光化学法血浆病毒灭活效果观察

输血治疗是临床治疗的重要手段之一,也是挽救患者生命的治疗措施.和其他临床治疗方法一样,输血治疗疾病的同时,也可能导致各种不良反应、并发症和输血相关的传染病(病毒、细菌感染、梅毒和疟疾等)发生,尤其是多种肝炎病毒经输血传播,引起输血后病毒性传染病.     

滴定分析实验多媒体教学模型的建立

本文提出了一种用于多媒体课件开发的描述方法———教学模型， 并以分析化学课程中的滴定分析实验为例，介绍了其教学模型的具体内容和建立过程。这种教学模型是教学人员与软件开发人员之间进行信息交换的重要纽带，为多媒体课件开发提供了一种良好的表达方法     

核黄素光化学法灭活红细胞悬液巨细胞病毒的初步探讨

目的探讨核黄素光化学法对红细胞悬液中病毒灭活效果。方法以人巨细胞病毒(HCMV)作为指示病毒,在红细胞悬液中分别加入不同浓度的核黄素,结合照度为40000 Lux的可见光(λ(600nm),处理后加入单层人胚成纤维细胞(HF)中培养,观察细胞病变效应并测定病毒滴度,用PCR检测病毒核酸的变化。结果红细胞悬液中的核黄素浓度为50、100、150、200μmol/L时,结合照度为40000 Lux的可见光分别照射40、30、20、20min时,可将滴度为7.65log TCID50的HCMV灭活至<0.50log TCID50;PCR法未能检测出病毒核酸。结论核黄素光化学法能有效灭活红细胞悬液中的HCMV。     

亚甲兰/光化学法灭活血浆病毒的可行性分析

输注血液及血液成分具有传播病毒性疾病的危险,其原因之一是对血液进行初复检时,由于灵敏度和窗口期的问题,导致病毒标志方法学上的局限性,不可完全剔除携带致病病毒血液,二是还有一些未列入必检项目的病毒及医学手段未能检测的病原体.     

亚甲兰/光化学法灭活血浆病毒的可行性分析

输注血液及血液成分具有传播病毒性疾病的危险 ,其原因之一是对血液进行初复检时 ,由于灵敏度和窗口期的问题 ,导致病毒标志方法学上的局限性 ,不可完全剔除携带致病病毒血液 ,二是还有一些未列入必检项目的病毒及医学手段未能检测的病原体。亚甲兰可见光照射 (MB P)灭活血浆中病毒是近年来才发展起来的技术 ,可有效灭活血浆中的病毒[1 ] 。它适用于单袋血浆病毒灭活 ,其灭活机制 ,主要破坏病毒核酸 ,病毒包膜 ,其机制明确 ,药理实验具有安全性、可靠性 ,临床输注的效果良好 ,无不良反应。此项技术有着适宜的灭活方法及配套的设备和器材 ,…     

甲醛灭活工艺对By型流感病毒的灭活效果及其抗原稳定性的影响

目的 评价终浓度为100μg/ml甲醛、2～8℃、10 d灭活工艺对2022年四价流感病毒裂解疫苗生产用By(B/Phuket/3073/2013/BVR-1B)病毒毒株灭活的适用性。方法 病毒收获液（鸡胚病毒培养产物）经过澄清过滤,控制蛋白浓度<800μg/ml,温度2～8℃,添加甲醛溶液至终浓度100μg/ml,对病毒收获液进行灭活。在灭活第0、1、2、3、4、5、10天取样,采用鸡胚半数感染剂量（median infective dose,EID50）法检测病毒滴度,采用Reed-Muench法计算lgEID50/ml;采用直接血凝法检测流感病毒血凝滴度;对灭活10 d的样品进行病毒灭活验证试验;灭活10 d后的病毒液经超滤、离心、层析等工艺提纯,取样进行透射电镜观察病毒颗粒完整性。结果 病毒收获液灭活第0、1、2、3、4、5、10天的病毒滴度分别为（8.5±0.4）、（4.2±0.5）、（1.3±0.4）、0、0、0、0 lgEID50/ml,血凝滴度结果均在1∶256～1∶512;病毒灭活验证试验显示,经过10 d的灭活,病毒均已全部灭活;透射电镜观察显示,所得的病毒均...     

