一套系统培养鼠主动脉血管壁细胞简单可靠的方法

目的 探讨一套系统培养鼠主动脉血管壁成分细胞的简单、可重复的方法.方法 分别采用植块贴壁法进行主动脉血管平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞、结扎贴壁法进行血管内皮细胞的原代培养,胰酶消化传代;差速贴壁法及自然纯化法进行细胞纯化;转化生长因子β1诱导血管外膜成纤维细胞转化为肌成纤维细胞;相差显微镜及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、血小板/内皮细胞黏附分子(CD31)、波形蛋白(Vimentin)抗体两两联合的方式分别进行形态学和免疫细胞化学鉴定.结果 组织及细胞活性良好,血管平滑肌细胞及血管外膜成纤维细胞原代培养周期为10～12天,血管内皮细胞为12～14天.传代培养周期为7～10天.经纯化传代后的细胞纯度达95%～100%.血管平滑肌细胞呈典型的"峰-谷"状生长,α-SMA(+)/Vimentin(-);血管内皮细胞呈"铺路石"样外观,CD31(+)/α-SMA(-);血管外膜成纤维细胞形态和血管平滑肌细胞不易区分,Vimentin(+)/α-SMA(-),诱导的肌成纤维细胞Vimentin(+)/α-SMA(+).原代细胞传至10代以上仍未见生长活力减退.结论 我们建立了一套系统培养纯度高、生长状态良好的大鼠主动脉血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管外膜成纤维细胞及肌成纤维细胞的简单可靠、重复性好的方法.该法对培养小鼠主动脉壁成分细胞仍然适用.     

高糖诱导大鼠血管平滑肌细胞转分化的作用

目的:观察高糖对体外培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)功能以及与成骨细胞转分化相关蛋白表达的变化,探讨糖尿病血管病变的可能细胞/分子发病机制. 方法:用组织贴块法建立SD大鼠胸主动脉VSMCs的体外培养技术;高糖(葡萄糖浓度:50 mmol/L)作用该细胞,设相同浓度甘露醇为对照组,观察在不同的培养时间下(3、12h和第3、6、9、12d),采用免疫蛋白印迹法和间接免疫荧光法分别检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和成骨细胞特异性核转录因子(core-binging factor α-1,Cbfα-1/RUNX2)的表达.细胞钙沉积含量测定观察培养细胞钙盐的沉积. 结果:组织贴块法培养的大鼠原代胸主动脉VSMCs呈梭型,α-SMA表达强阳性;高糖作用12h,VSMCs的Cbfα-1表达明显上升;高糖作用9d后,VSMCs的α-SMA表达量较高糖作用前降低近90%;免疫荧光染色显示VSMC细胞呈低强度的α-SMA染色阳性;同时,高糖作用下的VSMCs能够检测到OPN蛋白的表达,与对照组相比差异显著;高糖作用下细胞钙沉积含量明显增加. 结论:持续的高糖作用能够使动脉VSMCs发生向类似成骨样细胞的转分化,提示高糖诱导的VSMCs转分化可能参与糖尿病血管病变的发生发展.     

人大隐静脉与胸廓内动脉平滑肌细胞生长特性的比较

目的：探讨人大隐静脉（saphenous vein,SV）与胸廓内动脉（internal thoracic artery,ITA）血管平滑肌细胞（VSMCs）的原代培养及传代培养的方法,并比较二者的生长特性。方法：取冠状动脉搭桥术后剩余的SV与ITA血管标本,分为SV组与ITA组,用植块法进行VSMCs的原代培养,用免疫荧光染色法鉴定细胞,并比较两组细胞培养时间的差异。去血清培养48h后,在DMEM／F12、100ml／LFBS及10ng／ml血小板源性生长因子（PDGF）-BB不同培养条件下,观察SV的VSMCs与ITA的VSMCs生长情况。用MTY比色法检测细胞增殖并进行比较。结果：原代及传代培养均获成功。免疫荧光染色法显示平滑肌肌动蛋白（SMα-actin）位于细胞质,总阳性率〉95％。SV组原代培养植块周围细胞爬出时间为（9．1±1．1）d,大于ITA组的（5．8±1．0）d（P〈0．05）。sV的VSMCs再次传代培养时间为（34．9±3．4）d大于ITA的VSMCs首次传代培养时间（29．1±4．4）d（P〈0．05）。SV的VSMCs再次传代培养时间为（9．0±4．2）d,与ITA的VSMCs再次传代培养时间（9．6±3．9）d相似。两组细胞在相同培养条件时,未见明显的形态学差异,细胞生长曲线的差异无统计学意义。结论：采用植块法进行SV与ITA的VSMCs原代培养简便可行,细胞纯度高,具有良好的细胞表型转变特性,是研究冠状动脉搭桥术后血管桥再狭窄分子机制良好的细胞模型。SV的VSMCs可能较ITA的VSMCs具有更强的增殖潜能,二者内在属性的差异仍有待于进一步研究。     

