尿路致病性大肠埃希菌FYUA基因敲除株的构建及其生物学特性

目的构建尿路致病性大肠埃希菌FYUA基因敲除株,比较野生株和敲除株之间生物学特性的改变。方法利用λRed同源重组系统构建FYUA基因敲除株△FYUA;测定A600绘制CFT073和△FYUA在LB液体培养基和无菌尿液中的增殖曲线;平板菌落计数法比较CFT073和△FYUA菌落形成能力;利用96孔板结晶紫染色法比较CFT073和△FYUA生物膜形成能力。结果成功构建CFT073 FYUA基因敲除株△FYUA;CFT073和△FYUA在LB液体培养基中具有相似的增殖曲线,△FYUA在无菌尿液中的增殖速率明显低于CFT073(P0.05);CFT073和△FYUA菌落形成能力无明显区别;△FYUA的生物膜形成能力低于CFT073(P0.05)。结论 FYUA基因对于菌株在无菌尿液中的生长繁殖以及生物膜形成可能发挥重要作用。     

我国stx-大肠埃希菌eae基因分型的研究

目的：了解我国大肠埃希菌LEE毒力岛eae基因的分布流行病学特征。方法：对从浙江省分离的20株携LEE毒力岛大肠埃希菌株的eae基因3ˊ端部分以PCR法和限制性酶切法进行分型，未能分型的进行核酸序列测定，确定型别；对LEE毒力岛在染色体上的插入位点进行鉴定，对菌株进行ERIC-PCR分型。结果：20株大肠埃希菌的LEE毒力岛的eae基因以β型为主（占45.00%），用限制酶切β型可进一步分为二个亚型，γ型eae与EHEC O157：H7 933株的γ型eae酶切图谱差异较大。对未能用PCR法分型的3株eae阳性大肠埃希菌菌株，其推定的intimin C端氨基酸序列分析结果表明，96-1株为γ2型，C130-1株为ε型的新亚型（C端序列与ε型最相近，一致性为83.39%），97-3株C端序列与α型最相近（一致性为58.06%），将其定为新的λ型。另外发现97-3株中，1个IS200变种插入到eae和escD基因间隔区。9株菌的LEE插入位点为selC，其中2株同时还存在完整的selC位点；另11株可能存在着除selC和pheU以外的插入位点。几乎所有20株菌间的ERIC-PCR指纹呈现不同程度的差异，同一型的eae可出现在指纹相差很大的菌株中，但同时也存在着少量的携同型eae的同一克隆群菌株。结论：我国分离的stx^-大肠埃希菌eae基因在3ˊ端有较高的多态性，eae基因型别并不能反映菌株间亲缘关系，可能存在有新的LEE毒力岛插入位点。     

环丙沙星药敏检测在大肠埃希菌graA基因突变关系研究

为了解3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的大肠埃希菌gyrA基因基因突变状况，本文对该3株菌和另3株3次环丙沙星药敏检测均为耐药的大肠埃希菌进行了gyrA基因基因喹诺酮耐药区（QRDR）PCR扩增和产物DNA测序。结果为3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的和另3株3次检测均为耐药的大肠埃希菌均存在gyrA基因基因第83和第87位氨基酸密码子的突变（TCG→TTG，GAC→AAC）。     

尿路感染大肠埃希菌耐药性分析

目的 了解尿路感染大肠埃希菌对临床常用抗菌素的耐药性,指导临床合理使用抗菌药物.方法 按<全国临床检验操作规程>第二版接种分离,分纯菌落均经先德AR/S.2X全自动微生物培养鉴定系统鉴定到种,药敏采用深圳黑马生物工程有限公司生产的药敏板检测,用先德AR/S.2X微生物药敏分析系统进行药敏及产超光谱β-内酰胺酶(ESBLs)的分析判定.结果 大肠埃希菌对氨苄西林、头孢唑啉的耐药率已大于80%,对三代头孢菌素,氟喹诺酮类抗菌素耐药也很严重达46.5%-67.7%,ESBLs检出率分别为53.2%.结论 大肠埃希菌对临床常用抗菌药耐药严重,应加强耐药检测,降低细菌耐药率.     

