血管内皮生长因子反义寡核苷酸对肝癌血管形成的抑制作用

本研究旨在通过人工合成的血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ)反义寡核苷酸片段 ,在细胞水平检测其对肝癌细胞ＶＥＧＦ表达的抑制作用 ,探求一种新的抑制肝癌血管形成的基因治疗方法。一、材料和方法1.寡核苷酸 (ＯＤＮ)为上海生物工程公司利用美国ＰＥ公司 391型ＤＮＡ自动合成仪合成 ,ＰＡＧＥ电泳纯化 ,碱基序列为 :反义ＯＤＮ 5′ ＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＴＡＧＣＧＣ 3′,正义ＯＤＮ5′ ＣＴＡＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＣ 3′ ;人肝癌细胞系 772 1由第四军医大学病理86 3课题组提供。2 .以 1ｇ/ＬⅣ型胶原酶 (Ｓｉｇｍａ公司…     

反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒转染胆管癌细胞的抑制作用

目的　探讨反义寡核苷酸 (ODNs)对丙型肝炎病毒 (HCV)转染胆管癌细胞中HCV的抑制作用。方法　通过半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测HCVmRNA表达的变化 ,观察不同浓度 (0～ 6 .0 μmol/L)的HCV核心区ODNs对体外丙肝病毒感染胆管癌细胞 (QBC939)的抑制作用 ;同时以裸鼠为研究对象进一步观察ODNs对HCV的体内抑制作用。结果　ODNs可有效地进入靶细胞在体外与HCV核心基因杂交结合 ,使HCVmRNA的表达明显降低 ,终浓度为 6μmol/L的ODNs作用下无HCVmRNA表达。动物实验观察ODNs组在裸鼠中的瘤体平均直径小于对照组、PBK HCVC转染组 (P <0 .0 1 ) ,成瘤率 2 5 % (5/ 2 0 )低于PBK HCVC转染组 65 % (1 3/2 0 ) (P <0 .0 5) ,成瘤时间 1 5 .3d较对照组 1 2 .0d、PBK HCVC转染组 1 0 .1d延迟 (P <0 .0 1 )。结论　反义寡核苷酸不失为治疗丙肝病毒感染胆管癌新的途径     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制肝癌的血管形成

目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ODN）是否可以抑制人肝癌细胞系VEGF的蛋白表达,进而抑制肝癌的血管形成,探讨肝癌基因治疗的新方法。方法 人肝癌细胞系7721能表达VEGF,其培养上清液对牛主动脉内皮细胞（BAEC）的生长有促进作用。采用人工合成反义、正义ODN分别加入7721细胞培养液,比较7721细胞VEGF的表达以及各上清液刺激内皮细胞生长的受抑情况,即可了解ODN通过抑制VEGF的表达抑制肝癌的血管形成情况。结果 VEGF反义ODN明显抑制了人肝癌细胞VEGF的表达（灰度值：反义组122．6,正义组101．3,对照组106．3,P＜0．01）,且抑制率与剂量呈性关系（当剂量为1、2、5、10μmol/L时抑制率分别为：63．2％、82．4％、210．0％、287．5％）。结论 VEGF反义ODN能够抑制肝癌的血管形成,其有望成为抗肝癌的新一代基因治疗手段。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制胆囊癌血管生成的研究