成年鼠骨髓单个核细胞在体外培养中分化为平滑肌祖细胞

目的:探讨大鼠骨髓单个核细胞在体外经条件培养基诱导定向分化成平滑肌祖细胞的可行性。方法:分离4～6周龄的大鼠胫骨、股骨,以4℃预冷的DMEM培养基冲出骨髓,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,在血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)作用下,培养8～12d形成贴壁的梭形细胞。采用CD34与α-SMA免疫荧光染色进行鉴定,RT-PCR法测定其α-SMAmRNA表达情况。结果:在PDGF-BB作用下,82%的骨髓单个核细胞α-SMA染色阳性,78%细胞CD34染色阳性,新鲜分离的骨髓单个核细胞不表达α-SMAmRNA,体外培养后表达α-SMAmRNA。结论:体外培养的骨髓单个核细胞能分化为平滑肌祖细胞,可作为研究平滑肌细胞分化和筛选抑制再狭窄药物的工具。     

小鼠主动脉平滑肌细胞培养及钙化模型的优化

目的 通过改良后的酶消化法进行小鼠主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）原代培养，提高VSMCs原代培养效率及质量，进而建立更快速有效的体外钙化模型。方法 剥离小鼠主动脉中膜并将其剪碎，分别采用改良组织贴块法及改良酶消化法进行小鼠VSMCs原代培养，免疫荧光染色鉴定细胞纯度后，分组（经典钙化组、改良钙化组）进行体外钙化诱导，采用vonKossa染色法评估各组钙化差异。结果 与改良组织贴块法相比，改良后的酶消化法培养原代VSMCs可在短时间内获得大量细胞，鉴定VSMCs纯度>98%，且细胞不易老化，传代存活率高。与传统体外钙化方法比，改良组的钙化更容易且稳定。结论 本研究通过改良的酶消化法提高了原代平滑肌细胞的存活率及培养效率，同时通过改良体外钙化诱导液配方，建立了良好的体外钙化模型。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的探讨平滑肌细胞培养方法,了解生长特性。方法用组织贴块法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,用相差显微镜观察其生长情况,用免疫荧光染色分析其抗原的表达。结果培养3日可见组织块周边有细胞长出,2周达亚融合,传代后细胞“谷峰”生长明显。SM-α-肌动蛋白和Calponin抗体免疫荧光染色呈阳性。结论组织贴块法是简单、经济、高效的平滑肌细胞培养方法,为心血管疾病发病机制的研究提供了理想的细胞模型。     

酶消化组织块法培养人心房成纤维细胞

目的 建立人心房成纤维细胞体外培养的有效方法。方法 无菌条件下将人右心耳标本剪成1 mm3大小组织块,经 1.25 g/L胰蛋白酶预消化15 min后,用组织块贴壁法培养。通过倒置显微镜观察培养细胞生长及形态学特点,使用免疫荧光法进行细胞鉴定。结果 培养3~4 d后可见细胞自组织块爬出,7~9 d后细胞可传代,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形。免疫荧光染色发现其抗波形蛋白（vimentin）及抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色阳性,抗血管性血友病因子（vWF）染色阴性,鉴定为肌成纤维细胞。结论 酶消化组织块法培养人心房成纤维细胞/肌成纤维细胞简便、高效,方法可行。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的 改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的培养方法.方法 采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定.结果 镜下培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内αactin阳性表达.结论 本法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs.     

