人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达

目的构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的蛋白。方法人血培养获得树突状细胞（DC）,以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的 DNA,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达。结论成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础。     

DC-SIGN

单核细胞 (DC)作为高效的抗原递呈细胞在免疫系统中发挥重要作用。近来发现的一个关键的分子DC -SIGN和DC -SIGNR的受体能够识别包括艾滋病毒gp12 0蛋白在内的大分子的碳水化合物成分 ,并且与其相互作用 ,在树突状细胞内发现的DC -SIGN能够典型地与T细胞表面的ICAM -3受体结合 ,这是产生免疫反应的一个关键步骤。DC -SIGNR是在肝脏、毛细血管和淋巴结中的内皮细胞的表面发现的。这些受体与艾滋病毒的相互作用 ,可能促进了该病毒感染T细胞以及通过毛细管穿越母婴界限的能力。最近发现DC -SIGN和DC -SIGNR能够特异性与HCV…     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及在K-562细胞中的表达

目的构建含人DC-SIGN基因的真核表达载体,探讨DC-SIGN在K-562细胞中的表达,为研究丙型肝炎病毒(HCV)与DC-SIGN的相互作用奠定基础.方法分离人外周血单个核细胞,体外诱导分化为树突状细胞(DC);提取细胞总RNA并反转录为cDNA,设计上下游引物,利用PCR技术扩增DC-SIGN片段,连接入克隆载体pGEM-T easy;应用双酶切回收基因片段,定向克隆入真核表达载体pCDNA3.1;通过脂质体介导的基因转染技术将pCDNA3.1-DC-SIGN和空载体转入K-562细胞,应用G-418筛选稳定表达DC-SIGN的K-562细胞,以DC-SIGN单抗通过免疫荧光法检测K-562细胞的表达产物.结果 PBMC体外成功刺激分化为DC,含DC-SIGN基因的克隆载体pGEM-DC-SIGN经酶切、PCR及测序鉴定分析正确,pCDNA3.1-DC-SIGN经酶切、PCR鉴定分析正确,DC-SIGN可在K-562细胞表面稳定表达.结论 DC-SIGN可在K-562细胞中大量表达,为进一步研究DC-SIGN在HCV感染中的作用奠定了基础.     

GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因并构建真核表达载体，观察其在人胚肾293（下称293细胞）细胞中的表达和分布，为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒（HIV）核酸疫苗的阳性对照奠定基础。方法 以克隆好的pUC18／GFP为模板，根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物，并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点，特异性扩增GFP基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体，酶切鉴定分析后，将该重组质粒通过脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布。结果重组质粒经Barn HⅠ、XhoⅠ双酶切成5．4kb与0．7kb的片断，表明表达载体pcDNA3．1（＋）中插入了GFP基因片断，测序结果表明编码框正确，并在293细胞中获得了表达，分布均匀。结论 pcDNA3．1（＋）／GFP真核表达载体已成功构建，并可在293细胞中表达。     

人α-防御素基因的克隆及其在293T细胞中表达的临床意义

目的克隆人α-防御素（α-HNP）基因,构建重组真核表达质粒pCG-HNP并检测其在293T细胞中的表达。方法提取人PBMC细胞的RNA,以其为模板用RT-PCR技术克隆人α-HNP的cDNA,并将其插入质粒pCG中构建真核表达载体。测序证实后,将重组质粒用脂质体法转染293T细胞,用蛋白质免疫印迹法（Western）检测目的蛋白分子的表达。结果测序证实克隆的人α-HNP阅读框正确完整,PCR鉴定和酶切鉴定证实插入方向正确,免疫印迹结果显示重组质粒能够在293T细胞中表达HNP-GFP-Flag融合蛋白。结论α-HNP基因成功克隆;其在293T细胞中的表达可为进一步研究其抗HIV活性奠定基础。     

DC-SIGN： Binding receptor for HCV？

DC-SIGN, a dendritic Cell-specific adhesion receptor and a type Ⅱ transmembrane mannose-binding C-type lectin, is very important in the function of DC, both in mediating naive T cell interactions through ICAM-3 and as a rolling receptor that mediates the DC-specific ICAM-2-dependent migration processes. It can be used by viral and bacterial pathogens including Human Immunodeficiency Virus (HIV), HCV, Ebola Virus, CMV and Mycobacterium tuberculosis to facilitate infection. Both DC-SIGN and DC-SIGNR can act either in cis, by concentrating virus on target cells, or in bans, by transmission of bound virus to a target cell expressing appropropriate entry receptors. Recent work showed that DC-SIGN are highaffinity binding receptors for HCV. Besides playing a role in entry into DC, HCV E2 interaction with DC-SIGN might also be detrimental for the interaction of DC with T cells during antigen presentation. The clinical strategies that target DCSIGN may be successful in restricting HCV dissemination and pathogenesis as well as directing the migration of DCs to manipulate appropriate immune responses in autoimmunity and tumorigenic situations.     