环丙沙星药敏检测与大肠埃希菌gyrA基因突变关系研究

为了解3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的大肠埃希菌gyrA基因突变状况,本文对该3株菌和另3株3次环丙沙星药敏检测均为耐药的大肠埃希菌进行了gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)PCR扩增和产物DNA测序。结果为3株3次环丙沙星药敏检测结果不一致的和另3株3次检测均为耐药的大肠埃希菌均存在gyrA基因第83和第87位氨基酸密码子的突变(TCGTTG,GACAAC)。     

上海闵行地区腹泻患者非O157型产志贺毒素大肠埃希菌感染特点及毒力基因评估

目的研究上海闵行地区腹泻患者非0157型产志贺毒素大肠埃希菌（非0157STEC）感染情况及其毒力基因分布特点。方法收集该地区三个监测哨点及复旦大学附属儿科医院腹泻门诊患者肛拭样本及临床资料,通过培养、分离、生化鉴定及血清凝集等金标准确认非0157STEC菌株。同时运用聚合酶链反应（PCR）方法检测毒力基因stxl、stx2、eae、hly、etpD、及katP。结果380例（儿童195例,成人185例）大肠埃希菌阳性的腹泻患者肛拭样本中,40例（儿童30例,成人10例）确认为非0157STEC阳性,儿童阳性率（15．4％）显著高于成人（5．4％）。全部40例非0157STEC分离株均显示stx2毒力基因阳性,而stxl及eae基因阳性率很低,未检测到hly、etpD、及katP毒力基因。结论上海闵行地区非0157STEC是引起人群尤其是儿童腹泻的主要病原体之一,其菌株均显示stx2毒力基因阳性。     

肠出血性大肠埃希菌 espO基因敲除菌株的构建及其生物学功能初步研究

目的:检测 espO基因敲除对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)生物学特性的影响。 方法:自杀质粒pCVD442-Δ espO介导的两步法构建 espO基因敲除菌株(Δ espO),pTrc99a质粒构建 espO基因回补突变株(CΔ esp...     

大肠埃希氏菌感染的临床护理

大肠埃希氏菌又名大肠杆菌,主要寄生在大肠内,一般不致病,在一定条件下可引起肠道外感染,如腹膜炎、胆囊炎、尿道感染、腹泻等.该细菌属多重耐药菌,能同时对β-内酰胺类和氨基糖甙类药物产生耐药[1].2008年12月至2009年2月我科发生2例大肠埃希氏菌感染病例,通过精心治疗与护理治愈出院.现将报告如下.     

575株泌尿外科泌尿道感染大肠埃希菌耐药性分析

目的：了解医院泌尿外科泌尿道感染的主要病原菌及大肠埃希菌的耐药率,为临床合理用药提供依据。方法对2011~2013年泌尿外科住院泌尿道感染患者尿培养分离出的575株大肠埃希菌进行药敏分析。结果泌尿道感染以革兰氏阴性杆菌为主,其中大肠埃希菌占院54.2%~69.3%;产ESBLs菌株检出率为院36.9%~46.3%;2011~2013年泌尿外科及全院大肠埃希菌大多抗菌药物耐药率呈下降趋势,但对青霉素类、头孢一代耐药率较高,产ESBLs株耐药率明显高于非产ESBLs。结论泌尿道感染大肠埃希菌分离率最高,且细菌耐药严重,特别是产ESBLs株耐药更为严重,应当加强细菌耐药监测,指导临床合理使用抗菌药物,减少耐药菌株的产生。     

