p65基因序列shRNA慢病毒载体构建及其作用功能的初步研究

目的 建立稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中核因子NF-κB(p65)表达的shRNA序列,构建慢病毒载体,检测p65在前列腺癌细胞中的作用功能.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补单链DNA将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中转染前列腺癌细胞,采用RTPCR方法检测不同序列片断对p65 mRNA的抑制效率,免疫印迹方法检测其对p65蛋白表达的抑制效率.将获得的慢病毒载体感染LNCaP细胞,设对照组、空转组.采用MTT、流式细胞术、Transwell等方法检测p65的生物学作用.结果 设计的3条针对p65序列中,第3条序列对前列腺癌细胞株中p65 mRNA的干扰效率为59%,对蛋白表达的抑制率达81%.目的序列位于p65(NM_021975)的1096～1113,茎环序列为5'-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGAT-GACGTAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3'.转染细胞后,细胞可以稳定低表达p65.MTT检测实验组细胞96 h内未出现对数增殖,生长能力低于对照组和空转组.流式细胞检测实验组G0～G1期细胞百分率为61.49%,高于对照组的44.89%和空转组的41.52%;而S期细胞百分率为28.58%,低于对照组的47.36%和空转组的46.10%,差异有统计学意义(P＜0.05).Transwell检测实验组透过细胞数为(16.5000±6.62076)个,低于对照组和空转组[(45.6333±13.54159)个,(36.8333±5.68412)个],差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中p65表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体;初步验证了p65在前列腺癌细胞增殖、侵袭和转移中的促进作用.     

p65基因序列shRNA慢病毒载体构建及其作用功能的初步研究

Objective To obtain shRNA sequences that can stably block the expression of Nuclear Factor kappa- B (p65) in the prostate cancer cell line LNCaP and construct the lentivirus vector.And validate the gene function of p65 in the cell line. Methods According to p65 genetic information, we design siRNA1, siRNA2, siRNA3 those three siRNA sequences targeting the ods area of p65 gene and then form the corresponding four pairs of complementary single strand DNA of shRNA, including the sense strand and the antisense strand. The synthetic shRNA sequence was inserted into the empty pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector, and after transfecting the prostate cancer cells , the inhibitory effect of p65 mRNA by different sequences was detected through real-time PCR, and the inhibitory effect of p65 protein expression was detected by Western-blotting. Thus we can obtain highly effective shRNA sequences in the inhibition of p65 in prostate cancer cells. MTT, flow cytometry, transwell were chosen to test the cell growth, migration and invasive power in vitro to compare the difference of the experimental group, control group and negative group. Results The third shRNA sequence had the best inhibitory effect and the inhibitory effect of p65 mRNA in prostate cancer cell line was 59 % and the protein was 81%. It's position locates in p65 (NM_021975 ) 1096-1113 and it's stemloop sequence is 5'-GATCCGCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGATGACGTAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3'. After transfecting, the prostate cancer cell line had the low expression of p65 stably. Through MTT, we got the growth curve, which showed that the growth ability of experimental group was significantly decreased compared with the control group and the Logarithmic growth didn't appear in the first 96 hours. Flow cytometry test displayed that the percentage of G0-G1-phase cells in experimental group was 61.49%, and the control group was 44.89%, idle group was 41.52%, which was increasing oberviously. The S-phase cells in the experimental group was 28.58%, compared with the 47.36% and 46. 10% diminished. The results of transwell showed that the experimental group had 16. 5000±6. 62076 cells and the other two groups had 45. 6333 13. 54159 and 36. 8333±5. 68412 cells, which showed the invasive power of experimental group was significantly declined(P＜0.05).Conclusions It's successful to obtain shRNA sequences that can stably block the expression of p65 in the prostate cancer cell line LNCaP and construct the lentivirus vector. p65 can positively regulates the biological behavior of prostate cancer LNCaP cell line in the cell growth, migration and invasive power.     

