腺病毒介导hHO-1基因体外转染骨髓间充质干细胞

目的 以腺病毒（adenovirus,Adv）为载体将人血红素加氧酶(human hemo-oxygenase,hHO)-1基因转染至骨髓间充质干细胞（MSC）中,为干细胞移植联合hHO-1基因治疗心血管疾病奠定实验基础。方法 以密度梯度离心结合贴壁筛选法分离培养骨髓MSC。将携带有hHO-1基因与绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的腺病毒体外扩增与鉴定后,以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染MSC。在荧光显微镜下观察转染后GFP的表达,以反转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)法检测目的基因hHO-1 mRNA在MSC中的表达,4’6’-二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察hHO-1基因转染对MSC的影响。结果 将Adv-hHO-1体外扩增、纯化后,经PCR鉴定可得到555 bp的目的条带。转染后24 h,MSC中即可见GFP的表达,荧光强度随MOI的增加而增强。RT-PCR法检测显示,不同MOI的转染组均有hHO-1 mRNA表达,随MOI的增加其表达强度也逐渐增强（P<0.05）。DAPI染色显示,hHO-1基因转染后,细胞的生长及形态无明显变化。结论 以Adv为载体可成功地将hHO-1基因转染至骨髓MSC中,转染效率随转染滴度的增加而增加,转染后对细胞的生物学活性无明显影响。     

粒细胞集落刺激因子对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的探讨粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖的影响及其在BMSC向神经元样细胞分化中的作用。方法取16只SD大鼠的骨髓,体外培养BMSC,采用差速贴壁法分离细胞,并进行鉴定。按不同浓度给予G-CSF,分为四组（G0-3组）,G0组不含G-CSF,设为阴性对照;G1～3组分别含G-CSF5、10、20ng/ml,按1×10^5/ml密度接种于平底96孔培养板中（每孔100μl）。MTT法测定各组加入G-CSF第1、3、5、7天吸光度（A值）的变化,观察G-CSF对BMSC增殖的影响。以碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h后,按神经胶质细胞衍化营养因子（GDNF）和不同浓度G-CSF组合分组（B1-5）进一步诱导,B1不含GDNF、G-CSF,镜下观察细胞形态变化。反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测神经细胞标记物GFR-α1的表达。结果①在给予G-CSF第1、3、5、7天,G0组A值呈下降趋势（F=23.5083,P〈0.05）,G1～3组内A值呈上升趋势（F1=202.5940,F2=1301.8815,F3=1222.0091,均P〈0.05）;同一时间点组间A值比较,G2、G3组较G1组增高（P〈0.05）,G2与G3组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。②B2～5组细胞逐渐变成圆形、多角形,伸出树突,并且均表达GFR-α1,而B1组无类似改变,也不表达GFR-α1。比较各诱导组在同一时间点（诱导第1、3、7天）组间灰度比值,B2-5组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论G-CSF能促进大鼠BMSC的增殖,其适宜浓度为10ng/ml。联用GDNF和适宜浓度的G-CSF,比单用GDNF能更有效地诱导BMSC分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞对肝癌大鼠血管生成和细胞增殖的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)对肝癌大鼠血管生成和细胞增殖的影响。方法分离得到Wistar大鼠BMSC。经流式细胞术鉴定后进行体外增殖培养,制作大鼠BMSC培养基(BMSC-CM)。结果 MTT测定显示,25%、50%、75%及100%BMSC-CM组的吸光度(A值)均明显高于0 BMSC-CM组,且随着浓度的增加而升高(P0.05)。流式细胞仪测定显示,25%、50%、75%及100%BMSC-CM组的细胞增殖指数(PI)均明显高于0 BMSC-CM组,且随着浓度的增加而升高(P0.05)。ELISA测定显示,对于甲胎蛋白(AFP)的分泌情况,25%、50%、75%及100%BMSCCM组均明显高于0 BMSC-CM组,且随着吸光度(A值)的增加而升高(P0.05)。SABC法测定显示,BMSC组血管内皮因子(VEGF)表达明显高于单纯造模组(P0.05)。结论 BMSC能够明显促进肝癌大鼠血管生成与细胞增殖。     

