定，根据3’端测序结果，再次进行UNIGENRE归并，对能够拼按上的克隆进行了序列拼接。对预测为完整基因且未测通的序列，进行了引物设计，walking反应测序，将得到的UNIGENE用点样法制备基因芯片。结果 获得5’端有效EST序列4066个，测序结果UNIGENE分析，归并获得1775个UNIGENE，5’端预测的全长基因为377个。共获得测通的cDNA序列277个，其中全长基因198个。目前制备的华支睾成虫基因表达谱芯片含有1775个基因。结论 所构建的华支睾吸虫成虫全长cDNA文库质量较好，采用的技术路线获取全长基因建立基因表达谱的效率较高。     

野生型产气荚膜梭菌β毒素基因的克隆与分析

用多联PCR方法对从猪舍污水中分离的细菌进行鉴定，获得1株B型和1株C型产气荚膜梭菌，用PCR方法扩增了β毒素基因并进行了测序，获得了包括RBS、信号肽基因和全长成熟肽基因以及部分3′末端序列的β毒素基因；测序后与GenBank中B、C型菌β毒素基因进行比较。野生B、C型菌与二者的同源性分别达到99％以上，氨基酸同源性也在99％以上。     

SCN5A基因移码突变导致Brugada综合征

目的：检测Brugada综合征的致病基因突变位点。方法：对1个Brugada综合征家系11名成员和20名正常人的DNA样本应用双脱氧链终止基因测序法进行心脏钠离子通道α亚单位（voltage-gated sodium channel type V,SCN5A)基因测序。结果：SCN5A基因测序发现Brugada综合征家系第22个外显子存在1个杂合基因移码突变位点，经克隆传代后测序发现该突变为4087insC。该突变使通道蛋白1314－1317位氨基酸发生改变并在1318位终止，导致钠离子通道第3结构域S4结构变化，S5－6及第4结构域全部缺失。该突变在Brugada综合征家系中分布符合常染色体显性分布规律。对照组未发现相同突变。结论：SCN5A基因4087insC是国内首次发现的导致Brugada 综合征的基因突变位点，也是国际上发现的第2个引起Brugada综合征的SCN5A基因移码突变     

人腺病毒3型六邻体基因的克隆与鉴定

目的 克隆人腺病毒3型(Ad3)六邻体-L1(Hexon-L1)、六邻体-L2(Hexon-L2)区基因，构建含有该基因的重组质粒，并进行测序鉴定，为进一步构建表达载体，制备基因工程疫苗打下基础。方法 从Ad3感染的HeLa细胞中提取Ad3DNA，用PCR方法扩增Hexon—L1、Hexon-L2基因，将得到的片段定向克隆到克隆载体pUC19质粒中，对克隆片段进行DNA测序鉴定。结果 构建了重组质粒pUC19Hexon，测序结果与Genebank中该序列进行同源性比较证明克隆的片段为。Ad3六邻体序列。结论 成功克隆了Ad3的Hexon-L1、Hexon-L2区基因。     

冠心病患者甲硫氨酸合成酶基因部分片段突变的研究

选择冠心病患者甲硫氨酸合成酶（MS）基因上与蛋白质功能和结构有关的一个片段，应用多聚酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术结合测序法测序。结果显示，在研究对象中未发现目的片段上的突变。与Genbank中MS基因cDNA相应部位的充阢一致，证实为正常基因型。提示我国MS基因此片段可能突变较少，与冠心病关系不大。     

一个常染色体显性遗传性垂体性尿崩症家系AVP-NPⅡ基因的连锁和突变分析

目的 寻找中国人常染色体显性遗传性垂体性尿崩症（autosomal dominant neumhypophyseal diabetesinsipidus，ADNDⅠ）的致病基因。方法 采集ADNDⅠ家系，抽提基因组DNA，对AVP-NPⅡ基因进行微卫星标记（STR）连锁分析和PCR直接测序。结果 连锁分析结果显示，AVP-NPⅡ基因位点与ADNDⅠ表型连锁，但PCR产物直接测序未发现任何碱基的改变。结论 推测ADNDⅠ存在遗传多样性，很可能有其他致病基因突变影响机体正常水代谢，导致ADNDⅠ的发生。     

