人下颌下腺干/祖细胞的分离及培养

背景:近年来国内外学者研究证实了唾液腺组织中的确存在一类具有成体干细胞特性的唾液腺细胞,但是这类干细胞的研究多集中在动物的唾液腺,而人类唾液腺干细胞的生物学特征研究较少.目的:体外分离、培养人唾液腺干/祖细胞,并观察其生物学特征.方法:从流产胎儿下颌下腺中分离、单克隆培养获得人唾液腺干/祖细胞,应用免疫荧光染色方法检测上皮细胞标志CK19,Laminin的表达,流式细胞术检测CD29,CD90.1和 CD117的表达.绘制人唾液腺干/祖细胞生长曲线,评价体外增殖能力.结果与结论:人唾液腺干/祖细胞胞浆表达上皮细胞标志CK19及Laminin;流式细胞术结果显示,CD90.1,CD29及CD117的表达率分别为99.69%,98.83%及67.27%;体外培养也表现出高增殖能力、克隆形成能力和较高的传代数等组织干细胞特性.提示人胎儿下颌下腺中能分离出具有组织干细胞特性的细胞.     

下颌下腺主导管结扎可激活损伤组织中的干/祖细胞

背景：成体干细胞的伦理学问题较少,而且某些操作技术比较成熟,利用成体干细胞进行组织工程化涎腺的构建具有十分诱人的吸引力和极其重要的应用前景。目的：建立下颌下腺主导管结扎的涎腺组织损伤大鼠模型,探讨涎腺组织损伤模型中成体干/祖细胞存在的可能性及可能位置。方法：SD大鼠统一行右侧下颌下腺主导管结扎,1周后处死大鼠取出两侧腺体,通过苏木精-伊红染色、PAS糖原染色及细胞角蛋白19、Bcl-2、Ki-67等指标的免疫组织化学测定,对正常涎腺组织与建立的损伤模型组织进行比较。结果与结论：同一只大鼠,结扎侧与对照侧体积、质量有明显的差异。对照侧下颌下腺组织呈卵圆形,色泽红润,表面光滑,有完整包膜,质地柔软;结扎后腺体萎缩,组织形态欠规整,色泽暗红,包膜充血,质地变韧,周围组织血管代偿性扩张。主导管结扎的组织损伤模型可导致PAS阳性腺细胞的消失和细胞角蛋白19阳性的小导管上皮细胞增殖,并有在未结扎的腺体中很少见到的小丛层粘连蛋白阳性细胞出现在导管周围,而抑制细胞凋亡的Bcl-2和提示增殖活跃度的Ki-67的表达均有所增强。可见下颌下腺组织中可能存在着定位于涎腺周围导管区的下颌下腺干/祖细胞;下颌下腺主导管结扎导致的组织损伤模型是一种能有效激活下颌下腺组织中干/祖细胞的方法。     

脐血干/祖细胞短期体外扩增后归巢相关粘附特性的研究

探讨体外扩增对脐血（UCB)造血干／祖细胞(HSPC)原有粘附功能的影响。将从新鲜UCB标本中纯化的CD34^ 细胞接种于无血清、无基质的悬浮扩增体系，分别于培养第7天、第10天和第14天从扩增产物中再次纯化CD34^ 细胞，比较扩增前后CD34^ 细胞表面VLA—4(CD49d)、VLA—5(CD49e)、LFA—l(CDlla)、L-selecin(CD62L)、PECAM—l(CD3l)、ICAM—l(CD54)和HCAM(CD44)等归巢相关粘附分子(SAMs)的表达情况，并检测CD34^ 细胞与纤连蛋白(FN)间的自发粘附率和基质细胞来源因子—l(SDF—1)诱导粘附率。①在第14天的培养扩增中，表达上述CAMs的各CD34^ 细胞亚群均有不同程度(15～72倍)的扩增；②扩增后CD34^ 细胞表面粘附分子CD44、CD11a、CD49e和CD49d的表达与原代CD34^ 细胞持平或高于培养开时水平，而CD62L、CD54和CD31的表达则有不同程度下调；③在前10d的扩增中，CD34^ 细胞与FN间的自发粘附率和SDF—l诱导粘附率均呈上升趋势。所建立的短期培养体系不仅可以支持表达重要CAMs的UCB CD34^ 细胞亚群的有效扩增，而且扩增后的HSPC总体上保持原有的粘附功能。     