骨髓间充质干细胞体外对1型糖尿病大鼠淋巴细胞增殖能力的影响

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外对1型糖尿病(T1DM)大鼠淋巴细胞增殖能力的影响。方法选取清洁级SD大鼠12只,取6只分离、培养BMSCs,另外6只建立T1DM模型后制备其淋巴细胞,实验分为A组(1 ml淋巴细胞)、B组〔1 ml淋巴细胞+100μl植物血凝素(PHA)〕、C组(1 ml淋巴细胞+1×106BMSCs+100μl PHA)、D组(1 ml淋巴细胞+1×105BMSCs+100μl PHA)、E组(1 ml淋巴细胞+1×104BMSCs+100μl PHA),每组5孔,培养3 d后通过噻唑蓝比色法观察BMSCs对淋巴细胞增殖能力的影响。结果五组样本的吸光值由大到小分别为:B组>A组>E组>D组>C组,A组的吸光度低于B组(P<0.05);随着BMSCs数目的增加,样本吸光度逐渐降低(P<0.05);A、B组的吸光度均高于E、D、C组;A、B、C、D、E组的淋巴细胞处于G0/G1期的百分比分别为:98.2%、89.5%、97.2%、97.1%、97.0%,仅B组淋巴细胞有10.5%处于S期;五组淋巴细胞凋亡水平从小到大依次为:B组相似文献   

葡萄糖对小鼠间充质干细胞增殖的影响

目的研究葡萄糖对骨髓间充质干细胞（MSC）的影响并探讨其机制。方法首先鉴定MSC纯度,然后设立不同的葡萄糖浓度梯度,用MTT法检测细胞的增殖、细胞周期和凋亡。结果鉴定MSC纯度〉90%。葡萄糖促进MSC增殖（P〈0.01）,高浓度葡萄糖明显增加细胞周期S期百分比（P〈0.001）和细胞凋亡率（P均〈0.01）。结论葡萄糖双向调节MSC的增殖功能,细胞周期S期阻滞和凋亡率的平衡关系也许可以解释这种双向调节作用。     

低氧、无血清培养对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡的影响

目的观察人骨髓间充质干细胞（hBM—MSCs）对低氧环境的适应能力,为其临床应用提供依据。方法体外培养hBM—MSCs,根据培养条件分为四组,常氧正常血清组培养条件为20％O2及10％FBS／HD、常氧无血清组为20％O2及0％FBS／HD,低氧正常血清组为1．5％O2及10％FBS／HD,低氧无血清组为1．5％O2及0％FBS／HD,细胞培养6、12、24、48、72、96h后采用MTT法检测四组增殖状况;流式细胞术检测四组凋亡情况。结果在10％FBS培养下,48h时低氧可显著促进细胞增殖;在整个观察时间内,低氧培养不会促进hBM—MSCs凋亡;同时元血清培养时细胞增殖受抑。结论在正常的血清培养条件下,hBM—MSCs对低氧有较好的耐受性,但是无血清培养不利于hBM—MSCs增殖,hBM-MSCs可作为缺氧相关组织修复的种子细胞。     

NT-3基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及向神经元分化的影响

目的研究神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和向神经元分化的影响,探讨转染NT-3基因的MSCs体内移植治疗脊髓损伤的可行性。方法体外培养稳定表达NT-3蛋白的MSCs,通过MTT法检测NT-3对MSCs增殖的影响;应用免疫细胞化学和免疫印迹方法检测转染NT-3的MSCs表达神经元标志物NeuN蛋白的情况。结果转染NT-3基因的MSCs生长曲线上移,细胞增殖率显著升高,与对照组相比,两者有显著差异(P<0.05),表明转染NT-3后细胞生长加快。免疫荧光染色结果显示转染NT-3的MSCs的NeuN阳性细胞数明显增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05);Western印迹检测结果显示转染NT-3的MSCs内NeuN蛋白表达明显增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05),表明NT-3促进MSCs向神经元方向分化。结论 NT-3基因转染可促进MSCs的增殖,并诱导其向神经元方向分化。     