男性不育患者不育相关基因检测结果分析（附63例报告）

目的 探讨男性不育相关基因检测对不育原因的诊断价值，为助孕或使用供精提供理论依据。方法 收集男性不育患者血液样本并提取其中的DNA进行检测，经过片段化处理、末端修补、3’端加A、接头连接及扩增纯化等方法构建全基因组文库，并从中捕获、富集靶基因片段，构建靶基因文库。采用Illumina高通量测序平台对靶基因文库进行高通量测序。将测序数据与人类基因组GRCh37/hg19参考序列进行比对，筛选出相关变异。基因检测结果阳性代表本次检测检出已知的致病性或疑似致病变异，对判定为阳性的变异位点进行一代测序验证。结果 共检出6个基因9个变异位点为疑似致病突变或致病突变，因精液常规畸形率异常行基因检测的43例中有7例检出阳性基因（16.28%），其中因圆头精子症行检测的8例中检出3例（37.50%），非圆头精子症的35例中检出4例（11.43%），而因胚胎因素行基因检测的20例中有3例检出阳性基因（15.00%）。结论 在不育男性中行不育相关基因检测可发现遗传学因素导致不育的原因，可为进一步遗传咨询，包括继续常规助孕或使用供精提供理论依据。     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果获得了1个日本血吸虫新基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子质量为7．2198ku，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

Glu^47缺失造成的常染色体显性遗传垂体性尿崩症的家系分析

目的寻找常染色体显性遗传垂体性尿崩症（ADNDI）的基因突变位点。方法在一临床确诊的ADNDI家系，提取外周血的基因组DNA，PCR扩增精氨酸加压素前体基因（AVP－NPⅡ），并进行全长测序，亚克隆测序确认突变位点。结果本家系中所有患者在AVP－NPⅡ基因2号外显子的1824－1829位AGGAGG存在一个AGG密码子的缺失，而其他表型正常的成员测序结果正常。结论AVP－NPⅡ基因1824-1829位AGGAGG中的一个AGG的缺失导致NPⅡ第47位谷氨酸（Glu）的缺失，可能影响NPⅡ蛋白对AVP的运输，进一步造成AVP降解增加，发生尿崩症。     

胃癌细胞中与端粒酶活性负相关的基因克隆

目的 探讨人胃癌细胞活性经过端粒酶RNA干涉后基因片段的差异表达以及对其进行克隆和测序。方法 通过荧光差异显示获得DNA，经过PCR扩增、DNA克隆，对制备的质粒DNA酶切产物进行鉴定及序列分析。结果 以端粒酶RNA干涉的真核细胞表达载体转染两种胃癌细胞系，均检测到一些基因的表达发生改变；对其中4个片段进行了测序，有2个是癌发生相关基因。结论 RNA干涉后人胃癌细胞基因发生变化，活性下降，RNA干涉可用于肿瘤基因治疗。     

利用pcDNA3．1／TOPOC TA克隆构建ANNEXIN A2基因的真核表达载体

目的克隆人类ANNEXIN A2基因，构建其正义真核表达质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术，从人类正常肺组织中扩增出人类ANNEXIN A2基因的完整编码区全长序列。通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1／TOPO TA真核表达载体上，构建出人类ANNEXIN A2基因正义表达质粒。通过DNA测序方法对重组表达质粒进行鉴定。结果通过测序分析证实，构建的重组表达质粒目的基因片段为人类ANNEXIN A2基因的完整编码区1032bp。结论构建真核表达载体的方法快速简便．适于进一步研究基因的细胞生物学作用。     