血管类器官的构建及鉴定

目的 探讨人诱导多能干细胞(hiPSC)培养血管类器官的方法并进行鉴定。方法 体外培养hiPSC,先诱导hiPSC形成拟胚体,再诱导分化中胚层和血管祖细胞后,在Ⅰ型胶原蛋白-基质胶介质中分化形成血管网,分离单个血管网,形成血管类器官;倒置显微镜观察分化过程中拟胚体,血管网及血管类器官的生长情况;免疫荧光染色检测血管类器官的内皮细胞特异性抗体CD31,平滑肌细胞特异性抗体α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),血小板衍生生长因子受体β(PDGF-β)蛋白表达。结果 构建血管类器官3D细胞模型,免疫荧光染色显示,CD31阳性,α-SMA阳性,PDGF-β阳性,与人体血管组织结构特征相似。结论 初步构建了血管类器官3D细胞模型,将为心血管疾病的基础研究和靶向药物的筛选提供新的模型。     

血管内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响

目的分析共培养时大鼠血管内皮细胞(VECs)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化的影响。方法 VSMCs直接种植于培养板表面,VECs则种植于与VSMCs相对的浮胶底面。免疫荧光方法观察和鉴定VECs和VSMCs,RT-PCR和共聚焦显微镜分析表型相关基因的表达。结果原代培养的大鼠VECs呈铺路石样形态,vWF染色阳性。原代培养的大鼠VSMCs免疫荧光染色α-SMA呈阳性。RT-PCR检测结果表明,48h共培养组VSMCs的合成表型相关基因CRBP-1、Smemb的表达水平显著高于单独培养组,分别为1.4倍、1.5倍;72h达到峰值,分别为1.7倍、2.1倍,96h开始下降;共培养组中收缩表型标记物Smoothelin-B和SM-MHC的基因表达水平在48h、72h显著低于单独培养组,96hSmoothelin-B却高于单独培养组。单独培养组上述各基因的变化趋势不变或保持稳定。免疫荧光结果显示SM-MHC蛋白表达在共培养组中96h后从下降转为升高(P<0.05)。结论在共培养体系中,血管内皮细胞对血管平滑肌细胞表型转化的作用表现为先促进向合成型转化,96h后促进向收缩型转化。     

不同诱导因子下内皮祖细胞具有双向分化的潜能

目的探讨内皮祖细胞(EPCs)在不同诱导因子作用下的体外分化潜能。方法人脐血单个核细胞分别予50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF组)或50ng/ml血小板源生长因子(PDGF组)诱导分化。光镜形态观察,免疫荧光鉴定。流式细胞分析CD133+EPCs分化特征。结果新鲜脐血分离单个核细胞培养1周后贴壁细胞的EPCs特异的DiI标记乙酰化低密度脂蛋白鉴定为80%阳性。在VEGF或PDGF诱导下1周,单个核细胞大量贴壁生长多呈圆形,少量梭形生长。2周时,被诱导细胞有近50%贴壁呈梭形生长,VEGF组和PDGF组无明显差异。至4周时两组出现明显的分化差异,其中VEGF组呈"铺路石"样细胞融合,血管性假血友病因子免疫荧光呈阳性;而PDGF组呈梭形或长多角形融合,予α-平滑肌肌动蛋白标记部分呈阳性。单个核细胞磁珠分选后得到CD133+较CD133-更多分化为内皮样细胞(P<0.05);而在PDGF的诱导下CD133-较CD133+更多分化为平滑肌样细胞(P<0.05)。结论单个核细胞在体外不同的诱导因子诱导下可以双向分化,CD133+EPCs具有更强的内皮细胞分化潜能。     

胸苷激酶基因联合阿昔洛韦对细胞杀伤机制的研究

目的　了解转染单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (tk)的血管平滑肌细胞在阿昔洛韦 (ACV)的作用下细胞周期及微形态的变化 ,研究细胞死亡的原因。方法　以逆转录病毒为载体向原代培养大鼠颈动脉平滑肌细胞转移tk ,给予ACV ,流式细胞仪观察细胞周期的变化 ,电镜观察细胞微形态的改变。结果　转基因细胞在ACV的作用下 ,出现增生抑制或细胞死亡。非转基因细胞不受影响 ,存活的转基因细胞大部分停留在合成期和分裂前期。电镜发现细胞核染色质浓集 ,核破碎。结论　推测转基因细胞死亡在合成期 ,死亡原因是DNA的大量无功能复制 ,部分细胞发生凋亡     

Phenotype related changes of intimal smooth muscle cells from human aorta in primary culture.