p65基因序列shRNA慢病毒载体构建及其作用功能的初步研究

Objective To obtain shRNA sequences that can stably block the expression of Nuclear Factor kappa- B (p65) in the prostate cancer cell line LNCaP and construct the lentivirus vector.And validate the gene function of p65 in the cell line. Methods According to p65 genetic information, we design siRNA1, siRNA2, siRNA3 those three siRNA sequences targeting the ods area of p65 gene and then form the corresponding four pairs of complementary single strand DNA of shRNA, including the sense strand and the antisense strand. The synthetic shRNA sequence was inserted into the empty pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector, and after transfecting the prostate cancer cells , the inhibitory effect of p65 mRNA by different sequences was detected through real-time PCR, and the inhibitory effect of p65 protein expression was detected by Western-blotting. Thus we can obtain highly effective shRNA sequences in the inhibition of p65 in prostate cancer cells. MTT, flow cytometry, transwell were chosen to test the cell growth, migration and invasive power in vitro to compare the difference of the experimental group, control group and negative group. Results The third shRNA sequence had the best inhibitory effect and the inhibitory effect of p65 mRNA in prostate cancer cell line was 59 % and the protein was 81%. It's position locates in p65 (NM_021975 ) 1096-1113 and it's stemloop sequence is 5'-GATCCGCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGATGACGTAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3'. After transfecting, the prostate cancer cell line had the low expression of p65 stably. Through MTT, we got the growth curve, which showed that the growth ability of experimental group was significantly decreased compared with the control group and the Logarithmic growth didn't appear in the first 96 hours. Flow cytometry test displayed that the percentage of G0-G1-phase cells in experimental group was 61.49%, and the control group was 44.89%, idle group was 41.52%, which was increasing oberviously. The S-phase cells in the experimental group was 28.58%, compared with the 47.36% and 46. 10% diminished. The results of transwell showed that the experimental group had 16. 5000±6. 62076 cells and the other two groups had 45. 6333 13. 54159 and 36. 8333±5. 68412 cells, which showed the invasive power of experimental group was significantly declined(P＜0.05).Conclusions It's successful to obtain shRNA sequences that can stably block the expression of p65 in the prostate cancer cell line LNCaP and construct the lentivirus vector. p65 can positively regulates the biological behavior of prostate cancer LNCaP cell line in the cell growth, migration and invasive power.     

高效抑制核因子κ—B的茎环RNA基因序列的获得

目的获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中核因子kappa—B表达的shRNA序列。方法根据核因子kappa—B基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对核因子kappa-B基因cds区的siRNA序列及无意义的对照序列,组建与之对应的4对互补的单链DNA序列,包括siRNA的正义链和反义链：正义链序列按5’向3’顺序依次为：酶切位点（BamH Ⅰ）、干扰序列（19bp）、loop环（TFCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19bp）、中止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoR Ⅰ）。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real—timePCR检测不同序列片断对核因子kappa—B的mRNA抑制效果。结果设计的3条针对核因子kappa—B的序列中第3条的抑制效果最好,目的序列位于核因子KAPPA—B（NM_021975）的1096到1113,茎环序列为5＇-GATCC GCCCTATCCCTITACGTCA TTCAAGAGA TGACGTAAAGGGATAGGGC TTITT G-3’。其对前列腺癌细胞株中核因子kappa—B的mRNA的干扰效率为59％,对其蛋白表达的抑制率为81％。转染细胞后,细胞可以稳定低表达核因子kappa—B。结论成功获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中核因子kappa—B表达的shRNA序列,为后期研究核因子kappa-B在前列腺癌发病中的作用机理等研究提供了基础。     

靶向于前列腺癌特异性膜抗原shRNA的筛选与鉴定

目的 获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)表达的shRNA序列.方法 根据PSMA基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列及无意义的对照序列,组建与之对应的4对互补的单链DNA序列,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5'向3'顺序依次为:酶切位点(BamH Ⅰ)、干扰序列(19 bp)、loop环(TrCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列(19 bp)、中止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoR Ⅰ).将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time PCR检测不同序列片段对PSMA的mRNA抑制效果并通过Western blot检测对目的 蛋白PSMA的抑制效果.结果 设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好,目的 序列位于PSMA(NM_004476)的1207到1226,茎环序列为5'-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAATrcAAGAGA TTGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3'.其对前列腺癌细胞株中PSMA的mRNA的抑制率为60.0%,对其蛋白表达的抑制率为86%.转染细胞后,细胞可以稳定低表达PSMA.结论 成功获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中PSMA表达的shRNA序列.     