小鼠IL-4真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-4(murine interleukin-4,mIL-4)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠IL-4基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,利用电泳和测序鉴定重组质粒的大小、序列。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-4转入293T细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其表达。结果经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-4构建成功,并在293T细胞中成功表达。结论 pcDNA3.0-mIL-4可在真核细胞中成功表达,为进一步研究其在炎症性肠病(IBD)动物模型中的生物学功能提供了条件。     

人pEGFP-PKARⅡβ重组质粒的构建及其在BGC-823胃癌细胞中的表达

目的:研究人的蛋白激酶A调节亚基RⅡβ(PKARⅡβ)基因的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体融合蛋白在胃癌细胞BGC-823内的表达和定位,初步探讨其在肿瘤细胞中的分子作用机制.方法:以pRSETB-PKARⅡβ质粒为模板,PCR扩增出全长PKARⅡβ编码序列,用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,亚克隆至含有GFP标...     

DC-SIGN基因多态性及表达差异与宿主易感性之间的关系

树突状细胞（DCs）是体内功能最强的抗原呈递细胞,其表面的DCs特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子（DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin,DC-SIGN）一方面可介导DCs对病原体的结合和抗原呈递,有利于宿主免疫应答;另一方面也可被胞内寄生病原体利用,协助其感染宿主T细胞,并通过干扰DCs成熟来影响其抗原呈递能力,抑制宿主免疫功能。目前研究认为,DC-SIGN基因多态性及表达差异可能会影响宿主对病原体的易感性。     

树突状细胞表面特异性非整联蛋白同源物基因多态性与丙型肝炎病毒感染的相关性

目的 研究丙型肝炎患者树突状细胞表面特异性非整联蛋白同源物(DC-SIGNR)外显子4基因颈区重复序列的遗传多态性分布,探讨DC-SIGNR基因多态性与HCV病毒基因分型及HCV载量的关系. 方法采用PCR结合DNA测序对268例丙型肝炎患者DC-SIGNR重复序列多态性进行基因分型和测序分析,同时检测患者的HCV病毒载量及HCV病毒基因分型.组间两两比较用LSD法.结果 DC-SIGNR基因型或等位基因与HCV基因分型的相关性不显著.HCV载量携带7等位基因的患者为(4.6722±1.9766)log10拷贝/ml,携带9等位基因的患者为(5.3073±1.6795)log10拷贝/ml,P=0.036,两组差异有统计学意义.7/7基因型的患者HCV载量水平为(4.5974±2.0067)log10拷贝/ml,9/7基因型的患者组为(5.2771±1.8587)log10拷贝/ml,P=0.025,两组差异有统计学意义.提示HCV更易与携带较长DC-SINGR等位基因的患者结合.结论 DC-SIGNR遗传多态性可能与HCV在个体内的复制有关,但与HCV基因分型不相关.     

树突状细胞表面特异性非整联蛋白同源物基因多态性与丙型肝炎病毒感染的相关性

目的 研究丙型肝炎患者树突状细胞表面特异性非整联蛋白同源物(DC-SIGNR)外显子4基因颈区重复序列的遗传多态性分布,探讨DC-SIGNR基因多态性与HCV病毒基因分型及HCV载量的关系. 方法采用PCR结合DNA测序对268例丙型肝炎患者DC-SIGNR重复序列多态性进行基因分型和测序分析,同时检测患者的HCV病毒载量及HCV病毒基因分型.组间两两比较用LSD法.结果 DC-SIGNR基因型或等位基因与HCV基因分型的相关性不显著.HCV载量携带7等位基因的患者为(4.6722±1.9766)log10拷贝/ml,携带9等位基因的患者为(5.3073±1.6795)log10拷贝/ml,P=0.036,两组差异有统计学意义.7/7基因型的患者HCV载量水平为(4.5974±2.0067)log10拷贝/ml,9/7基因型的患者组为(5.2771±1.8587)log10拷贝/ml,P=0.025,两组差异有统计学意义.提示HCV更易与携带较长DC-SINGR等位基因的患者结合.结论 DC-SIGNR遗传多态性可能与HCV在个体内的复制有关,但与HCV基因分型不相关.     