慢病毒介导的HRE-VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:通过慢病毒系统将HRE-VEGF整合基因转染至MSCs细胞,评价该新型MSCs用于缺血性心肌病的治疗的可行性. 方法:运用同尾酶法构建9拷贝缺氧反应元件,并构建9HRE-VEGF表达载体.使用慢病毒系统将目的基因9HRE-VEGF转染干细胞建立转基因MSCs,检测其在不同缺氧、复氧时间VEGF的表达. 结果:慢病毒系统转染MSCs具有较高的转染效率,成功构建了整合有9HRE-VEGF的新型转基因MSCs,在低氧下表达VEGF,而在常氧状态下VEGF表达关闭. 结论:HRE对转导的VEGF基因表达具有调控作用,缺氧状态下VEGF稳定表达,此低氧诱导调控方式将更有利于缺血性心脏疾病的治疗.     

高迁移率族蛋白1及其受体对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及细胞因子水平的影响

目的探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)及其受体对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)增殖及细胞因子水平的影响。方法体外传代培养大鼠MSC,以25.0、50.0及100.0μg/L HMGB1分别作用细胞24 h、48 h、72 h后,MTT检测MSC的增殖情况。25.0、50.0及100.0μg/L HMGB1作用MSC 48 h后,ELISA测定细胞培养液中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)水平,Western blot检测MSC中HMGB1的晚期糖基化终产物受体(RAGE)和Toll样受体4(TLR4)的表达情况。确定HMGB1对MSC作用的最佳药物浓度后,siRNA分别抑制RAGE受体和TLR4受体,观察HMGB1对MSC增殖及分泌细胞因子水平的影响。结果 25.0μg/L HMGB1作用MSC 24 h、48 h、72 h后均能有效促细胞增殖(P0.05);25.0、50.0μg/L HMGB1作用细胞48 h后,细胞释放VEGF、b FGF明显增多,RAGE及TLR4表达也增高(P0.05)。特异siRNA转染靶向干扰MSC中TLR4的表达后,促细胞增殖及分泌VEGF、b FGF作用受到抑制(P0.05),而siRNA干扰RAGE表达对HMGB1的细胞效应无明显影响。结论 HMGB1可通过结合其受体TLR4促进MSC增殖以及VEGF、b FGF分泌。     

PARP-1沉默对骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的探讨沉默PARP-1对1,4-苯醌(PBQ)致大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的影响。方法以空载体BMSCs为对照组,以PARP-1沉默BMSCs为处理组,免疫印迹法检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)-1蛋白表达量。磷酸盐缓冲液(PBS)溶解PBQ,分别以0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0和320.0μmol/L PBQ染毒两组细胞,根据细胞活力检测结果选择合适染毒浓度后,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,Annexin V-PE/7-AAD标记的流式细胞技术检测细胞凋亡,实时荧光定量-聚合酶链反应检测两组细胞PARP-1基因表达。结果沉默细胞PARP-1蛋白表达量〔(0.15±0.02)倍〕与对照组细胞〔(1.00±0.03)倍〕相比,下降了85%(P<0.05)。PBQ染毒24 h后,相同剂量下两组细胞的活力并无显著性差异。随着PBQ染毒剂量增加,两组细胞PARP-1表达水平和凋亡率均明显增高(P<0.05),且相同剂量下PARP-1沉默细胞比对照组细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。结论 PARP-1沉默BMSCs在PBQ作用下更易发生凋亡,PARP-1可能参与了PBQ诱导的细胞凋亡。     

KATP开放剂对骨髓间充质干细胞凋亡和向心肌细胞转化心肌标志物的影响

目的 研究KATP开放剂对大鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）凋亡和向心肌细胞转化心肌标志物的影响。方法 培养4周雄性SD大鼠的BM-MSCs,以二氮嗪（Dia）和吡那地尔（Pin）预处理细胞,H2O2诱导细胞凋亡,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。在KATP开放剂处理2h后提取各组细胞总mRNA,实时定量PCR法检测心肌特异基因肌钙蛋白I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、缝隙连接蛋白43（Cx43）以及α重链蛋白（α-MHC）的mRNA表达情况。提取细胞蛋白,Western印迹法检测cTnI、CK、CK-MB蛋白的表达情况。结果 Dia和Pin 50mol/L预处理可明显降低BM-MSCs凋亡率（P＜0.05）。Dia和Pin处理2h,能使BM-MSCs的cTnI、CK、Cx43 mRNA表达显著增加（P＜0.05）;同时明显增加CK、CK-MB蛋白表达（P＜0.05）。结论 Dia和Pin能增加BM-MSCs向心肌细胞的转化心肌标志物的表达,并具有抗凋亡的作用。     