靶向沉默核干因子对前列腺癌PC-3细胞增殖能力的影响

目的:检测前列腺癌PC-3、LNCaP及DU145细胞中核干因子(Nucleostemin,NS)基因的表达,研究NS基因沉默后对PC-3细胞增殖能力的影响。方法:采用免疫细胞化学法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测NS蛋白及mRNA在3种前列腺癌细胞中的表达。用NS特异性小发夹RNA表达质粒转染PC-3细胞,分别用RT-PCR及Western印迹方法检测转染后细胞(简称NS-shRNA-PC-3)中NSmRNA及蛋白的变化。比较NS基因沉默前后PC-3细胞体外、裸鼠体内增殖能力及凋亡情况的变化。结果:3种细胞中均显示NS基因高表达。转染后NS-shRNA-PC-3细胞中NS表达显著降低,细胞增殖速度减慢,G0/G1期细胞百分率显著升高,早期凋亡细胞增多。体内致瘤实验显示,NS基因沉默后,PC-3细胞在裸鼠体内增殖能力显著降低。结论:NS在前列腺癌细胞系中呈高表达,RNA干扰沉默NS基因后PC-3细胞增殖能力显著降低,凋亡细胞增多。     

靶向前列腺癌并携带SATB1基因shRNA溶瘤腺病毒的构建

目的:构建DD3启动子调控并携带SATB1基因shRNA溶瘤腺病毒,研究其对前列腺癌的特异抗肿瘤作用。方法:以pSilencer3.1-SATB1为模板,通过PCR扩增出SATB1-shRNA表达框并克隆至pZD55载体,构建重组质粒pZD55-SATB1-shRNA。EcoRⅤ和XbaⅠ分别酶切pZD55-SATB1-shRNA和pZXC2-DD3-E1A,将目的片段连接重组,获得质粒pDD3-ZD55-SATB1,将其与腺病毒包装质粒pBHGE3共转染293细胞。PCR鉴定正确者即为溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1。扩增,纯化,测病毒滴度。结晶紫染色观察对前列腺癌细胞毒性;Western印迹检测E1A在列腺癌细胞中的表达;RT-PCR和Western印迹检测列腺癌细胞中SATB1基因沉默效果。结果:成功构建DD3启动子调控同时携带SATB1-shRNA的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1,初步证实DD3-ZD55-SATB1复制具有高度的前列腺癌靶向性和特异的SATB1基因沉默效果。结论:成功构建的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1为进一步体内外研究其对前列腺癌的治疗作用奠定基础。     

pSIREN-survivin/shRNA表达载体的构建与鉴定

目的：构建pSIREN-survivin/shRNA重组质粒并鉴定, 为探索瘢痕疙瘩基因治疗的RNA干扰（RNAi）途径奠定基础。 方法：根据基因库survivin cDNA序列及Reynolds设计原则, 设计并合成两端有酶切位点的65个碱基的寡核苷酸链, 退火成互补双链后用T4DNA酶克隆至线性化的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中; 转化大肠杆菌DH-5a菌株, 提取质粒行酶切鉴定, 测序分析。 结果：PCR扩增片断出现465 bp大小的目的基因条带与预期结果相符; 双酶切见约65 bp目的基因条带; 插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。 结论：成功构建重组质粒pSIREN-survivin/shRNA, 为下一步用脂质体转染瘢痕或肿瘤细胞的研究奠定基础。     

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pS ilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰(RNA i)阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pS ilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTT法检测细胞生长速度的变化。结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pS ilencer3.1-SVV1、pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。     