目的探讨Oligofectamine介导的血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growthfactor,VEGF)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)转染对人胆囊癌细胞GBC-SD裸鼠移植瘤的VEGF表达和血管形成的影响。方法裸鼠接种GBC-SD细胞建立移植瘤模型,随机分为A、B、C三组,各组裸鼠在接种1周后,分别给于200μl磷酸缓冲液(PBS)、VEGFSODN100μg Oligofectamine0.5μl及VEGF ASODN100μg Oligofectamine0.5μl,每3天1次,连续治疗5周,观察各组裸鼠的成瘤性、体积及瘤重的变化,各组移植瘤中VEGF表达及微血管密度(MVD)变化。结果三组裸鼠3周时的成瘤率,C组显著低于A、B两组(P<0.05),6周时各组的成瘤率无差异。各组移植瘤6周时的体积和瘤重相比C组显著低于A、B两组(P<0.05),C组的抑瘤率为(50.79±9.19)%。A、B两组移植瘤VEGF表达及MVD均无显著性差异(P>0.05),而C组移植瘤VEGF的表达较A、B两组明显减弱(P<0.05),MVD明显小于A、B两组(P<0.05)。结论VEGF ASODN在体内能显著抑制人胆囊癌裸鼠移植瘤的增殖,降低其在裸鼠体内的成瘤性,抑制VEGF在蛋白水平的表达,减少裸鼠移植瘤中血管的形成,降低微血管密度。     

人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响

目的　探讨人反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因对肾癌细胞VEGF表达及生长的影响。　方法　采用RT PCR方法将VEGF基因克隆于 pcDNA3.1反义真核表达载体 ,构建VEGF的pcDNA3.1反义真核表达载体 ,酶切鉴定。转染人肾癌 780 0细胞 ,G4 18筛选阳性克隆。免疫组化法检测VEGF表达 ,MTT法测生长曲线。　结果　pcDNA3.1 (antisense)VEGF组VEGF蛋白表达阳性细胞率 (10 .3% )明显低于 780 0 PC组 (92 .8% )和 780 0组 (96 .6 % ) ,P <0 .0 1;VEGF反义真核表达载体抑制肾癌 780 0细胞生长 ,在培养的第 4、5、6天 ,抑制率分别为 2 6 .38%、4 1.78%和 37.6 4 %。　结论　VEGF的 pcDNA3.1反义真核表达载体可明显降低肾癌细胞VEGF的表达 ,明显减慢肾癌细胞生长。     

血管内皮生长因子及其反义寡核苷酸对胶质瘤血管形成的影响

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)及其反义寡核苷酸 (AODN )对胶质瘤血管形成的影响 ,探讨胶质瘤治疗的新策略。方法　采用链霉菌抗生物素蛋白 过氧化酶免疫组化法 (SP法 ) ,分析 48例脑胶质瘤中VEGF蛋白表达和微血管密度 (MYD)的关系 ;并将传代培养的C6细胞接种于大鼠皮下 ,局部注射VEGF反义寡核苷酸和等量的生理盐水 ,检测肿瘤组织微血管密度的变化。结果　在低、高度恶性星形细胞肿瘤中 ,VEGF阳性率分别为 2 6 .0 9% ( 6 /2 3)、6 4.0 0 % ( 16 /2 5 ) ;MVD分别为 6 .6 9± 4.81、2 3 .6 2± 6 .78;其差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;且VEGF蛋白表达与MVD间明显相关。反义寡核苷酸局部注射后大鼠皮下C6胶质瘤的微血管密度降低 ( 10 .13±0 .85 ) ,与对照组差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论　VEGF可促进胶质瘤血管形成和恶性进展 ,其反义寡核苷酸可作为胶质瘤治疗的一种辅助手段。     

反义寡核苷酸抑制Survivin基因表达对移植静脉内膜增生的影响

目的研究反义寡脱氧核苷酸（ASODN）抑制Survivin基因表达对移植静脉内膜增生的抑制作用。方法Wistar大鼠60只，建立自体静脉移植模型，术后随机分为：对照组、Survivin ASODN 50、200μg组、正义对照组、Lipofectin＋pluronic等五个组，施加不同的处理因素，在移植后1、2周取材。组织形态学方法比较内膜增生程度，逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）检测Survivin基因的mRNA表达，Westem blot检测Survivin基因的蛋白产物表达，免疫组织化学方法检测Survivin及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，脱氧核苷酸转移酶末端标记法（TUNEL）检测血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡的变化。结果移植后1、2周内膜增生明显，局部转染50μg Survivin ASODN组内膜增生明显受抑制（P〈0．05），200μg组受抑制程度更为明显（P〈0．05）；与对照组相比，Survivln ASODN组Survivin的mRNA及蛋白产物表达显著减少（P〈0．05），PCNA阳性表达同时减少，而TUNEL阳性细胞却明显增加。结论Survivin ASODN可显著抑制移植静脉的内膜增生，其作用可能是通过抑制Survivin基因及其蛋白产物表达，从而抑制VSMC增殖、促进其凋亡而实现的。     

