利用体内噬菌体展示技术筛选及鉴定肺癌特异性结合肽

目的利用体内噬菌体展示技术筛选并鉴定与肺癌特异性结合的多肽。方法用肺癌细胞A549接种裸鼠复制荷瘤动物模型,将随机肽库尾静脉注入裸鼠体内,循环15 min后取肿瘤组织中结合的噬菌体,如此进行3轮体内筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA初步鉴定噬菌体克隆对肺癌细胞的亲和力、特异性。将阳性噬菌体克隆扩增、测序获得外源多肽氨基酸序列,化学方法合成多肽,鉴定多肽对肺癌细胞和组织的亲和力、特异性。结果ELISA结果显示,随机挑选的20个噬菌体单克隆中,1个对A549具有很强亲和力。测序获得多肽,命名为zp2。化学合成多肽zp2。竞争抑制、细胞免疫荧光和组织免疫荧光实验结果表明多肽zp2与肺癌细胞A549及肺癌组织特异性结合。结论利用体内噬菌体展示技术筛选出与肺癌细胞A549特异性结合的多肽,为肺癌诊断及治疗药物的研制奠定基础。     

利用噬菌体随机肽库筛选IL-5结合的相关多肽

目的：采用噬菌体随机肽库筛选人IL-5，以获得能高亲和力结合IL-5的相关多肽。方法：以重组人IL-5作为筛选分子，应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选。经过三轮淘筛后，经夹心ELISA、竞争ELISA法进一步鉴定噬菌体克隆与IL-5的亲和力，对阳性克隆进行了扩增和DNA测序，据此推导结合随机多肽的氨基酸序列。结果：经鉴定得到9个阳性噬菌体克隆能与IL-5呈高亲和力结合。通过测序和序列比较分析，发现CX1-2AS为相对保守的结合表位。结论：研究表明通过噬菌体肽库能够筛选到IL-5结合的相关多肽，为进一步研究IL-5结合表位及抑制剂奠定了基础。     

通过噬菌体载体筛选胶质瘤细胞结合的内化短肽

目的:寻找与神经胶质细胞瘤细胞系SWO－38特异性结合并内化的短肽序列。方法:利用噬菌体随机12肽库对肿瘤细胞进行5轮全细胞筛选,并分析筛选后单克隆对肿瘤细胞的特异性结合能力。提取单克隆DNA,测序,推导出短肽序列。结果:5轮筛选后的噬菌体库及所挑选13个单克隆中有10个对胶质瘤细胞有特异性的结合,并测序得到两条重复性高的多肽序列。结论:通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞筛选得到的噬菌体多肽能高特异性与肿瘤细胞结合,可作为肿瘤导向药物研究的载体。     

利用体内噬菌体展示技术筛选膀胱癌特异性结合肽

目的:利用体内噬菌体展示技术筛选与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽。方法:将人膀胱移行细胞癌细胞BIU87接种于裸鼠体内,制备膀胱癌荷瘤小鼠模型,尾静脉注射噬菌体展示环七肽库,然后筛选与膀胱移行细胞癌特异性结合的含外源多肽的噬菌体,经过3轮体内筛选后,免疫组织化学法及ELISA法鉴定单克隆噬菌体对BIU87的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体单链DNA进行测序,并推导出外源多肽氨基酸序列,化学合成多肽、制备分子探针后采用激光扫描共聚焦显微镜术及流式细胞术鉴定多肽对膀胱癌细胞和组织的特异性。结果:3轮体内筛选后,噬菌体富集率达到4.334×102倍。免疫组化结果显示,肿瘤组织中噬菌体肽的含量随着每一轮筛选呈增长趋势,且结合逐渐增强,同时由于噬菌体经肝、肾代谢,可见肝脏结合大量非特异性的噬菌体。ELISA结果显示,随机挑选的30个单克隆噬菌体斑中,有24个阳性噬菌体,其中10个噬菌体对BIU87有较强的亲和力,对其测序并推导出3种多肽序列,重复率最高的序列CSSPIGRHC(8/10)命名为NYZL1。化学合成FITC-C6-NYZL1,通过激光扫描共聚焦显微镜术、流式细胞术均证明多肽NYZL1可以特异性结合膀胱癌细胞。结论:利用体内噬菌体展示技术筛选出了与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽NYZL1,为膀胱癌早期诊断和靶向治疗提供一定的理论依据。     

