FTA/PCR检测加入饮料中的隐孢子虫

用建立的FTA/PCR方法检测饮料样品中隐孢子虫,可检测到隐孢子虫卵囊1.0个/ml,且在6 h内完成。该方法敏感性较高,省时,是检测饮料样品中隐孢子虫的较好方法。     

用PCR检测孢孢子虫

隐孢子虫（Cryptosporidium)是Tyzzer于1907年首先在实验小鼠胃肠道内发现的一种能广泛感染脊椎动物的寄生原虫。该虫已被公认为人和动物腹泻的重要病原体,是引起三大肠道病病原体之一,已受到国内外学者的重视,在发达国家与发展中国家腹泻病人中,隐孢子虫感染率分别为0．6－7．3％与3％－13％,国内1986年陈义民等在兰州犊牛中首次发现隐孢子虫,次年韩范等在南京首次发现人体病例^[1],此后许多地区均报道有隐孢子虫感染,该病多发于免疫抑制的患者,而免疫功能正常虽无临床症状者但也能够排出卵囊,污染环境,更要注意的是隐孢子虫卵囊在自来水中存活率很高,在1993年正是隐孢子虫卵囊在自来水中存活率很高,在1993年正是隐孢子虫污染了饮用水,造成美国的Milnoukee暴发400000人的大流行^[2],1995年报道小剂量（50％感染剂量ID50为132个卵囊）的卵囊虫以引起血清呈阴性的健康自愿受试者感染^[3]。由于隐孢子虫形体小,对恶劣环境有较强的抵抗力,无特异性染色,光镜下缺乏明显特征,少量卵囊足以使人感染,因而建立一种敏感性高,特异性强的检测方法是当前隐孢子虫病防治和流行病学调查研究工作迫切需要解决的问题之一,近年来发展起来的聚合酶链式反应（PCR）技术,有快速,简便,准确,高度敏感与高度特异等优点。Laxer等^[4]和Webster等^[5]先后将该 技术成功地应用于隐孢子虫检测,为建立敏感性高,特异性强的隐孢子虫检测方法开辟新叙。本文就当前在检测隐孢子虫中所使用的PCR方法综述如下。     

水源性隐孢子虫的PCR检测

水源性隐孢子虫病暴发是一大公共卫生问题 ,且水中的隐孢子虫抵抗力强 ,因其含量少 ,不易检测。PCR技术快速、简便、准确、高度敏感与高度特异。该文就当前在水源性隐孢子虫的PCR检测文献资料进行综述     

水源性隐孢子虫的PCR检测

水源性隐孢子虫病暴发是一大公共卫生问题，且水中的隐孢子虫抵抗力强，因其含量少，不易检测。PCR技术快速、简便、准确、高度敏感与高度特异，该文就当前在水源性隐孢子虫的PCR检测文献资料进行综述。     

TaqMan探针实时荧光PCR方法检测粪便中微小隐孢子虫卵囊

以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)特异性DnaJ-like蛋白基因的保守序列为模板,设计和合成特异性引物和荧光标记探针,通过检测微小隐孢子虫卵囊DNA和加标模拟样品进行敏感性分析,建立标准曲线,并对其特异性和干扰性进行评价。结果显示,该方法只对微小隐孢子虫卵囊进行特异性扩增,其他常见的肠道原虫和肠道病原菌均不能扩增;微小隐孢子虫纯卵囊基因组DNA检测的灵敏度为26个/ml;对加标粪样可检测至2 600个/ml卵囊。提示本研究建立的实时荧光PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法具有快速、特异性和敏感性高等优点。     

新疆水源性隐孢子虫的检测

目的检测新疆15个城市自来水和河水隐孢子虫污染情况。方法采集水样,分别应用改良美国环保局(EPA)1622法及巢式PCR(nested-PCR)方法进行检测。1)改良EPA1622法:水样经微孔滤膜抽滤、淘洗,磁抗体分离法分离纯化后免疫荧光染色鉴定。2)Nested-PCR法:用试剂盒提取纯化的隐孢子虫卵囊基因组DNA,针对隐孢子虫小亚单位核糖体RNA(18SrRNA)部分基因,依据文献设计并合成引物,用巢式PCR扩增,产物纯化后经SspⅠ及VspⅠ单酶切,并进行RFLP分析。结果2种方法检测新疆15个地区的自来水隐孢子虫卵囊均为阴性,改良EPA1622法检测乌鲁木齐市、昌吉市、伊宁市和吐鲁番市的河水隐孢子虫卵囊阳性。巢式PCR检测乌鲁木齐市和伊宁市水样,均扩增出约830 bp的特异片段,RFLP初步鉴定为小鼠隐孢子虫基因;昌吉市和吐鲁番市河水水样PCR检测阴性。结论新疆乌鲁木齐市、伊宁市河水检出隐孢子虫,初步鉴定为小鼠隐孢子虫。而当地的饮用水未受污染。     