树突状细胞表面特异性非整联蛋白外显子4在中国裔丙型肝炎患者中的遗传多态性

目的探讨树突状细胞表面特异性非整联蛋白（DC—SIGN）及其同源物（DC-SIGNR）外显子4遗传多态性在中国裔丙型肝炎患者中是否存在遗传易感性。方法采用PCR结合DNA测序对300例丙型肝炎患者和520名健康人的DC-SIGN和DC-SIGNR外显子4重复序列多态性进行基因分型和测序分析。结果DC—SIGN外显子4基因型与等位基因频率在丙型肝炎患者和健康人群间差异无统计学意义（P〉0．05）。DC-SIGNR外显子4等位基因的频率差异也无统计学意义（P〉0．05）；但9／5基因型分布频率在丙型肝炎患者和健康人群间的差异有统计学意义（P〈0．05）。结论DC-SIGN外显子4遗传多态性与HCV感染易感性无明显相关性；9／5基因型DC-SIGNR外显子4在丙型肝炎患者中的分布频率较高，可能与HCV感染的易感性相关，值得进一步研究。     

新布尼亚病毒真核表达载体的构建及表达

目的 探究SFTSV-NSs基因的结构和功能以及病毒在感染细胞过程中与宿主的相互作用,通过构建SFTSV-NSs真核表达载体SFTSV-NSs-FLAG,并将其转染进293细胞内,为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能奠定基础。方法 利用RT-PCR 扩增SFTSV-NSs基因序列并测序,并将纯化得到的SFTSV-NSs cDNA 片段连接到pFLAG-CMV-3载体,通过EcoRI/BamHI双酶切鉴定重组质粒。将重组表达体pSFTSV-NSs-FLAG导入293细胞中,共聚焦显微镜下观察SFTSV-NSs在细胞中的定位、 Western Blot 检测SFTSV-NSs 蛋白在293细胞中的表达情况。结果 成功克隆测序SFTSV-NSs基因;成功构建SFTSV-NSs真核表达载体pSFTSV-NSs-FLAG,并将其转染到293细胞中。在293细胞中的表达检测结果显示共聚焦显微镜下观察重组体主要集中在细胞质中,并形成类包涵体样结构;且Western Blot 检测结果显示SFTSV-NSs 蛋白在293细胞中表达。结论 为进一步研究SFTSV-NSs基因的结构和功能以及病毒在感染细胞过程中与宿主的相互作用提供新思路。     

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体的构建和生物信息学分析

目的：构建T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM-3基因进行生物信息学分析。方法：采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技术扩增TIM-3及其胞外（结构）域基因片段和人IgG1Fc基因片段。并将他们分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,通过PCR及测序进行鉴定。序列分析后将TIM-3胞外（结构）域基因片段亚克隆到已经克隆了人IgG1Fc基因片段真核表达载体pcDAN3.1（＋）上;并通过PCR及双酶切进行鉴定。应用生物信息学初步分析TIM-3基因的物理化学性质、蛋白质结构域、功能。结果：成功从PBMC中提取并逆转录的cDNA扩增出TIM-3及其胞外（结构）域基因和人IgG1Fc基因;经PCR、酶切鉴定、测序分析表明它们与GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息学分析结果表明TIM-3蛋白为稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是33.4KD,等电点pI为5.54。该蛋白含约32.56%的α-螺旋,8.27%的延伸链,49.17%的不规则卷曲,1段21个氨基酸组成的信号肽。TIM-3蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、液泡、细胞膜上。功能分析预测TIM-3蛋白具有受体和信号转导功能。结论：成功构建TIM-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解TIM-3基因的性质特征,为进一步研究该基因奠定基础。     

小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

APP基因真核表达载体的构建与鉴定

目的重组APP基因真核表达载体。方法采用定向克隆技术、脂质体转染和Nonhenblot杂交技术。结果在分别独立的反应中,PDGF启动子、APPcDNA、载体依摩尔比3∶3∶1及1∶1∶1同时连接,重组体利用脂质体介导转染SY5Y神经母细胞瘤细胞,Northernbolt杂交检测到瞬时表达。结论构建具有神经组织特异性的APP基因真核表达载体。