利用噬菌体肽库筛选HeLa细胞表面与人CD59结合的活性短肽

目的寻找HeLa细胞表面与人CD59特异性结合的短肽序列。方法分别用非转基因HeLa细胞和转染CD59基因的HeLa细胞的裂解蛋白进行5轮亲和筛选,并通过竞争结合实验,然后用ELISA方法筛选噬菌体阳性克隆。提取单克隆DNA测序,并对其进行DNA序列分析推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对HeLa细胞有特异性结合力,经测序得到一条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞蛋白筛选,得到了噬菌体多肽能高特异性与肿瘤细胞结合的短肽序列,为下一步设计肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供了参考依据。     

哇巴因结合肽氨基酸序列的测定

目的:确定能与哇巴因特异性结合的多肽氨基酸及基因序列,为实现阻断或拮抗哇巴因与钠泵的作用奠定实验基础。方法: 采用噬菌体随机肽库表面呈现技术筛选出哇巴因特异性结合肽,通过测序,获得氨基酸序列,进行同源性分析、合成筛选出的12肽,人工合成哇巴因结合肽,并检测其与哇巴因的结合能力。 结果: 从噬菌体12肽库中筛选出3种多肽。肽A(12肽)的筛选一致率达到66.7%(8/12);肽B(8肽) 筛选一致率为16.7%(2/12);肽C(12肽)为8.3%(1/12);仅1例未见插入的多肽片段。 GenBank中蛋白质同源性分析结果:肽A、B、C均未见同源蛋白。获得特异性哇巴因结合肽的氨基酸序列为:Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Thr-His- His-Arg-Pro-Trp-Thr。结论: 哇巴因特异性结合肽氨基酸及DNA序列的获得,为哇巴因的研究提供了实验基础;同时,本研究所采用的方法也为使用噬菌体随机肽库进行甾体类激素特异性受体(配体)的筛选提供了可靠的实验依据。     

P-糖蛋白结合肽的筛选及合成肽鉴定

目的 筛选人膀胱癌P-糖蛋白特异性结合肽并合成鉴定.方法 利用表达获得的P-糖蛋白胞外段融合蛋白为靶蛋白,采用酶联板法筛选噬菌体随机12肽库,化学合成该特异性肽序列,免疫细胞化学方法进行鉴定.结果 从噬菌体随机肽库中筛选获得了与P-糖蛋白特异性结合的噬菌体阳性克隆,测序获得特异性结合肽序列.免疫细胞化学结果显示特异性合成肽可与耐药细胞BIU-87/ADM结合,而与敏感细胞BIU-87不结合.结论 筛选获得的结合肽具有一定的亲和力,可与特定的肿瘤细胞结合,表现出一定的肿瘤特异性;P-糖蛋白结合肽的筛选,为人膀胱癌多药耐药的靶向治疗结论提供实验依据.     

利用噬菌体随机肽库筛选抗呼吸道合胞病毒多肽的实验研究

目的：采用完整的呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV)颗粒筛选噬菌体肽库，以获得能高亲和力结合并能抑制该病毒复制的特异性多肽，方法：Hep-2细胞培养RSV，采用蔗糖密度梯度（30％、45％、60％）和超滤离心纯化病毒，病毒用生物素标记后，应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选，经过3轮淘筛后，ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与RSV的亲和力，通过TCID50检测其抗病毒复制能力，选取与RSV具有高亲和力的阳性克隆进行DNA测序，据此推导多肽的氨基酸序列，结果：经鉴定得到13个阳性噬菌体克隆能与RSV呈高亲和力结合，其中3个克隆体外能明显抑制RSV的复制，使TCID50由10^－8．1SFU／ml分别降至10^-4.1、10^-4.3、10^3.8SFU/ml。DNA测序发现各个克隆之间缺乏明显的同源序列，但普遍含有较多的脯氨酸，结论：通过噬菌体肽库能筛筛选到抗病毒作用的阳性克隆，为进一步开发高效RSV的诊断和治疗试剂奠定基础。     