NGF基因修饰的BMSCs对VaD大鼠海马区细胞凋亡及NMDAR1表达的影响

目的探讨神经生长因子（NGF）基因修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）对血管性痴呆（VaD）大鼠海马区细胞凋亡的影响。方法以NGF和（或）绿色荧光蛋白基因转染BMSCs;两血管法制备VaD模型。将大鼠随机分为假手术组、PBS组、BMSCs组及NCF修饰组。造模1周后,尾静脉注射NCF基因修饰的BMSCs;4周后行Morris水迷宫检测,观察其行为学改变;末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记法检测海马凋亡细胞,免疫组化法检测大鼠海马区神经细胞NGF、N-甲基-D-天门冬氨酸受体1（NMDAR1）表达。结果与PBS组、BMSCs组比较,NGF修饰组逃避潜伏期明显缩短,海马区神经元凋亡率明显下降,NMDAR1表达明显降低（P〈0．05或〈0．01）。结论NGF基因修饰的BMSCs对VaD大鼠的学习记忆能力有一定改善作用;对其海马细胞有一定保护作用;可降低VaD大鼠海马区NR1表达,提高NGF表达。     

人骨髓间充质干细胞上清液对体外肝星状细胞增殖周期及MMP-1表达的影响

目的 研究骨髓间充质干细胞(BMSC)对肝星状细胞(HSC)增殖周期及基质金属蛋白酶-1(MMP-1)活性的影响,以探讨其防治肝纤维化的作用机制.方法 采用密度梯度离心法分离鉴定人BMSC,收集原代培养7d的BMSC培养上清,加入HSC中培养24 h及48 h.通过流式细胞仪观察HSC增殖周期,ELISA方法检测MMP-1浓度.结果 与HSC单独培养组相比,共培养48 h组G1期细胞显著增加(P＜0.01),S期细胞显著减少(P＜0.01),并且共培养组MMP-1表达明显增加,与对照组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 BMSC可抑制HSC的增殖,并且可能通过增加MMP-1的产生,从而起到抗纤维化的作用.     

罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的建立鸡骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养和鉴定体系。方法从1～14天龄罗曼鹤鸡骨髓中分离骨髓细胞,差速贴壁法纯化、扩增BMSCs。倒置显微镜下观察细胞形态特征,MTY法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞标志物,并分别进行成骨、成脂诱导分化能力检测。结果分离培养的细胞呈成纤维细胞样或长梭形,生长状态良好;CD29阳性表达率为92．10％,CD34阳性表达率仅为0．80％;经成骨诱导分化,出现明显的钙化结节,茜素红染色阳性;经成脂诱导分化,油红O染色阳性,细胞内出现明显的脂质小滴。结论建立了操作简单、高效的鸡BMSCs分离培养和鉴定体系,为鸡BMSCs的进一步研究和应用提供了良好的基础。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外扩增和定向诱导分化为神经元样细胞的变化,为其临床应用奠定基础。方法采用密度梯度离心法分离BM-MSCs细胞,用MesencultTM培养基和贴壁培养法培养、纯化和扩增细胞,流式细胞术检测细胞表面CD29和CD90分子表达率。采用20 ng/ml重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/ml新型人表皮生长因子（hEGF）和20 g/L二甲基亚砜（DMSO）、5 mmol/Lβ-巯基乙醇（BME）分别诱导BM-MSCs;采用免疫组化法检测细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（VIM）表达情况。结果BM-MSCs细胞增殖迅速,3周可传代培养;BM-MSCs传十代扩增1－2×10^3倍。分离和扩增BM-MSCs CD29、CD90强表达率分别为95.02%、93.81%。药物诱导后的BM-MSCs发生轴突等神经元样细胞变化,阳性表达NSE、GFAP、VIM分子。结论人BM-MSCs能体外培养和扩增,并能定向诱导分化为神经元样细胞。     

