人TSARG4真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的: 构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系.方法: 应用 RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将 PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证.随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中.用脂质体将经过测序、验证的pcDNA3.1(+)/TSARG4质粒转染HeLa细胞,通过G418筛选建立TSARG4稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交技术检测TSARG4在稳定转染的HeLa细胞系中的表达.结果: 成功构建了pcDNA3.1(+)/TSARG4表达质粒,建立了稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交检测结果表明,TSARG4基因在该细胞系中成功表达.结论: TSARG4真核表达载体成功构建和稳定转染HeLa细胞系的建立为进一步体外研究TSARG4的功能奠定了基础.     

重组结缔组织生长因子对大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化的影响

目的:克隆和构建带大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/CTGF,并观察其对血管外膜成纤维细胞(AF)表型的影响。 方法:以AF总RNA为模板，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，获得CTGF的cDNA，克隆入pcDNA3.1(+)载体，酶切和测序鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1(+)/CTGF用脂质体法转入AF细胞。Western blotting观察CTGF的表达。同时观察转染pcDNA3.1(+)/CTGF对细胞表型的影响。 结果:成功构建大鼠CTGF基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/CTGF．并证明其能在真核细胞内表达。转染pcDNA3.1(+)/CTGF可以诱导AF表型转化。 结论:重组结缔组织生长因子可诱导大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化。     

野生型和突变型人白介素13哺乳细胞表达质粒的构建

目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒。方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列。PCR产物和pcDNA3.1表达载体经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g。将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组。结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础。     

HBV基因组各基因真核表达载体的构建及转染

目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/HBs、pcDNA3.1( )/HBc、pcDNA3.1( )/HBe、pcDNA3.1( )/HBp、pcDNA3.1( )/HB-preS1、pcDNA3.1( )/HB-preS2、pcDNA3.1( )/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.     

人MICA*008等位基因预筛选及其真核表达载体的构建与表达

目的:应用序列特异性PCR技术(PCR-SSP)分析不同细胞系中MICA*008等位基因特异性位点,筛选出人MICA*008基因型,并构建其真核表达载体.方法:PCR-SSP技术分析本实验室保存的多种人源性细胞系中多态性基因MICA的特异性位点,预筛选出包含MICA*008等位基因的细胞系,应用RT-PCR扩增MICA*008基因片段,随后克隆到pcDNA3(+)真核表达载体,用经过测序、鉴定的pcDNA3(+)/MICA*008质粒转染结肠癌细胞系sw480,通过流式细胞术检测MICA膜蛋白表达水平.结果:预筛选出包含MICA*008基因型的细胞系,成功构建了pcDNA3(+)/MICA*008质粒,pcDNA3(+)/MICA*008转染sw480细胞系后,其MICA膜蛋白表达水平明显提高.结论:验证了应用PCR-SSP技术对细胞系中对特定MICA等位基因预筛选的可行性,成功构建了多态性MICA基因中MICA*008等位基因的真核表达载体pcDNA3(+)/MICA*008并转染结肠癌细胞系sw480,为后续体外研究MICA*008在结肠癌及其他肿瘤的作用奠定了基础.     

幽门螺杆菌Lpp20核酸疫苗的构建及其免疫活性的初步研究

目的 构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Lpp20,并在HeLa细胞中进行表达.通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平.方法 用PCR法扩增Lpp20全基因,再将Lpp20基因克隆至pcDNA3.1(+)真核细胞表达载体构建pcDNA3.1(+)/Lpp20重组体,观察其在HeLa细胞中的表达.将核酸疫苗PcDNA3.1(+)/Lpp20、对照空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分组通过肌肉注射免疫6周龄C57BL/6小鼠.隔2周免疫一次,共免疫4次.间接ELISA法测定小鼠血清中抗Lpp20 IgG抗体水平,双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应.通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在.结果 小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,6周后ELISA测定血清抗体A450值为0.74,效价为1:1024.核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显升高[(410.36±56.23)ps/ml],与空质粒组[(25.26±10.85)pg/ml]之间差异有统计学意义(P<0.01).脾淋巴细胞增殖反应测定,核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数(2.37±0.22)明显高于空质粒组(1.53±0.47)和PBS组(1.20±0.13),P<0.01.PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在.结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗,且其在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答.为进一步研究该疫苗的免疫保护作用提供实验依据.     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建HBsAg真核表达质粒.方法用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-S;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定.结果经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒构建正确.结论真核表达质粒pcDNA3.1-S构建成功.     