聚合酶链反应检测粪便中微小隐孢子虫

目的：利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）原理建立一种敏感且特异的方法检测人和动物粪便标本中的微小隐孢子虫（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ，Ｃ．ｐ．）。方法：从含有Ｃ．ｐ．卵囊的人和豚鼠粪便标本中直接提取ＤＮＡ用作ＰＣＲ的模板。用一对人工合成的寡核苷酸序列作为ＰＣＲ引物，扩增长为４５２ｂｐ的Ｃ．ｐ．目的ＤＮＡ片段。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色检测。结果：从感染Ｃ．ｐ．的人和豚鼠粪便标本ＤＮＡ抽提物中均扩增出目的片段，而从其他几种寄生虫、肠道微生物或宿主ＤＮＡ中均不能扩增出目的片段。本方法的敏感性比目前常用的检测方法高约１００倍。结论：ＰＣＲ技术检测人和动物粪便中的Ｃ．ｐ．，具有敏感性高且特异性强的特点，有希望成为隐孢子虫病诊断和流行病学调查的有力手段。     

微小隐孢子虫的基因检测实验研究

目的　探讨聚合酶链反应 (PCR)检测微小隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性。　方法用 Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊。用酚 -氯仿法抽提卵囊总 DNA。针对本虫 18S r RNA基因片段设计 1对引物 ,对模板 DNA进行 PCR扩增 ,同时以蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴 (Entamoeba histolytica)、阴道毛滴虫 (Trichomonas vaginalis)、刚地弓形虫 (Toxoplasma gondii)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)和旋毛虫 (Trichinella spiralis) ,以及人体血细胞等 DNA样本为对照。用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对 PCR产物进行检测。　结果　仅微小隐孢子虫 DNA被扩增出一 5 0 0 bp的 DNA片段。其它对照 DNA样本均未出现扩增反应。　结论　PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达 10 0 % ,敏感性也很强 ,可检测到 2 0 pg微小隐孢子虫卵囊的DNA。表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的 PCR方法有效     

聚合酶链反应检测隐孢子虫

微小隐孢子虫 (Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ ,Ｃｐ)是引起人类腹泻的重要原因之一[1 3] ,获得性免疫缺陷综合征(ＡＩＤＳ)患者也常易感染。现有微小隐孢子虫病的诊断方法中 ,粪便涂片染色查找卵囊可因粪中卵囊太少、染色剂放置过久、操作方法不熟练或因非特异性嗜酸性颗粒出现而漏诊、误诊。免疫学试验欠敏感 ,体外培养周期太长 ,且难以控制。应用核酸杂交技术检测微小隐孢子虫灵敏、特异 ,但耗时、烦琐、技术要求高和价格昂贵 ,不适宜于临床应用。近年报道聚合酶链反应 (ＰＣＲ)对检测微小隐孢子虫具有高度特异性和灵敏性…     

水体中隐孢子虫的检测方法

隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)是一类顶复门肠道原虫,隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由隐孢子虫引起的人兽共患原虫病.由于隐孢子虫病可通过水传播,故该文对水体中隐孢子虫的常规检测包括样品收集、浓缩、卵囊分离和染色镜检等步骤,和常用分子生物学方法如多种PCR方法和基于核酸序列的扩增方法等进行综述.     

聚合酶链反应技术在隐孢子虫检测中的应用研究

根据Laxer等克隆的微小隐孢子虫（C．parvum）核酸序列片断（pHCl）设计并合成一对长度为20hp的寡核苷酸引物。应用聚合酶链反应，对隐孢子虫核酸进行扩增，结果扩增出452hP的特异性条带，阴性对照无扩增。结果表明所合成引物有高度特异性。用PCR检测隐抱子虫感染动物模型，36份镜检卵囊阳性小鼠粪便均为阳性，18份镜检阴性小鼠粪便17份阴性，一份阳性。     

牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定

目的 用巢式PCR鉴定1株自然感染的上海牛源隐孢子虫。 方法 改良抗酸染色法检查含隐孢子虫卵囊的牛粪,油镜下观察卵囊形态,测量大小。以牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18S rRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增目的片段,测序,同源性比对,并运用MEGA4.0软件构建系统发育树。 结果 上海牛源隐孢子虫分离株卵囊呈圆形或椭圆形,大小为（5.6±0.49）mm×（5.2±0.51）mm。扩增出的18S rRNA基因片段为812 bp。上海牛源隐孢子虫分离株的18S rRNA与巴西的牛隐孢子虫（Cryptospridium bovis,GenＢank登录号为151935628）序列一致性为100%,两者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系最近;与中国青海、蒙古国、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%。 结论 上海牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫（C. bovis）。     