大肠埃希菌尿液分离株中检出gyrA基因新变异株

目的 调查大肠埃希菌尿液分离株中喹诺酮类耐药相关基因的存在与变化状况.方法 收集宁波市第一医院2008年10月到2009年3月患者尿液标本中分离的大肠埃希菌共28株,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析1种染色体介导的喹诺酮类耐药相关基因(gyrA基因)和5种质粒介导的喹诺酮类耐药相关基因[qnrA、qnrB、qnrS、aac(6＇)-Ⅰb、qepA].结果 28株大肠埃希菌检测到1株aac(6＇)-Ⅰb-Cr基因阳性株(经测序比对证实),qnrA、qnrB、qnrS、qepA基因均未检出.gyrA基因83位密码子28株菌都有突变(100.0%),其突变方式为TCG-83→HTG,导致氨基酸从丝氨酸(S)-83→亮氨酸(L);87位密码子22株菌(78.6%)有突变,可分为两种突变方式:21株(75.0%)突变方式为GAC-87→AAC,导致氨基酸从天冬氨酸(D)-87→天冬酰胺(N);5号株gyrA基因(3.6%)为新亚型,其突变方式为GAC-87→TAC,导致氨基酸从天冬氨酸(D)-87→脯氨酸(Y),另6株菌87位密码子无突变.结论 本组大肠埃希菌gyrA基因突变率为100.0%,是喹诺酮类耐药的主要原因.其他耐药相关基因阳性率很低.     

Transgelin基因真核表达载体的构建及其对胃腺癌AGS细胞增殖的影响

目的 构建人肌动蛋白凝胶蛋白(Transgelin)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,并观察其对胃腺癌细胞增殖的影响.方法 从健康人肠组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增TransgelincDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,构建成Transgelin基因的真核表达载体,然后转染入AGS细胞中,新霉素筛选稳定转染细胞克隆,通过MTT实验,研究转染Transgelin基因后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确尤误,Western印迹检测结果显示Transgelin融合蛋白在AGS细胞中具有良好的表达,而转染空载体及未转染细胞对照则未见有此融合蛋白质条带;RT-PCR结果显示Transgelin基因在其稳定转染的AGS细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).Transgelin表达上调的稳定克隆组,AGS细胞的增殖活性明显降低,MTT结果显示其增殖活性显著低于空载体稳定转染组及未转染亲代细胞组,差异具有统计学意义(P＜0.05),而后两者之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Transselin表达上调可导致胃腺癌细胞增殖降低.     

The First Purine Nucleoside Phosphorylase Deficiency Patient Resembling IgA Deficiency and a Review of the Literature

Purine nucleoside phosphorylase (PNP) deficiency is a rare autosomal recessive primary immunodeficiency disorder characterized by decreased numbers of T-cells, variable B-cell abnormalities, decreased amount of serum uric acid and PNP enzyme activity. The affected patients usually present with recurrent infections, neurological dysfunction and autoimmune phenomena. In this study, whole-exome sequencing was used to detect mutation in the case suspected of having primary immunodeficiency. We found a homozygous mutation in PNP gene in a girl who is the third case from the national Iranian registry. She had combined immunodeficiency, autoimmune hemolytic anemia and a history of recurrent infections. She developed no neurological dysfunction. She died at the age of 11 after a severe chicken pox infection. PNP deficiency should be considered in late-onset children with recurrent infections, autoimmune disorders without typical neurologic impairment.     

t-PA基因新型真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)基因的新型真核表达载体,为血栓性疾病的基因治疗奠定基础。方法将tPA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1MycHisB()中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有tPA基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染鼠血管平滑肌细胞,底物发色法测定转基因血管平滑肌细胞tPA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将tPA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在真核细胞中表达、分泌有活性的tPA。结论成功构建pcDNA3.1MycHisB()/tPA基因新型真核表达载体。     

转染人OX40L细胞株的构建及其对T细胞共刺激作用的研究

为了构建稳定表达人OX4 0L基因的L92 9细胞株 ,初步研究OX4 0L信号通路对T细胞的共刺激效应。TRIzol一步法抽提人成熟DC总RNA ,RT PCR扩增出OX4 0L基因 ,双酶切装入逆转录病毒载体pEGZ Term ,与辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用其培养上清感染L92 9细胞 72h后 ,经Zeocin筛选出稳定表达OX4 0L分子的L92 9细胞株 ;采用3 H TdR掺入实验、细胞凋亡、细胞周期等方法研究OX4 0L信号对T细胞体外培养的共刺激作用。结果显示 ,成功地构建了含OX4 0L基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,筛选获得能稳定高表达人OX4 0L蛋白的L92 9转基因细胞 ;OX4 0L转基因细胞对体外培养的T细胞具有促增殖、活化和抗凋亡的作用 ;同时 ,OX4 0 /OX4 0L信号与CD2 8/B7信号具有协同作用     