脐血造血干/祖细胞的定量检测

脐血造血干细胞移植具有来源广泛、采集便利和移植后移植物抗宿主反应低等优点 ,目前国内已有单位在筹建脐血造血干细胞库。脐血中造血干细胞定量检测对于造血干细胞移植有重要的指导意义 ,由于各地的检测方法和实验条件不同 ,导致所得结果差异较大。本研究应用流式细胞仪 ( FCM) ,探讨 3种检测方法的优缺点 ,并对收集的 61 5份脐血进行造血干 /祖细胞定量检测 ,现报告如下。材料与方法1　仪器与试剂　 ACT diff血细胞计数仪 ( Coulter公司 ) ,FACSCalibur流式细胞仪 ( BD公司 )。CD34/CD38方案中 CD45抗体为 BD产品 ,其余为 Phar…     

微囊微环境体外扩增人脐血造血干/祖细胞

背景:由于单份脐血所含的造血细胞数量有限,目前只能用于儿童或低体质量成人血液病和急性辐射损伤等疾病患者,有效扩增脐血造血干,祖细胞已成为研究热点.目的:观察微囊微环境对脐血造血干,祖细胞扩增的影响,以及此过程中可否使造血干,祖细胞在扩增的同时仍维持其未分化状态.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-09在中国科学院大连化学物理研究所完成.材料:正常足月产新生儿脐带血由大连市妇产医院提供,提供者知情同意.方法:Ficoll法梯度分离人脐血单个核细胞,采用静电液滴法在生理条件下进行微囊化包封和体外培养.以同条件平面培养的脐血单个核细胞作为对照.主要观察指标:观察微囊化脐血细胞的生长特点及脐血细胞总数的变化;流式细胞仪检测培养过程中CD34+细胞扩增情况:应用甲基纤维素半固体培养法观察扩增细胞的集落形成能力.结果:脐血细胞在微胶囊内持续增殖,并以聚集成团的三维方式生长,两种培养方式对脐血细胞总数均无明显影响(P>0.05).对比CD34+细胞扩增和细胞集落的生成发现,微囊化培养脐血细胞的CD34+细胞数量和集落密度均在培养第6天达到高峰,明显高于平面培养3 d时所达到的峰值:之后逐渐下降,至12 d后平面培养细胞的CD34+细胞和集落形成能力几乎检测不到,而此时微囊化培养的CD34+细胞数量和集落密度仍与平面培养的扩增高峰相近.结论:微囊化培养能有效扩增人脐血造血干/祖细胞,并显著减缓造血干/祖细胞的分化进程,维持其多分化潜能,提示微囊为造血干/祖细胞维持未分化状态的扩增提供了特殊的微环境.     

体外长期培养对脐血造血干/祖细胞细胞周期及凋亡的影响

目前造血干细胞移植 (ＨＳＣＴ)已成为难治性血液病、免疫缺陷病及恶性肿瘤等的主要治疗手段。脐血是造血干 /祖细胞 (ＨＳＰＣ)的一种重要来源 ,由于单份脐血中细胞数量有限而限制了其临床应用 ,故脐血造血干 /祖细胞的体外扩增越来越引起人们的关注。我们观察了体外长期培养对脐血ＨＳＰＣ细胞周期及凋亡的影响 ,以了解脐血ＨＳＰＣ在体外扩增过程中某些生物学特性的变化。材料和方法1　脐血来源　 6份肝素抗凝脐血均来自我院妇产科健康产妇 ,采集量为 5 0～ 10 0ｍｌ,于采集后 4ｈ内分离单个核细胞(ＭＮＣ) ,洗涤 ,备用。2　ＣＤ3 4+细胞…     