Human cryptosporidiosis and Cryptosporidium spp. in Haiti

Contamination by water-born infectious diseases is closely linked to urban slums conditions such as overcrowding and high level of faecal pollution by animal and human excreta. In this environment, cryptosporidiosis is a major cause of acute diarrhoea in children and chronic persistent diarrhoea in AIDS patients, resulting in increased morbidity and mortality in both populations. The aims of this study conducted in Port-au-Prince, Haiti were to: (i) determine the frequency of Cryptosporidium infection in two populations of patients with diarrhoea, children and AIDS patients, and the existence of Cryptosporidium carriage in healthy adults living in close contact with them; (ii) identify by molecular genotyping the Cryptosporidium species involved; and (iii) evaluate the viability of Cryptosporidium oocysts isolated from human stools. From January 2000 to January 2001, 158 of 1529 diarrhoea stool samples collected from 93 patients with diarrhoea, 57 adults followed at Centres GHESKIO and 36 children admitted at the University Hospital in Port-au-Prince contained Cryptosporidium oocysts (10.3%). The majority of adult patients (98%) were HIV-infected whereas the majority of children (81%) tested negative for HIV. Cryptosporidium was documented in only 1/102 healthy persons living in contact with Cryptosporidium infected patients and infection was with the same genotype as that of the contact patient. Among the 69 Cryptosporidium isolates studied for genotyping, three species were identified: C. hominis (59%), C. parvum (38%) and C. felis (3%). The two C. felis cases are the first reported from AIDS patients in the Caribbean. Most of the children regardless of their HIV status were infected with C. hominis (72%), whereas AIDS patients were more likely to be infected by either human or animal genotypes. These data confirm that immunocompromised individuals are susceptible to a wide range of Cryptosporidium spp. Viability of Cryptosporidium oocysts were determined in an experimental mouse model for 17/18 specimen studied including in 12/13 C. hominis, 4/4 C. parvum and 1/1 C. felis. Infectivity in newborn mice was found to be dose-dependent and more effective with C. parvum than the other two genotypes. Cryptosporidiosis remains a frequent hazard for both AIDS patients and young children in Haiti because of poor hygiene, particularly contaminated water and overcrowded conditions associated with urban slums.     

武汉市腹泻婴幼儿隐孢子虫感染的分子流行病学调查

目的了解武汉市2岁以下婴幼儿腹泻患者的隐孢子虫感染状况,为预防隐孢子虫感染提供分子流行病学依据。方法采集2014年8月—2015年7月在湖北省人民医院和武汉大学中南医院就诊的2岁以下婴幼儿腹泻患者粪便,过滤沉淀后于2.5%重铬酸钾溶液中4℃保存;采用酚-氯仿法提取基因组DNA、18S rRNA巢式PCR(Nested-PCR)扩增技术检测隐孢子虫感染,并对阳性PCR产物测序;所获序列进行Blastn比对,应用MEGA软件采用邻接法构建系统进化树进行虫种鉴定。结果共收集到298份婴幼儿腹泻患者的粪便样本。经巢式PCR扩增技术检测,298份样品中有9份扩增出隐孢子虫阳性条带,阳性率为3.02%(9/298),其中1~2岁腹泻幼儿阳性率为5.93%(7/118),1岁患儿的阳性率为1.11%(2/180),差异有统计学意义(χ~2=4.13,P0.05)。9份阳性PCR产物经测序后与Gen Bank中的参照序列进行比对,结果显示7份样本为微小隐孢子虫感染,2份样本为微小隐孢子虫与人隐孢子虫混合感染。绘制种系发育进化树发现,9条SSU r RNA基因序列与已发表的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)位于同一个进化支上。结论武汉地区婴幼儿腹泻患者中存在隐孢子虫感染,主要感染虫种为微小隐孢子虫。     

Molecular determination and genotyping of Cryptosporidium spp.in fecal and respiratory samples of industrial poultry in Iran

Objective:To identify the genotypes of prevalent Cryptosporidia in broiler chickens in Lorestan province,Iran.Methods:A total of 1 000 fecal and 1 000 trachea samples were collected from chickens.Smears from both fecal and tracheal samples were stained with modified ZiehlNeelsen method and nested PCR-RFTP according to amplification of 18S rRNA gene using Ssp1 and Vsp 1 restriction enzymes and DNA sequencing.Results:From the examined chickens0.7%was positive for Cryptosporidium,Infection was present in 0.3%fecal samples and also in0.5%trachea.Only 0.3%of simultaneous infections in fecal and tracheal samples were observed.Nested PCR of our isolates demonstrated Cryptosporidium baileyi.Conclusions:In our work,low rate of Cryptosporidium baileyi infection was detected,but in critical situations and our poor management circumstances,cryptosporidiosis occurs in serious feature especially in immune suppressed individuals.     

长春地区医院就诊患者隐孢子虫感染的血清学检测

表达并纯化微小隐孢子虫表面抗原CP23重组蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫反应性。采集2010年8～11月份长春市部分医院的各年龄段患者血清,用间接ELISA法检测血清中抗CP23的IgG抗体。Westernblotting分析结果显示,重组蛋白CP23能被感染微小隐孢子虫的牛血清和人阳性血清识别,不能被感染日本血吸虫的小鼠血清、恶性疟患者血清和人阴性血清识别。共采集血清2 046份,总阳性率为3.2%(65/2 046),男性和女性阳性率分别为2.7%(28/1 036)和3.7%(37/1 010),性别间差异无统计学意义(P>0.05)。不同年龄段人群的阳性率差异有统计学意义(P<0.05),71～80岁年龄段的阳性率最高(8.6%,13/152)。