MMP-13基因真核表达载体的构建及其功能研究

目的为了研究MMP-13蛋白在瘢痕形成的作用,我们构建MMP-13基因真核重组表达质粒,检测并鉴定了MMP-13基因在转染了重组质粒的皮肤角质形成细胞HaCat中的表达。方法通过RT-PCR方法将MMP-13基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建其真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13,基因测序鉴定。重组质粒以阳离子脂质体2000介导转染HaCat细胞,RT-PCR检测外源基因的表达,间接免疫荧光和Western blot检测外源蛋白的表达。以明胶酶谱法和MTT法分别检测MMP-13的活性以及其对HaCat细胞增殖的影响。结果通过RT-PCR检测到MMP-13基因在重组质粒转染后的HaCat细胞中大量表达,以间接免疫荧光反应和Western blot可检测到MMP-13蛋白在在重组质粒转染后的HaCat细胞中呈阳性,明胶酶谱法和MTT法检测显示真核表达质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13表达的MMP-13蛋白具有活性,并且可以抑制HaCat细胞的增殖。结论构建的重组质粒pcDNA3.1(+)/MMP-13能在Hacat细胞中表达活性蛋白MMP-13,并可以抑制HaCat细胞的增殖,这为研究MMP-13在瘢痕形成中的作用奠定了基础,从而为瘢痕治疗提供有效靶标。     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受。推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用。目的:构建大鼠Delta1基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上。利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达。结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的HindIII和XbaI双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Delta1送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确。转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Delta1的表达显著增高。实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白。     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT-PCR方法扩增SEPT7cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。     

人脂联素球状结构域基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统表达人脂联素球状结构域（gAd）基因。方法以人基因组为模板,PCR法扩增人gad基因,将gAd基因与供体质粒pFastBacHTB连接,转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac。筛选转座成功的重组穿梭载体Bacmid—gAd,通过脂质体介导,转染昆虫细胞Sf9,经SDS-PAGE、免疫印迹法检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,SDS-PAGE电泳结果显示,BacmidgAd组和对照组相比．在相对分子质量15000～25000之间多出一清晰的蛋白条带．免疫印迹法证实该条带能与相应的抗His标签抗体结合。结论人gAd基因成功在真核细胞中表达,为后续的实验研究奠定了基础。     

小鼠轻度病毒性心肌炎急性期心肌组织MHCⅡ类抗原的表达

为研究小鼠急性病毒性心肌炎心肌MHCⅡ类抗原的表达规律,探索急性期轻度病毒性心肌炎的发病机制,以适量柯萨奇B3病毒感染BALB／c小鼠制成小鼠病毒性心肌炎模型,对病鼠的心肌进行MHCⅡ类抗原表达强度的半定量记分（MS）与心肌病变积分（PS）无相关。实验提示,心肌MHCⅡ类抗原的异常表达是轻度病毒性心肌炎急性期的发病机制之一：自身免疫反应在病毒性心肌炎急性期与心肌病变的严重程度无相关。     

TGF—αT —Ⅱ在乳腺癌患者围手术期的表达

胰岛素样生长因子(IGF-Ⅱ)和转化生长因子(TGF-α)是具有广泛生物学活性的多肽类生长因子,但在正常组织及肿瘤组织中的表达如何,研究报道不一。本文测定了乳腺癌患者血液、尿液及肿瘤组织IGF-Ⅱ和TGF-α水平,旨在探讨其在乳腺癌患者围手术期的表达及生物学意义。1材料和方法1.1研究对象21例女性,年龄40～71岁,均系本院手术后经病理诊断证实的乳腺癌患者。其中浸润型导管癌14例,乳腺髓样癌3例,乳腺低分化腺癌2例,导管浸润癌伴腺癌2例;正常对照组:30例,为我院查体健康的女性,年龄38～55岁。1.2标本采集及检测方法采集乳腺癌患者手术前血…     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体（FcεRⅡ）基因的原核表达系统。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FcεRⅡcDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体FcεRⅡ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FcεRⅡ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FcεRⅡ的表达。结果测序表明所扩增FcεRⅡcDNA基因,与已报道的序列一致。获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合。结论成功构建了FcεRⅡ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人IgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FcεRⅡ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础。     

pHsa—m122真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的构建肝脏特异性的微RNA—miR-122真核细胞表达载体并对其表达活性进行鉴定。方法经PCR从人基因组DNA中扩增肝脏特异性的微RNA—miR-122的前体序列，引入酶切位点和Poly T转录终止序列，将其插入siRNA专用真核表达载体pSuper中。将构建载体进行酶切、测序鉴定，再通过共转染含miR-122靶序列的GFP表达质粒后．经荧光显微镜和流式细胞仪及Western Blot检测，鉴定载体功能性表达。结果miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上，且可表达出具有生物活性的miR-122，将该真核表达载体命名为pHsa-m122。结论成功构建miR-122真核表达载体pHsa-m122，有助于进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用。