鼠内皮抑素基因腺病毒载体的构建及对血管内皮细胞的生长抑制

构建含鼠内皮抑素基因的腺病毒载体（pAd／mEnd），并观察内皮抑素蛋白对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的生长抑制、细胞周期和凋亡的影响。结果发现pAd／mEnd感染BEL7402细胞后，能有效表达内皮抑素蛋白，显著抑制HUVEC增殖，阻滞HUVEC细胞S期，凋亡指数显著增加。     

Sp1真核表达载体的构建及对USP22基因转录活性的影响

目的 克隆人sp1基因,构建真核表细胞达载体pVAX-Sp1,研究其对USP22基因转录活性的影响.方法 Trizol试剂快速提取人肝癌细胞株HepG2总RNA,经RT-PCR扩增Sp1基因序列,与pVAX1真核表达载体连接;测序、酶切鉴定重组载体;pVAX1-Sp1与含USP22启动子的萤光素酶报告质粒共转染Hep...     

非编码基因MALAT1功能性序列真核表达载体的构建及其在SW620细胞中的表达

目的构建人肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）功能性序列重组真核荧光表达载体,并在人大肠癌SW620细胞株中表达。方法采用RT-touchdown PCR方法,从人正常大肠黏膜组织中提取总RNA,扩增MALAT1功能性序列,将扩增产物克隆至pTA2载体,测序证实后,克隆至pEGFP-C1质粒中,构建重组真核荧光表达载体;阳离子脂质体介导下转染人大肠癌SW620细胞,荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达。通过Real-time PCR检测质粒转染前后MALAT1/fgf mRNA表达水平的变化。结果经pTA2载体和pEGFP-C1载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实人MALAT1功能性序列重组真核荧光表达载体构建成功。在荧光显微下观察到带绿色荧光的SW620细胞。pEGFP-C1-MALAT1/fgf转染前后SW620细胞MALAT1/fgf mRNA表达水平倍比关系为2.376±0.573,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建了人MALAT1功能性序列真核荧光表达载体pEGFP-C1-MALAT1/fgf,转染SW620细胞后可引起MALAT1/fgf mRNA表达上调,为进一步研究MALAT1的结构、功能及其与人大肠癌的关联奠定了基础。     

组织因子siRNA表达载体的构建及其抑制人神经母细胞瘤细胞组织因子表达的研究

目的:构建组织因子(TF)特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察其对人神经母细胞瘤细胞TF表达的影响。方法:分子生物学方法构建TFsiRNA-pSUPER表达载体,限制酶切予以初步筛选,基因测序进行证实。以脂质体Lipo-fectamine2000介导转染人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC。以WesternBlotting检测TF表达。结果:所构建TFsiRNA-pSUPER表达载体经基因测序证实。SK-N-MC细胞高表达TF,TFsiRNA-pSUPER表达载体转染48h后,TF表达水平与转染pSUPER质粒的对照细胞相比显著降低,呈剂量依赖性。结论:人神经母细胞瘤SK-N-MC中TF异常高表达,本研究构建的TFsiRNA表达载体可在SK-N-MC中特异性下调TF表达,可作为干预TF表达、研究其非凝血功能的有效手段。     

乙型肝炎病毒多表位抗原基因真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

将自行设计、合成的乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT ,克隆入真核表达载体pCDNA3 1,构建重组质粒pCDNA3 1/BPT。后者经脂质体法转染小鼠BALB/c 3T3细胞 ,G4 18加压筛选出阳性转染细胞 ,并用间接免疫荧光法鉴定其在小鼠BALB/c 3T3细胞的表达。该重组质粒经胫骨前肌注射小鼠 ,10 0 μg/次每只小鼠 ,间隔 2周加强一次 ,共 3次。免疫诱发了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应 ,并用PCR法在小鼠的心脏、肝脏及肺组织中检测到pCDNA3 1/BPT ,这为研究HBV多表达抗原的核酸疫苗提供了初步的资料