To study the functional characteristics of smooth muscle cell (SMC) phenotypes, we have investigated myosin expression, cell proliferation, collagen production and low-density lipoprotein (LDL) receptor activity in intimal SMCs of normal human aorta during their growth in primary culture. By staining with rabbit antibodies to smooth muscle myosin (ASMM) 3 cell types could be distinguished in culture: homogeneously stained cells, cells with discontinuous myosin fibrils and myosin-negative cells. The ratio of cell types greatly changed with culture growth: on days 5, 7 and 14 it was 82:1:17%, 70:5:25% and 10:30:60%, respectively. After 5-6 days of culture intimal SMCs began to proliferate and DNA-synthesizing nuclei were seen 1.5-4.3 times more frequently in myosin-negative cells than in cells with homogeneous myosin distribution. At that time the number of cells reacted with monoclonal antibody (MAb) to an epitope shared collagen types I and III started to increase. By double immunofluorescence staining it was shown that the cultured cells containing both ASMM and MAb markers were found 2.0-4.8 times more rarely than MAb-positive staining in myosin-negative cells. During the first 5 days in culture LDL binding and uptake were diminished in intimal cells with intercellular lipid inclusions independently of their myosin staining pattern, but their activity increased with culture growth. Thus, SMCs from human aortic intima change their phenotype on days 6 and 7 in primary culture as manifested by alteration of myosin expression, increased cell proliferation, collagen production and LDL receptor activity. Changes in myosin expression, however, are not an essential prerequisite for cell proliferation and collagen production.     

人脐动脉内皮细胞和平滑肌细胞体外培养鉴定及缝隙连接通讯功能测定

目的:应用双光子激光扫描共聚焦显微镜鉴定体外培养的脐动脉内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs),应用荧光光漂白恢复技术(FRAP)测定血管ECs、SMCs之间的缝隙连接通讯(GJIC)功能。方法:人脐动脉ECs、SMCs分离培养,Ⅷ因子和SMα-actin相关抗原鉴定ECs和SMCs,应用FRAP技术测定血管内皮细胞、平滑肌细胞之间的GJIC功能,记录实时成像结果,应用动态比(M)计算漂白区域内标记荧光的分子中动态分子的比例。结果:第一组ECs和SMCs单独培养,选择漂白细胞与周围至少3个同种细胞相连接,SMCs被漂白后平均M值为31.79±5.69;ECs被漂白后平均M值为23.43±2.11;第二组ECs和SMCs混合培养,选择ECs和SMCs独立相连的2个细胞,SMCs被漂白后平均M值为14.47±3.28,ECs被漂白后平均M值为6.41±0.80。结论:FRAP实时动态恢复曲线可直接观察荧光恢复强度及速度,参照FRAP恢复曲线,M值可做为组间GJIC比较相对定量的可靠指标,通过检测证实ECs和SMCs之间存在GJIC,且荧光由ECs向SMCs方向的传递大于由SMCs向ECs方向的传递。     

人脱细胞脐动脉支架与兔骨髓内皮祖细胞构建组织工程血管的实验研究

目的:构建小口径组织工程生物血管并观察移植于兔颈动脉后的通畅情况。方法 :制备人脐动脉脱细胞支架,随机分为三组:Ⅰ.实验组:将兔皮肤成纤维细胞、下肢动脉平滑肌细胞和骨髓内皮祖细胞依次接种于纤维连接蛋白包被的血管支架上;Ⅱ.对照组:血管支架未经纤维连接蛋白包被,种植细胞种类同实验组;Ⅲ.裸支架组:未经处理的脱细胞裸支架。行HE染色观察种植细胞情况;免疫组化染色鉴定种植细胞的表型;电镜下观察人工血管内皮细胞间的连接状态。将人工血管分别移植于兔颈动脉,术后0h、2h、1d、2d、3d、7d、14d及30d后行血管超声检查,对三组移植血管通畅程度进行比较。结果:植入细胞后的人工血管动态培养2w后,Ⅰ组血管在倒置显微镜可见管腔内大量细胞附着、细胞呈密集环绕生长,HE染色结果显示:血管管腔内层均匀覆盖细胞;免疫组化染色其结果显示:管腔内层细胞高表达成熟内皮细胞表面标志CD34;扫描电镜观察血管腔内较为均匀的覆盖细胞,血管壁较为光滑呈膜性结构。Ⅱ组血管在倒置显微镜下和HE染色均未见附着的细胞;免疫组化染色显示管腔内层细胞不完整;扫描电镜观察血管腔内少量细胞覆盖,血管壁为不规则的纤维状结构。兔颈动脉移植术后立即行血管超声检测,结果显示实验组血管的内径为(3.97±0.2)mm,血流通畅,与裸支架组的(3.88±0.2)mm及对照组的血管内径(4.14±0.6)mm相比,差异无统计学意义(P0.05);2h血管超声检测结果显示,实验组(3.81±0.7)mm与对照组(1.89±0.2)mm的血管内径有显著性差别(P0.05),后者明显狭窄,出现血栓。30d后实验组血管内径(2.50±0.2)mm与移植0h比较显著狭窄(P0.05)。结论:人脐动脉脱细胞支架与兔骨髓内皮祖细胞构建的组织工程生物血管移植于兔颈动脉可长期通畅。     