反义SKP2对胆管癌细胞系QBC中p27kip1表达的影响

目的 通过S期激酶相关蛋白（SKP2）反义寡核苷酸（ASODN）阻断泛素，蛋白酶体降解途径，观察对胆管癌细胞QBC中SKP2和p27^kip1表达的影响，探讨泛素-蛋白酶体途径在胆管癌发生发展中的作用。方法 SKP2反义寡核苷酸和胆管癌细胞QBC共培养，脂质体转染，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR），Western blot法检测SKP2和p27^kip1 mRNA和蛋白在QBC中的表达。结果 SKP2 ASODN作用于QBC后，SKP2在mRNA和蛋白的表达较对照组和NSODN组均显著降低（P〈0．05），p27^kip1 mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05），蛋白表达则较对照组和NSODN组明显增高（P〈0．05）。结论 SKV2介导的泛素-蛋白酶体途径在调节胆管癌细胞QBC中p27^kip1的降解中发挥重要作用，SKP2反义寡核苷酸在显著抑制QBC中SKP2 mRNA和蛋白的表达的同时，促进p27^kip1蛋白表达，但对p27^kip1 mRNA无明显影响，提示SKP2对p27^kip1的调节主要在转录后水平。SKV2作为胆管癌基因治疗中有效的潜在靶基因，在胆管癌的基因治疗方面具有重要意义。     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞的抑制作用

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)对骨肉瘤细胞的抑制作用。方法设计合成VEGF ASODN,按不同浓度转染骨肉瘤OS-732细胞,设正义(SODN)和空白对照组进行比较。观察细胞生长状态,Western blot检测VEGF蛋白表达,MTT法测定细胞生长抑制率(IR),流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与SODN、对照组比较,ASODN组细胞中VEGF表达显著降低(P<0.05),IR(分别为10μmol/L组34.21%,20μmol/L组39.50%)显著增高(P< 0.05),上述效应呈浓度依赖性;镜下观察ASODN转染细胞代谢衰退,当转染浓度至20μmol/L时,其凋亡率AI值(18.25±0.40)%显著高于对照组(5.20±0.28)%和SODN组[(6.41±0.10)%, P<0.01]。结论ASODN能够特异性封闭骨肉瘤细胞VEGF基因表达;并可抑制细胞增殖,诱导其凋亡。     

碱性成纤维细胞生长因子反义寡核苷酸抑制胶质瘤细胞增殖 …

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子反义寡核苷酸抑制胶质瘤细胞生长的作用。方法 以脂质体异导将硫代磷酸修饰的ｂＦＧＦ反义寡核苷酸转染人脑胶质瘤细胞系ＴＪ９０５，采用原位杂交和ＭＴＴ对ｂＦＧＦ ｍＲＮＡ表达水平及细胞存活率进行检测。     