裸鼠腹腔输注体外扩增人脐血干/祖细胞的研究

脐血由于来源广泛 ,采集方便 ,造血干 /祖细胞丰富 ,免疫活性低等优点已成为极有潜力的造血干细胞来源而用于临床。但由于单份脐血细胞绝对数量少 ,尚不能满足成人移植的需要 ,解决成人移植的关键问题是进行有效的脐血扩增和采用合适的植入方案以改善移植效率。我们以裸鼠作模型探讨扩增后脐血造血细胞经腹腔输注在体内的植入能力。材料和方法1　脐血　来自浙江大学医学院附属妇产科医院 ,排除ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ和梅毒感染的健康足月分娩产妇 ,无菌采集 ,肝素抗凝。采集后 4ｈ内用羟乙基淀粉 (ＨＥＳ)沉降法分离单个核细胞 (Ｍ…     

外周血造血干/祖细胞动员与采集时动态快速监测造血祖细胞的意义

为了获得高效的外周血干/祖细胞采集,探索一种简便、快速的外周血干/祖细胞监测方法，采用Sysmex XE-2100血细胞分析仪的幼稚细胞信号（IMI）检测通道识别和计数外周血造血祖细胞（HPC）。对25例行异基因外周血造血干细胞移植动员的供和11例自体外周血干细胞动员的患的外周血造血干/祖细胞进行了动态观察。于动员过程中取外周血进行HPC，CD34^ 细胞和CFU-GM的检测，对采集物也进行上述检测。结果表明：在外周血标本中HPC与CD34^ 细胞和CFU-GM二间均呈良好的正相关性。所有检测病例外周血CD34^ 细胞与HPC同时上升，同时达高峰。供的峰值出现在动员的第5天，快速升高晚于白细胞。而患外周血干/祖细胞的快速升高早于白细胞。采集物中HPC与CD34^ 细胞和CFU-GM呈正相关性。采集当日外周血中HPC和CD34^ 细胞计数与采集所得CD34^ 细胞数量亦具有良好的线性相关。结论：造血祖细胞的监测是一种快速、简便又经济的监测外周血干细胞采集时机和预测成功采集的可靠指标。     

异丙肾上腺素影响下颌下腺干/祖细胞增殖的数量还是能力？

背景：异丙肾上腺素注射能够促进啮齿类动物涎腺腺泡细胞增殖、肥大。然而,异丙肾上腺素注射后涎腺干/祖细胞的增殖能力目前仍不清楚。
　　目的：研究异丙肾上腺素腹腔注射对SD大鼠下颌下腺干/祖细胞激活、增殖能力。
　　方法：SD大鼠随机分为2组,分别腹腔注射异丙肾上腺素与生理盐水,连续注射5 d后取下颌下腺,酶消化法制取下颌下腺细胞悬液,体外培养,获得下颌下腺类上皮细胞集落并计数。挑取增殖较快的集落,进行CD90.1、层粘连蛋白、α6β1等免疫细胞化学检测。
　　结果与结论：与对照组相比,异丙肾上腺素注射组中、低增殖集落数量较少,高增殖集落数量较多,差异有显著性意义(P<0.05),而集落总数无明显区别(P>0.05)。高增殖下颌下腺类上皮细胞集落CD90.1、层粘连蛋白、α6β1抗体均为阳性表达。实验结果显示,异丙肾上腺素注射不能明显增加下颌下腺中的干/祖细胞数量,但是能提高腺体中干/祖细胞的增殖能力。     

成年大鼠骨髓多能成体祖细胞的克隆化培养及其鉴定

目的优化培养条件，获得体外克隆化培养的成年大鼠骨髓多能成体祖细胞（rMAPC），并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法选择低血清条件培养基全骨髓直接贴壁法初步分离大鼠骨髓干细胞，用极限稀释法进行克隆化培养；用流式细胞术及免疫细胞化学法对克隆化培养的rMAPC进行表型分析，并进行体外成脂肪、成骨及成神经细胞诱导，RT—PCR检测Oct4及三个胚层早期标志物，确定其表型及分化潜能。结果单个细胞来源rMAPC在体外扩增至20代仍保持良好的生长状态；流式细胞术及细胞免疫组化检测结果显示CD71、α—SMA及Vimentin表达阳性；CD34、CD44、CD45表达阴性；细胞周期分析显示S＋G，＋M期细胞约占17％，而处于G0／G1．期的细胞占83％；rMAPC体外可被诱导向脂肪细胞、骨细胞及神经细胞分化；RT—PCR检测到Oct4及三个胚层早期标志物的表达。结论体外克隆化培养的rMAPC能维持良好的干细胞生物学特性。     