不同年龄人骨髓间充质干细胞体外培养增殖的研究

目的本研究分析不同年龄段人骨髓间充质干细胞的生长和增生情况,探讨年龄对于骨髓间充质干细胞的影响。方法采集61例不同年龄人的骨髓,分为少年组、中青年组和老年组,分离间充质干细胞,进行体外培养,观察其形态变化,对比分析其首次传代和每次传代时间、细胞克隆形成数量、细胞增长曲线的变化情况。结果体外培养的干细胞在形态上无年龄差异,均成梭形纤维状,早期呈克隆状生长。细胞的首次传代时间从少年到老年呈逐渐增加的趋势,老年组明显长于另外两组;3组的体外培养倍增时间无明显差异,但老年组的干细胞克隆数量减少（差异尚未达到统计学意义）,细胞的增殖显著低于另外两组（P<0.05）。结论人骨髓间充质干细胞的生长增殖能力随着增龄而逐渐减退,尤其在老年组呈现出更明显的变化。     

骨髓间充质干细胞移植在肝再生中的应用

随着当今医学的发展,干细胞的应用逐渐涉及到各个领域,并发挥着无限的潜能。干细胞以其自我更新及多向分化的能力可以对多种疾病进行替代治疗。肝病终末期肝细胞数量减少,肝功能衰竭,通过干细胞的替代治疗,肝功能能够得以改善,肝纤维化得到缓解甚至逆转。干细胞治疗成为有望替代肝移植的新技术。此文就干细胞在肝病治疗中的潜能作一综述,包括干细胞的来源、治疗机制、治疗途径,并对其临床应用进行探讨。     

洛伐他汀抑制大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的实验研究

目的体外以缺氧无血清条件模拟心肌梗死后的心脏缺血微环境,研究洛伐他汀是否能够抑制缺氧无血清引起的骨髓间充质干细胞（MSCs）凋亡。方法以Hoechst33342染色法及AnnexinV／PI流式细胞术检测洛伐他汀的抗凋亡作用,检测线粒体膜电位变化,进一步采用Western blot方法检测洛伐他汀对细胞色素C释放及caspase-3活化的影响。结果洛伐他汀0．01～1μmol／L能够有效地抑制缺氧无血清引起的MSCs凋亡。洛伐他汀抑制线粒体凋亡途径,增强线粒体膜电位水平、抑制细胞色素C释放,降低caspase-3活化水平。结论洛伐他汀能够抑制线粒体途径介导的凋亡,阻止caspase-3的活化,发挥抗缺氧无血清引起的MSCs凋亡,为提高移植干细胞的存活率提供了一种可能有效的干预措施。     

骨髓间充质干细胞体外对H_2O_2损伤大鼠心肌细胞的保护

目的:观察骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)对过氧化氢(H2O2)诱导乳鼠心肌细胞凋亡蛋白Bcl-2家族的影响。方法:培养新生大鼠的心肌细胞,分为3组,即对照组、模型组和BMSC处理组。用Transwell小室建立心肌细胞与BMSC共培养体系,分别于培养12、24和48h,采用MTT比色法检测单孔细胞的存活率;用Western blot法检测凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果:模型组细胞和BMSC处理组细胞在H2O2的诱导下出现细胞凋亡。造模12h后,模型组细胞的存活率明显低于对照组(P0.05);BMSC处理组细胞的存活率与模型组相比无明显差异。造模24h和48h后,BMSC处理组细胞的存活率与模型组差异明显(P0.05)。造模12h后,Bax和Bcl-2蛋白的表达无明显变化。造模24h后,BMSC处理组细胞中Bax蛋白的表达明显低于模型组(P0.05),Bcl-2蛋白的表达虽有变化,但无统计学意义。结论:BMSC可调控心肌细胞线粒体凋亡途径,减轻氧自由基对心肌细胞的损伤,其抑制凋亡的作用可能是通过下调Bax蛋白的表达而实现的。