靶向Pik3cb shRNA表达载体的构建及其对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的构建大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体，并检测其下调大鼠血管平滑肌细胞Pik3cb mRNA表达的效应。方法根据Genbank中大鼠Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1，酶切鉴定和测序无误后分别命名为pU6-Pik3cb—shRNA．1和pU6-Pik3cb—shRNA-2。通过脂质体转染大鼠胸主动脉平滑肌细胞，确定转染效率；通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测Pik3cb mRNA的表达；TUNEL法检测细胞凋亡。结果pU6-Pik3cb—shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2经测序和PCR扩增与原序列相同，转染大鼠平滑肌细胞48h时转染率为15．7％，荧光定量PCR结果显示转染组Pik3cb mRNA表达明显减少，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），错配质粒组与对照组比较Pil（3cb mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）。TUNEL结果显示转染组凋亡细胞明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建重组真核表达质粒pU6-Pik3cb—shRNA，并有效下调大鼠胸主动脉平滑肌细胞Pik3cb mRNA的表达，为靶向Pik3cb防治移植血管再狭窄的基因治疗奠定了基础。     

大鼠Aggrecanse-1，2特异性shRNA慢病毒表达载体的构建及测序

目的：利用RNA干扰技术，以大鼠aggrecanse-1，2基因为靶基因，设计aggrecanse-1，2基因特异性的小干扰RNA（siRNA），构建其短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒表达载体，并进行测序鉴定。方法：根据Tuschl原则设计并合成大鼠aggrecanse-1，2基因特异性的DNA寡核苷酸，连接到经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切线性化的pKCSHR-GFP质粒上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。结果：将合成的8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后，分别克隆到线性化的pKCSHR-GFP载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下，筛选出相应的阳性菌落，经DNA测序鉴定确定为设计的序列。结论：成功构建了8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体，可进一步用于干扰aggrecanse-1，2基因的mRNA转录，从而为制备aggrecanse-1，2基因表达受抑制的大鼠软骨细胞奠定基础。     

靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法：体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果：HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列（P〈0.05）。结论：成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

人白介素-8 shRNA慢病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携载人白介素-8(IL-8)shRNA的慢病毒并鉴定其对MDA-MB-231细胞该基因的沉默效率。方法:设计两个IL-8基因特异性siRNA靶点,与pMagic7.1慢病毒载体质粒重组,经PCR鉴定并测序,通过293T细胞实现慢病毒包装,DNA定量试剂盒分别检测两种慢病毒滴度。将这两种慢病毒分别以最佳感染复数感染MDA-MB-231细胞,通过Real-time PCR检测IL-8沉默效率。结果:PCR鉴定阳性的shRNA重组质粒测序正确,包装后两种病毒滴度分别为1.93×109 IU/mL和1.89×109IU/mL;分别以MOI=40感染MDA-MB-231细胞后,IL-8沉默效率分别为80%和90%。结论:成功构建IL-8 shRNA慢病毒并达到较高的沉默效率,为下一步研究沉默靶基因后细胞生物学功能变化提供实验基础。     

Omi/HtrA2对前列腺癌细胞的促凋亡作用

目的检测人前列腺癌细胞（PC-3M）中Omi／HtrA2的表达情况，并构建其小干扰RNA（siRNA）表达载体。探讨Omi／HtrA2对PC-3M凋亡的影响。方法以细胞免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测Omi／HtrA2在前列腺癌细胞系（PC-3M）和正常前列腺细胞中的表达。利用软件辅助设计Omi／HtrA2特异性siRNA序列。体外合成后将其克隆入真核表达载体psiRNA-hHlneo。以脂质体法转染psiRNA-Omi／HtrA2载体至PC-3M中，以RToPCR和Western blot法检测psiRNA-Omi／HtrA2对Omi／HtrA2转录和表达的沉默效应。用噻唑蓝（MTT）比色法和流式细胞法检测siRNA导致Omi／HtrA2基因沉默后。PC-3M细胞凋亡的变化。结果细胞免疫组织化学和RT-PCR均显示Omi／HtrA2在PC3M细胞中高表达。酶切和DNA测序证实合成的siR-NA基因序列正确。并已被准确克隆入psiRNA-hHlneo载体中。psiRNA-Omi／HtrA2载体可特异性抑制PC3M细胞中Omi／HtrA2的表达。转染psiRNA-Omi／HtrA2载体的PC-3M细胞凋亡下调。结论促凋亡因子Omi／HtrA2可导致前列腺癌细胞凋亡，Omi／HtrA2的表达对前列腺癌的发展有重要作用。     