亚甲基蓝/光化学法灭活血浆巨细胞病毒的初步研究

目的 探讨亚甲基蓝／光化学法对血浆CMV灭活的效果。方法 应用ELISA对献血者进行CMV-IgM抗体筛选，应用荧光定量PCR检测仪对亚甲基蓝／光化学法处理的CMV-IgM抗体阳性血浆进行CMV核酸检测。结果 在166例血浆标本中，经ELISA检测发现33例CMVIgM抗体阳性，阳性率为19．9％；在33例CMV-IgM抗体阳性血浆中，经亚甲基蓝／光化学法灭活后，定量PCR检测特定的CMVDNA片段拷贝数为0。结论 初步证明用亚甲基蓝／光化学法对血浆CMV可能有一定的灭活作用。     

肠道病毒A组71型病毒参考品的建立及应用

目的 建立肠道病毒A组71型（enterovirus A71,EV-A71）灭活疫苗病毒参考品,用于病毒滴度内部质控品及灭活效果验证实验室评价。方法 建立1批病毒参考品,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包括无菌、支原体及分子生物学鉴定检查等。对其滴度进行标定和储存稳定性研究,并进行病毒滴定和灭活效果验证方面的应用研究。结果 建立的EV-A71病毒参考品无菌检查及支原体检查结果均符合规定。分子生物学鉴定结果显示参考品只含有单一的EV-A71 VP1特异性条带。EV-A71病毒参考品标定后的滴度平均值为7.000 lgCCID50/ml(95%CI为6.917～7.083 lgCCID50/ml),可接受范围为6.566～7.434 lgCCID50/ml,变异系数（coefficient of variation,CV）为3.01%,于-60℃及以下存放12个月的CV为2.08%,稳定性良好。将参考品作为病毒滴定测定的内部质控品应用于日常监测50次试验,滴度趋势分析结果显示未出现超趋势现象（out of trend,OOT）且均在警戒限内;将参考品作为阳性对照应用于灭活效果验证,...     

携带抑癌基因的重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装滴定方法探讨

目的　构建携带多肿瘤抑制基因p16 (mts 1)及抑癌基因p2 1WAF1的腺相关病毒 (AAV)载体 ,通过病毒包装、纯化及滴定 ,获得高纯度高感染性的病毒液 ,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础。方法　以p16cDNA及p2 1cDNA全长为目的基因 ,构建AAV载体prAAV AFP p16 ,prAAV AFP p2 1,prAAV CMV p16及prAAV CMV p2 1。其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因。应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞 ,2d后感染野生型腺病毒 ,至细胞裂解病变明显时收获。纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子DNA ,进行病毒DNA颗粒滴度测定。然后用重组腺相关病毒与腺病毒 (MOI均为 10 )共感染C12细胞 ,至细胞裂解病变明显时再收获。结果　重组载体经酶切鉴定测序证实。 2 93细胞、C12细胞包装病毒效果良好 ,病毒颗粒滴度介于 10 13 ～ 10 14 个 /ml之间。携带GFP的感染性AAV滴度为 5× 10 10 个 /ml。电镜下病毒呈小圆形空斑状 ,直径 2 5～ 30nm。MOI值 10 0时 ,rAAV AFP GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达 70 % ,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标。结论　成功构建了AAV载体 ,探讨了病毒包装方法 ,即第一次转染成功后 ,     

EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定

目的：建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法：首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子（Ppol Ⅰ）、ccdB自杀基因和鼠终止子（mTer）的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果：通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒（pHT-EV71）,并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1 900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）检测可见20～30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,检测其毒力高于母本株（6.35 lgTCID50/mL）。结论：通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。     

培养学生掌握滴定分析基本操作技能浅谈

滴定分析操作是检验、药学等医学类专业学生必须掌握的实验技能。教学过程中 ,教师应着重培养学生树立量的概念 ,加强目的性教育 ,正确示范 ,精心辅导 ,强化考核 ,从而使学生掌握正确的操作技能。     

轮状病毒分离与培养方法的建立

①目的探讨建立轮状病毒的分离与培养方法。②方法粪便标本经ELISA检测，离心后接种于MA104细胞株，观察病毒致细胞病变效应。提取病毒RNA．琼脂糖电泳检测。③结果经离心、双抗处理后，轮状病毒可在MA104细胞中克隆增殖．并引起细胞病变（CPE）。④结论MA104作为容纳细胞，可用于轮状病毒的大量扩增。     

实时荧光PCR检测B型流感病毒方法的建立及病毒培养法验证

目的建立B型流感病毒实时荧光PCR检测(FQ-PCR)法,并与常规病毒培养法比较,判断二者结果的相关性,确定两种检测方法各自更适合的应用领域。方法建立FQ-PCR法并对76株经Quidel胶体金试纸条鉴定型别的流感病毒分离培养株进行检测,比较其敏感性和特异性。21～223梯度稀释的B型流感病毒分别用FQ-PCR法和病毒培养法进行检测,记录FQ-PCR的Ct值及培养物的血凝效价,并对FQ-PCR阳性但血凝无效价的梯度进行盲传,再次检测HA效价,比较二法的灵敏度及相关性。对临床采集的881份咽拭子标本做FQ-PCR检测,同时进行病毒培养并盲传、血凝试验及Quidel胶体金试纸条分型,综合比较两种检测方法之间的差异。结果在76株已知流感病毒标本中,FQ-PCR方法检出B型16份,与Quidel胶体金分型结果相符。FQ-PCR方法的灵敏度约高出常规培养法的25～26倍。FQ-PCR法对临床咽拭子的检测灵敏度高,无非特异性反应。结论流感病毒FQ-PCR法具有与组织培养法一致的特异性,前者操作简便快捷,灵敏度更高,在流感病毒临床快速检测和鉴定中具有更广阔的应用前景。     