C1q结合十二肽的筛选与初步鉴定

目的　从噬菌体十二肽库中筛选结合C1q的短肽并进行初步鉴定。方法　以C1q为钓饵蛋白筛选噬菌体十二肽库 ,利用ELISA、U937细胞配体结合抑制试验、多聚IgG(AIgG)竞争抑制试验鉴定阳性克隆 ,再进行单链DNA测序和分析。结果　经 3轮筛选后 ,随机挑选 2 5个噬菌体克隆做ELISA鉴定 ,14个克隆显示与C1q有较强的结合。经过U937细胞配体结合抑制试验和AIgG竞争抑制试验鉴定后 ,将此 14个阳性克隆测序 ,从其展示肽DNA测序结果推导氨基酸序列 ,获得 9条氨基酸序列 :HWDPFSLSAYFP、WTPVRTNPFLLH、NGHLFSLSAYFP、RTQRNSPFFLCP、SPAFHPEHMGRG、SRAFHPFYRGRA、WYEGPFTLQTWP、LTQHNSPFFLLP和TSNPFFLWYPQP。结论　获得结合C1q的一些抑制性短肽 ,它们可能成为抑制补体经典途径激活的肽类先导化合物     

以特异性噬菌体展示肽为靶筛选TNF-α结合肽的研究

目的：建立以特异性噬菌体展示肽为靶从噬菌体肽库中筛选结合表位的新方法。方法：以前期工作中筛选得到的模拟TNF－α表位的环七肽克隆LCS－7（c-RRPAQSG-c)为靶，筛选噬菌体线性十二肽库；用间接ELISA及竞争试验鉴定阳性克隆。结果：对噬菌体十二肽库进行3轮筛选后，挑取20个克隆中有10个为阳性克隆，测序结果氨基酸序列相同：EHMALTYPFRPP。结论：以TNF－α模拟肽克隆为靶筛选得到的噬菌体十二肽克隆，能够与TNF－α结合，为TNF－α结合肽；所测得序列完全一致。上述结果提示了该筛选方法的可行性。     

利用噬菌体肽库筛选抗黏附的活性多肽

目的 :筛选抗内皮细胞与单核细胞黏附的活性多肽。方法 :①以氧化型低密度脂蛋白 (ox LDL ,10 0mg/L)损伤的内皮细胞作为筛选的“靶”细胞 ,从XCX15肽文库 (X代表随机氨基酸 ,C为半胱氨酸 ,X15代表编码随机 15肽 )中 ,筛选能与受损内皮细胞特异性结合的多肽。②用ELISA法鉴定部分阳性克隆 ,经DNA序列测定确定其插入的氨基酸序列。③以计数法检测特异性噬菌体多肽对内皮细胞与单核细胞黏附率的影响。结果 :①从挑选鉴定的 14个克隆中 ,得到 6个阳性克隆 ,测序结果有两个克隆的外源多肽序列相同 ,4个克隆的外源多肽中含有亮氨酸 亮氨酸重复序列。②两个序列相同的克隆的噬菌体多肽 ,能明显降低内皮细胞与单核细胞的黏附率(分别降低 17.0 %和 17.6 % ,P <0 .0 1,n =4 )。结论 :从XCX15肽文库中 ,初步鉴定出 1个具有较明显地抗内皮细胞与单核细胞黏附作用的活性多肽     