短发夹状RNA抑制缺氧诱导因子1α在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建产生缺氧诱导因子1α(HIF-1α)特异性短发夹状RNA(shRNA)的载体并检测其抑制作用,探讨该技术在前列腺癌治疗中的应用前景。方法:设计、合成针对HIF-1α的特异性shRNA模板序列,将其插入含有U6启动子的psilencerTM2.1-U6载体中,得到shRNA表达载体psilencer-HIF,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞株PC-3M,应用绿色荧光蛋白质粒pEGFP共转染评价转染效率,RT-PCR及Western印迹检测其对HIF-1α表达的影响。结果:重组质粒psilencer-HIF经测序分析证实与设计的完全一致,共转染24 h后质粒转染效率为(89.26±4.72)%,其产生的shRNA在PC-3M细胞中能诱导RNA干扰(RNAi),转染后48 h HIF-1αmRNA和蛋白水平分别下降82.09%和81.61%(P<0.01);而阴性对照组HIF-1α表达水平无明显改变(P>0.05)。结论:成功构建了HIF-1α基因shRNA表达质粒,其可有效抑制前列腺癌细胞中的HIF-1α的表达,为前列腺癌的基因治疗提供了新思路。     

微小RNA-138-5p在前列腺癌细胞中的表达及对其侵袭能力的影响

目的:探讨微小RNA(miR)-138-5p在前列腺癌(PCa)中的表达及对前列腺癌侵袭、迁移、凋亡等能力的影响。方法:miR-138-5p模拟物转染正常前列腺上皮细胞(RWPE)-1、DU145细胞,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)用于检测转染前后细胞miR-138-5p的表达。细胞计数试剂盒(CCK-8...     

RNA干扰技术沉默STAT3对人前列腺癌细胞生长的抑制作用

目的: 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对人前列腺癌细胞PC3及LNCaP的生长抑制作用。　方法: 针对STAT3mRNA序列设计合成 3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,转染PC3及LNCaP细胞;采用Western印迹、Northern印迹等技术观察重组质粒对STAT3基因表达的影响;用MTT法观察重组质粒对PC3及LNCaP细胞体外生长抑制作用;用流式细胞术(FCM)及吖啶橙染色检测重组质粒诱导细胞凋亡。　结果: 成功构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,并成功转染PC3及LNCaP细胞;Western印迹,Northern印迹结果证实重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制STAT3基因表达,抑制率为60% ~75%;MTT及FCM结果证明上述重组质粒可显著抑制PC3及LNCaP细胞的体外生长并诱导PC3细胞凋亡。结论: pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3可抑制STAT3在人前列腺癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡。     

E-cadherin重组慢病毒载体的构建及表达

[目的]构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,转染A549肿瘤细胞,观察E-cadherin的表达。[方法]根据Gene Bank E-cadherin的序列,选择设计两条序列和一条无关RNAi序列作为对照,通过Mlu I和Nde I两个酶切位点,将设计好的siRNA片段插入包装质粒PHR-SIN-CSGW-H1a(PHR)构建E-Cadherin RNAi慢病毒载体PHR-EA、PHR-EB。PCR扩增E-cadherin基因与pc DNA3.1质粒使用Bam HI、Xho I双酶切,连接鉴定后,亚克隆至慢病毒载体PHR,构建-E-cadherin过表达慢病毒载体PHR-E-cadherin。慢病毒包装后,感染A549肿瘤细胞,观察表达。[结果]成功构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,并分别经PCR和质粒酶切鉴定。RTPCR检测E-cadherin的干扰和过表达情况,两个E-cadherin的RNAi病毒感染细胞后,都能使目的基因表达下调,而E-cadherin过表达慢病毒转染后细胞的E-cadherin表达明显提高了。Western Blot检测证实E-cadherin的表达确实被慢病毒所上调和干扰。[结论]成功构建出E-cadherin基因过表达和RNAi慢病毒载体,并在A549肿瘤细胞中成功表达,为进一步转染神经干细胞观察其生物学影响及对脊髓损伤修复的效果奠定基础。