91例以单纯性黄疸为表现的不明原因肝病患者病因谱及临床特征分析

目的 分析表现为单纯性黄疸的不明原因肝病患者的病因和临床特征，以及全外显子测序对该类疾病的诊断价值。方法 回顾性分析2017年2月—2021年12月因不明原因肝病于南京市第二医院就诊并且进行全外显子基因测序患者的临床资料，根据肝功能指标及影像学资料将所有病例进行临床表型归类，结合全外显子基因测序报告作出诊断。非正态分布的计量资料两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。结果 全外显子基因测序病例共519例，排除临床资料缺失或不完整病例102例，纳入417例患者，其中以单纯性黄疸为表现的患者有91例(21.82%,91/417)。通过全外显子基因测序仍无法明确黄疸升高病因者8例(8.79%,8/91)。结合基因检测结果报告分析，83例(91.21%,83/91)患者明确诊断，其中包括遗传性高胆红素血症68例(74.73%,68/91)、遗传性球形红细胞增多症3例(3.30%,3/91)、丙酮酸激酶缺乏症2例(2.20%,2/91)以及UGT1A1基因病合并其他疾病10例(10/91,10.99%)。遗传性高胆红素血症为主要病因，其...     

新疆细粒棘球蚴95基因的克隆及同源性分析

目的：分析新疆地区细粒棘球蚴95（EG95）基因结构特点。方法：从新疆地区细粒棘球蚴原头节中提取基因组DNA，以细粒棘球蚴原头节DNA为模板进行PCR扩增，获得EG95基因，将其克隆至pUCm-T载体，利用DNAman软件及GeneBank/BLAST功能测序并进行基因全序列分析。结果：测序显示新疆株EG95(EG95-XJ)基因片段为1191bp。BLAST比对分析表明EG95-XJ基因与新西兰株EG95基因家族成员同源性达86％-97％，所有的碱基差异均发生于内含子区域。结论：中国新疆地区的EG95基因为EG95基因家族成员之一，但其序列与新西兰株EG95基因之间存在一定的差异。     

弓形虫P30与佐剂CTA2／B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析

目的 构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2／B复合基因的克隆载体及酵母表达载体，为进一步真核表达重组P30CTx蛋白奠定基础。方法 PCR扩增P30-CTX复合基因，产物回收后与pMD-18T载体连接，转化大肠埃希菌DH5a，经氨苄抗性筛选及测序，建立克隆载体pMD18T-P30-CTX；克隆载体与表达载体双酶切后，回收1313bp的P30-CTx基因，亚克隆入酵母表达载体，转化大肠埃希菌DH5a，筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZaA-P30-CTX。重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定。使用生物信息软件分析P30-CTx复合基因，预测编码蛋白结构。结果 重组质粒经PCR可得1313bp的特异条带，EcoRⅠ、xbaⅠ双酶切获得l313bp和3085bp的条带，与预期大小一致，测序结果证实为pGAP-P30～CTX基因，序列分析同源性为99．82％，P30～CTX蛋白结构折叠无明显改变。结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原：P30与免疫佐剂CTA2／B复合基因的克隆载体及酵母表达载体，预测毕赤酵母表达系统对P30-CTX的抗原性不会产生影响。     

日本血吸虫cDNA文库中抗卵分子克隆的免疫筛选及鉴定

本文采用具有明显抗卵胚发育和抗雌虫生殖双重作用的免疫血清对SjcDNA文库进行免疫筛选，共鉴定阳性克隆102个，进一步复筛后对其中6个克隆以自动DNA测序仪对。DNA插入子测序，测序资料经基因数据库GCG软件处理。表明C40克隆类似于Sm铁蛋白基因，C31克隆类似于N.forntalis的PEPCK酶基因．C21为Sj热休克蛋白70基因，C29为副肌球蛋白基因，C30和C35克隆分别为印壳蛋白基因和钙网硬蛋白基因·上述6个基因克隆的同源程度分别为74．7％、57．1％、80．1％、86．4％、96．4％和80．6％。