肝癌细胞特异性内在化肽的筛选和初步鉴定

应用噬菌体肽库技术筛选与肝癌细胞特异性结合并可以内在化的短肽,为肝癌的导向治疗奠定基础。以肝癌细胞株BEL-7404作为筛选靶细胞,对噬菌体展示随机12-肽库进行亲和淘选。经过3轮淘选后,共随机挑选出20个噬菌斑进行扩增和测序,同时用细胞ELISA检测其与肝癌细胞的结合情况,并通过免疫荧光术、流式细胞术等方法进一步鉴定噬菌体克隆对肝癌细胞的导向性及内在化的效果。结果表明3轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果。从扩增的噬菌体克隆中选择结合力最强的LJ08通过免疫荧光术、流式细胞术鉴定,结果显示LJ08与肝癌细胞呈特异性结合并内在化进入肝癌细胞。结论认为,通过对噬菌体随机肽库的筛选,得到可以与肝癌细胞BEL-7404结合并可以内在化的噬菌体肽,为该肽作为肝癌导向治疗的药物载体奠定基础。     

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。     

从噬菌体随机十五肽库中筛选类脂A模拟肽的研究

目的用具交叉保护性的针对类脂 A的单抗 (1B6 )筛选噬菌体十五肽库 ,旨在研究类脂 A的模拟肽。方法对噬菌体十五肽库进行亲合筛选 ,用噬菌体 EL ISA法鉴定阳性克隆。结果经 3轮筛选后 ,随机挑选 14个噬菌体克隆 ,做夹心EL ISA试验 ,其中 5个克隆显示较强的阳性结果。将上述 5个阳性克隆 DNA测序 ,序列均为 ACTCATTGGCATCAGTGGAGGCATCATCAGTTTCCTGCTCCTACT,相应的氨基酸序列为 THSHQWRHHQFPAPT。竞争性噬菌体 EL ISA的结果显示大肠杆菌 L PS和伤寒杆菌 L PS均可特异性抑制阳性噬菌体克隆与类脂 A抗体的结合。结论该噬菌体克隆展示肽具有 L PS表位的抗原性 ,且模拟了 L PS的共同部分类脂 A。     

从噬菌体构象型7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽

目的 :从噬菌体构象型 7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽。方法 :用重组人BLyS筛选噬菌体构象型 7肽库 ,用间接ELISA、竞争ELISA和细胞增殖活性试验鉴定噬菌体克隆。结果 :经过 3轮亲和筛选 ,噬菌体的回收率增加 ,阳性克隆得到富集。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制BLyS刺激细胞增殖的活性。结论 :获得了噬菌体呈现的能够抑制BLyS的两个短肽。     

从噬菌体环肽库中筛选TNF-α表位模拟肽的研究

目的：用具有中和活性的抗TNF—α单抗(mAb)J1D9筛选噬菌体环七肽库，从中获得可模拟TNF—α表位的短肽。方法：筛选TNF—α表位模拟肽，并用夹心ELISA法鉴定阳性克隆。结果：对环七肽库进行3轮筛选后，随机挑选20个噬菌体克隆，经ELISA鉴定出9个阳性克隆。DNA序列分析后，推导的氨基酸序列共3种：c—RRPAQSG—c、c—NKHNRKI—c和c—RGMSRKI—c。结论：筛选的环七肽克隆展示肽具有TNF—α的抗原性，为TNF—α表位模拟肽。     

Generation of microglia specific reagents from phage displayed peptide libraries

The present report concerns the generation of specific markers and the establishment of a selection procedure for microglia specific molecules from phage displayed peptide libraries. Negative selection against a mouse monocytic cell line (IC-21) and positive selection against primary mouse microglia was combined in the selection procedures using a mixture of two random peptide libraries displayed on phage. In a first set of experiments, one clone was selected that bound microglia and IC-21 cells to equal extent, and three clones that bound to unsorted primary microglia to substantially higher levels than to IC-21 cells. In the second series of experiments, microglia and IC-21 cells were mixed and CD45-positive microglia cells were collected using a FACS sorter. From the latter selection series, three clones were found that preferentially bound to microglia cells. The binding of one of the six selected microglia specific phage clones, clone V-1:19, was competed/inhibited in experiments using soluble synthetic peptides corresponding to the binding motif of the phage clone. The specific inhibition to microglia cells by this synthetic peptide was effective in the concentration range of 0.5-20 microM. The preferential binding of clone V-1:19 to microglia like cells was further demonstrated by staining a panel of cell lines and purified primary mouse microglia.