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定

目的探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。结果85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。     

血管平滑肌细胞基因转移及增生抑制的实验研究

目的　了解逆转录病毒载体介导胸苷激酶基因转染平滑肌细胞的可行性 ,检测不同浓度阿昔洛韦 (aciclovir,ACV)对转基因细胞的杀伤效果 ,为在体转基因治疗动脉硬化提供实验依据。方法　原代培养大鼠颈动脉平滑肌细胞 (smoothmusclecells,SMCs) ,采用病毒上清共培养法进行基因转移 ,用MTT法观察ACV对转基因细胞的杀伤效果。结果　转基因平滑肌细胞获得潮霉素抗性 ,聚合酶链反应 (PCR)扩增出目的基因片段 (395bp) ,未发现辅助病毒结构基因片段 (4 11bp) ,给予ACV对转基因平滑肌细胞有杀伤或抑制效应。结论　以PA317细胞为包装细胞 ,以逆病毒为载体可介导含潮霉素抗性的胸苷激酶基因转染体外培养的平滑肌细胞 ,载体系统安全 ,联合ACV对转基因细胞有杀伤作用 ,杀伤时存在旁观者效应。提示采用转基因方法可以防止脑动脉硬化过程中平滑肌细胞的增殖 ,且具有潜在的应用价值。     

兔外周血与骨髓源性内皮祖细胞培养鉴定及生物学特性的研究

目的:探索并建立兔内皮祖细胞(EPCs)的体外培养、鉴定方法。方法:采用密度梯度分离法分别从兔外周血和骨髓中分离出单个核细胞,接种于预包被明胶的培养瓶,并应用培养基(EBM-2)诱导培养,诱导分化为EPCs;在倒置显微镜下观察两种源性细胞生长过程;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种源性获得的EPCs增殖情况;采用免疫荧光染色观察EPCs相关抗原CD34、CD31、CD133及vWF因子的表达。结果:两种源性EPCs均于培养3～4d完全贴壁,呈克隆样生长,7～9d形成类似成熟血管内皮细胞形态,细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为95%。两种源性获得的第2代细胞生长曲线近似"s"形、MTT法显示3～5d细胞增殖较明显,外周血源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为96.48%和3.52%,骨髓源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为97.11%和1.84%。第2代EPCs进行免疫荧光鉴定结果显示:两种源性内皮祖细胞均阳性表达CD34、CD133、vWF因子,CD31弱阳性表达。结论:两种源性的EPCs均可高效获得且在体外稳定培养。与传统的骨髓源性EPCs相比较,从外周血源获得的EPCs是一种可靠、简便的培养方法,为组织工程学提供理想的细胞来源。     

不同方法对血管平滑肌细胞表型特性影响的实验研究

目的 通过两种分离方法体外获取血管平滑肌细胞（VSMCs）,比较细胞表型差异及生物学特性,为血管性疾病研究提供精确实验基础.方法 分别采用组织块法及酶消化法获取SD大鼠胸主动脉VSMCs,分为组织块组与酶消化组.倒置显微镜、结晶紫染色观察形态学改变并定量分析;MTT比色法及TransweU细胞迁移实验分别检测分析细胞增殖与迁移活性;流式细胞周期测定细胞周期分布;细胞免疫荧光染色鉴定VSMCs并测定分析收缩型标记蛋白α-平滑肌肌动蛋白（SMA）以及合成型标记蛋白平滑肌胚胎型肌球蛋白重链（SMemb）、原肌球蛋白-4（TPM-4）表达量的变化.结果 两组细胞SMA细胞免疫荧光染色阳性率≥95％,细胞呈现谷峰状结构生长.组织块组与酶消化组两组细胞长径径值分别为（95.10±16.23）μm和（114.67±15.92）μm.与酶消化组相比,组织块组细胞增殖及迁移活性分别增加23.04％和1.54倍（P＜0.05）,S＋G2期所占比例增加49.68％（P＜0.05）,SMA蛋白表达量下降（P＜0.05）,SMemb及TPM-4蛋白表达均增加（P＜0.05）.结论 组织块法获取细胞多以合成表型为主,酶消化法则主要呈收缩表型.伴随细胞形态学、增殖及迁移活性、表型特异性蛋白表达等不同改变,两种细胞获取方法可为不同目的研究提供精确的体外模型.