间充质干细胞和内皮祖细胞对脐血造血干/祖细胞体外扩增效力的影响

目的比较脐带来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)和内皮祖细胞(Endothelial progeni-tor cells,EPCs)对脐血造血干/祖细胞(Hematopoietic stem/progenitor cells,HSCs/HPCs)的体外扩增效力。方法正常人脐血中分离单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),流式细胞术检测其中HSCs/HPCs所占比例,将MNCs分别接种于处理后的MSCs或EPCs或仅接种于培养液中,比较不同培养条件对HSCs/HPCs扩增能力、表面抗原CD34的表达以及集落形成能力的影响。结果共培养过程中,MSC组和EPC组的MNCs扩增倍数均明显高于对照组,且EPC组更为显著。扩增7天后,对照组、MSC组和EPC组的HSCs/HPCs CD34的表达均较扩增前下降,其中EPC组下降的最为显著,MSC组最不显著。共培养4天后,MSC组的HSCs/HPCs集落形成总数为EPC组的2.47倍(**,P<0.01),共培养7天后,MSC组的HSCs/HPCs集落形成总数为EPC组的3.45倍(**,P<0.01);EPC组与对照组的HSCs/HPCs集落形成总数无显著性差异。结论 MSC和EPC均可为HSCs/HPCs的体外扩增提供适宜的微环境,MSC可抑制HSCs/HPCs的分化,有助于维持其表面抗原CD34的表达,并保持其造血重建潜能和归巢能力;而EPC则可有效促进HSCs/HPCs的分化。     

人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的体外分离与培养

背景：体外研究人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的分离培养与鉴定,可为探讨骨髓间充质干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探寻在体外分离培养骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的有效方法。方法：采用直接贴壁法从成人骨髓中体外分离培养骨髓间充质干细胞,并进行扩增和鉴定。采用胶原酶消化法从人全层无烧伤皮肤中分离汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。结果与结论：倒置显微镜下见分离培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,折光性强,免疫细胞化学染色显示细胞表达CD29、CD105,高表达CD44,不表达造血干细胞表面标志CD34和CD45。汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞表面标志细胞角蛋白7,8,18,19和癌胚抗原。说明直接贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞和胶原酶消化法分离培养汗腺细胞是可行的。     

体外分离培养人皮下脂肪干细胞的生物学特性及影响因素

目的:研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪源性干细胞,并表现出向多谱系细胞分化的特点.对来源于人皮下脂肪组织的脂肪干细胞进行体外培养,观察其形态特点、生物学特性及间充质来源细胞表面相关标志的表达.方法:实验于2005-11/2007-02在泸州医学院医学分子生物学实验室完成.①对象:行切疤植皮术的正常体质量患者8例,年龄16～45岁,均无传染性疾病,来源于泸州医学院烧伤整形科,实验前征得患者同意.②实验方法:人脂肪干细胞的分离、培养与传代:无菌条件下取患者新鲜的皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化 贴壁法获取原代脂肪干细胞,生长至70%融合时传代,观察细胞的形态学变化.当原代细胞的胞质中出现较多透亮液滴后,行油红O染色.将第3代脂肪干细胞冻存,1个月后复苏,观察细胞的生长情况.选择生长状态良好的第3代脂肪干细胞,苏木精-伊红染色观察细胞形态,SABC法检测间充质来源细胞特异性标志波形蛋白的表达,SP法检测间充质干细胞表面相关抗原CD44的表达.取处于对数生长期的细胞,绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间.结果:①原代和传代过程中人脂肪干细胞的形态学变化:原代和传代培养的细胞均为长梭形贴壁生长.当原代细胞达到50%融合后,部分细胞由梭形逐渐变为多角形或椭圆形,胞质内出现油红O染色阳性的脂滴.传代细胞中此现象逐渐消失,且经冻存后复苏的活细胞率达80%以上,细胞生长、增殖能力未受影响.②间充质来源细胞表面标志的鉴定:第3代人脂肪干细胞的胞质丰富,HE染色弱嗜碱性,呈淡蓝色;波形蛋白阳性率为(97.1±2.3)%,CD44阳性率为(85.4±3.22)%.③人脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间:传代培养的脂肪干细胞生长曲线呈"S"形,群体倍增时间为62.38h.结论:从人皮下脂肪组织分离培养出的脂肪干细胞,在体外扩增和冷冻保存后生物学特性稳定,且具有良好的增殖能力,表达间充质来源细胞表面标志波形蛋白和表面抗原CD44.     