输注经光化学法灭活病毒血浆对围术期血管活性物质的影响

目的探讨经亚甲基蓝（MB）／光化学法灭活病毒血浆对围术期血管活性物质的影响。方法选择脊柱手术ASAⅠ～Ⅱ级择期手术患者60例，随机分为两组：实验组（输注MB／光化学法灭活血浆组）30例和对照组（输注普通新鲜冰冻血浆组）30例。所有患者均于麻醉前、输血浆后6h和12h用放射免疫法分别测定ET、ANP含量。结果两组ET、ANP值输血浆后明显上升（P〈0．01）：但实验组在输注MB／光化学法灭活血浆后ET值与对照组相比显著降低（P〈0．01）；同时ANP值在输MB／光化学法灭活血浆后显著升高。两组间相比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论经MB／光化学法灭活血浆在灭活病毒、促进血管活性物质释放等方面优于普通新鲜冰冻血浆，临床应用相对安全。     

慢病毒RNAi载体的制备及滴度测定方法的建立

目的构建可用于神经系统基因功能研究和基因治疗的慢病毒RNAi载体系统,并建立一种方便、快捷的慢病毒滴度测定方法。方法三质粒系统：PLK0.1-puro、△8.2、水疱性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）共转染293T细胞,产生慢病毒RNAi载体颗粒,超速冷冻离心浓缩;将病毒颗粒进行系列稀释后感染Eca9706细胞,采用嘌呤霉素最小致死量筛选病毒感染细胞的方法,进行慢病毒滴度测定。结果完成了慢病毒RNAi载体的包装及浓缩,确定了嘌呤霉素对Eca9706细胞的最小致死浓度为2.7μg/ml,并应用该浓度测得病毒颗粒的滴度为10^7TU/ml。结论成功构建了一种慢病毒RNAi载体，并建立了一种可行的慢病毒滴度测定方法。     

蚀斑法测定呼吸道合胞病毒滴度的建立和验证

目的 建立蚀斑法用于呼吸道合胞病毒的病毒滴度测定,并进行验证。方法 通过测定样品的病毒滴度,比较滴度结果,筛选最佳覆盖物、覆盖物浓度和病毒孵育时间,从而建立蚀斑法用于测定呼吸道合胞病毒滴度。根据国际人用药品注册技术协调会指导原则和《中华人民共和国药典》要求,验证该方法的准确性、精密性、线性和耐用性。结果 采用0.8%微晶纤维素作为覆盖物,病毒孵育2～3 h为建立蚀斑法的最优条件。该蚀斑法测定不同浓度样品病毒滴度的结果相对偏倚均小于10%;试验内和试验间精密性几何变异系数分别为11%和18%;本方法的线性斜率为1.004,相关系数为0.999 1;本方法中固定细胞的时间0.5～24 h均适用,差异无统计学意义(F=1.767,P=0.222 5)。结论 建立的蚀斑法具有较好的准确性、精密性、线性和耐用性,适用于呼吸道合胞病毒的滴度测定。     

病毒灭活血浆的临床应用

为了加强输血安全,减少因输血而传染上经血液传染的疾病,本文对输血存在的风险、病毒灭活血浆的意义、病毒灭活血浆的原理的方法以及病毒灭活血浆的临床应用进行阐述,进一步说明了输血存在的隐患和风险,合理使用病毒灭活血浆,可以降低因输血而传染疾病的意义,指导临床安全用血.     

水痘减毒活疫苗蚀斑法测定病毒滴度新方法的建立

目前用于测定水痘减毒活疫苗病毒滴度的传统蚀斑法为6孔板单层细胞吸附法(简称单层法)，此方法操作复杂。将此方法进行改良，改为6孔板同时法测定病毒滴度，改良后的蚀斑法更为简单、快捷。本文就此作一报告。     

PCR辅助转录滴定系统定量检测AFP mRNA方法的建立

目的：建立ＰＣＲ辅助转录滴定系统（ＰＡＴＴＹ）定量检测ＡＦＰ ｍＲＮＡ的方法。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ定点替代突变及体外转录技术合成单碱基突变ＡＦＰ ｍＲＮＡ内竞争模板,以竞争性ＲＴ－ＰＣＲ定量检测各肝癌细胞株ＡＦＰ ｍＲＮＡ,结果：成功制备引入ＨｉｎｄⅢ酶切位上为的单碱基突变ＡＦＰ ｍＲＮＡ内竞争模板,建立ＰＡＴＴＹ定量检测ＡＦＰ ｍＲＮＡ的方法;检测１μｇＨｅｐＧ２和Ｈｕｈ７两株肝癌细胞总ＲＮＡ