人胎盘来源干／祖细胞的研究进展

胎盘组织含有一些具有干/祖细胞潜能和免疫调节功能的细胞,并且胎盘组织容易得到,不需要侵入性操作,对其研究不会涉及伦理道德问题,目前已成为寻找人类干/祖细胞新来源的研究热点.日前研究丰要集中在胎盘不同部位分离的间充质基质细胞和从羊膜分离的上皮细胞.由于胎盘结构的复杂性,迫切需要尽可能明晰地确定这些细胞的来源区域和分离方法.     

成人外周血平滑肌祖细胞的体外培养

背景:外周血平滑肌祖细胞具有向平滑肌细胞分化的能力.目的:探索体外分离培养成人外周血平滑肌祖细胞的方法及其生长分化特性.方法:采用密度梯度离心法分离获得成人外周血单个核细胞,培养12 d后,应用流式细胞仪鉴定分析平滑肌祖细胞并分选纯化,继续培养诱导分化.采用倒置显微镜观察平滑肌祖细胞的形态变化,免疫荧光染色法观察其α-肌动蛋白的表达,同时应用Western blot法检测调宁蛋白、平滑肌肌球蛋白重链的表达情况.此外,观察平滑肌祖细胞的生长特性,绘制生长曲线.结果与结论:成人外周血单个核细胞诱导培养4 d时开始出现细胞集落,12 d时细胞呈明显梭形.流式细胞仪分析显示,CD14和CD105双阳性的平滑肌祖细胞占贴壁细胞的(71.8±7.2)%.分选纯化的平滑肌祖细胞培养到28 d呈旋涡状生长.间接免疫荧光染色显示,α-肌动蛋白表达呈阳性.Western blot检测显示,调宁蛋白和平滑肌肌球蛋白重链分别于14,21 d开始表达,并逐渐增加.生长曲线表明,细胞生长至第6天进入对数生长期,第12天后进入平台期.提示通过对外周血单个核细胞的诱导培养,可以获得大量的平滑肌祖细胞.它能稳定增殖,并可进一步分化为平滑肌细胞.     

成人外周血平滑肌祖细胞的体外培养

背景：外周血平滑肌祖细胞具有向平滑肌细胞分化的能力。目的：探索体外分离培养成人外周血平滑肌祖细胞的方法及其生长分化特性。方法：采用密度梯度离心法分离获得成人外周血单个核细胞,培养12d后,应用流式细胞仪鉴定分析平滑肌祖细胞并分选纯化,继续培养诱导分化。采用倒置显微镜观察平滑肌祖细胞的形态变化,免疫荧光染色法观察其α-肌动蛋白的表达,同时应用Westernblot法检测调宁蛋白、平滑肌肌球蛋白重链的表达情况。此外,观察平滑肌祖细胞的生长特性,绘制生长曲线。结果与结论：成人外周血单个核细胞诱导培养4d时开始出现细胞集落,12d时细胞呈明显梭形。流式细胞仪分析显示,CD14和CD105双阳性的平滑肌祖细胞占贴壁细胞的（71.8±7.2）%。分选纯化的平滑肌祖细胞培养到28d呈旋涡状生长。间接免疫荧光染色显示,α-肌动蛋白表达呈阳性。Westernblot检测显示,调宁蛋白和平滑肌肌球蛋白重链分别于14,21d开始表达,并逐渐增加。生长曲线表明,细胞生长至第6天进入对数生长期,第12天后进入平台期。提示通过对外周血单个核细胞的诱导培养,可以获得大量的平滑肌祖细胞。它能稳定增殖,并可进一步分化为平滑肌细胞。     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的:目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低.实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法.方法:实验于2006-08/2007-08 在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成.①实验材料:2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133, 采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达.结果:①培养4 d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长.培养7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观.2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈"微血管样"排列生长.②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达.结论:采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增.