联合反义存活素、血管内皮生长因子治疗裸鼠骨肉瘤

目的探讨存活素（Survivin，SVV）、血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ASODN）联合治疗裸鼠骨肉瘤。方法构建荷骨肉瘤裸鼠模型，采用瘤内注射给药方式（5mg,／kg体重），以反义SVV、反义VEGF对瘤鼠进行联合干预治疗1周，并与各单药组和空白对照组进行比较，观测各组裸鼠肿瘤生长情况、评估瘤体病理形态，免疫组织化学法检测移植瘤组织SVV、VEGF蛋白表达，DNA末端原位标记法（TUNEL法）检测肿瘤细胞凋亡水平。结果与对照组比较，各治疗组肿瘤生长均不同程度受抑，以联合组最为显著，瘤重仅为（0．52±0．01）g，抑瘤率IR为（42．80±0．88）％；各治疗组肿瘤细胞中SVV、VEGF蛋白表达有所减低，肿瘤细胞出现凋亡坏死改变，其中联合组细胞凋亡指数AI[（27．90±3．66）％]显著高于对照组[（7．10±2．05）％，Χ^2=46．27，P〈0．01]。结论联合应用SVV与VEGFASODN将对裸鼠荷骨肉瘤发挥更强的抗瘤效应。     

载VEGF反义寡核苷酸PLGA纳米粒的研制

目的制备血管内皮生长因子反义寡核苷酸(VEGF-ASODN)的PLGA纳米粒,并探讨其制备工艺。方法采用复乳化溶剂挥发法制备,并用正交设计法对纳米粒的处方和制备工艺进行优化。结果纳米粒形态圆整,大小均匀,平均粒径150nm,包封率可达72%,含药量0.84%,体外释放缓慢,达到21天。结论VEGF-ASODN的PLGA纳米粒制备工艺简便、重现性好。     

转染血小板源生长因子和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制移植血管狭窄的实验研究

目的　探讨联合应用血小板源生长因子(PDGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸(AODN)防止移植血管狭窄的作用。方法　将同一只兔的左、右髂外动脉(各1 0cm)对换移植,移植血管用PDGF- AODN和PCNA -AODN转染;移植血管病理切片后测量其内膜厚度、内膜面积和移植血管狭窄率,并分别用原位杂交组织化学和免疫组织化学染色计数PDGF和PCNA阳性细胞数。结果　PDGF- AODN加PCNA- AODN组的移植血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和PDGF阳性细胞及PCNA阳性细胞数均显著低于对照组(P<0 .01),而且亦明显低于单独转染PDGF- AODN组或PCNA -AODN组(P<0. 05 ),PDGF AODN组和PCNA AODN组间差异无显著意义(P>0. 05 )。结论　联合应用PDGF AODN和PCNA- AODN能有效抑制血管平滑肌细胞增殖,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。     

血管内皮生长因子及其磷酸化受体在肝外胆管细胞癌中表达的研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)及其磷酸化受体表达在肝外胆管细胞癌(EHCC)中的临床意义。 方法免疫组化法检测VEGF及其磷酸化受体pVEGFR1/2在35例EHCC患者组织中的表达情况,Western blotting检测EHCC细胞系中VEGF及其相关受体的表达情况,探讨VEGF及其受体蛋白的表达与肿瘤进展、预后的相关性。 结果VEGF、pVEGFR1和pVEGFR2阳性的病例数分别为20(57.1%)、14(40.0%)和14(40.0%)例。pVEGFR1的高表达与细胞增殖相关蛋白pErk1/2水平、神经侵犯、TNM分期、肿瘤分化程度、静脉侵犯程度均相关(P均小于0.05)。pVEGFR1的高表达增加EHCC患者的死亡风险(HR=4.45,95% CI 38.66~61.62,P=0.035)。 结论pVEGFR1/2的表达程度与EHCC的进展呈正相关,高表达增加患者死亡风险,提示pVEGFR1/2有可能作为EHCC患者临床预后的预测因子。     

反义脱氧寡核苷酸对培养C6胶质瘤细胞合成血管内皮生长因子和细胞增殖的影响

目的：研究反义脱氧寡核苷酸（AODN）对培养C6细胞合成血管内皮生长因子（VEGF）和自身增殖的影响。方法：将不同浓度（1．0、2．5、5．0、10．0μmol/L）经硫代修饰的正义、反义、错义寡革酸分别加入培养的C6细胞中，采用免疫组织化学SP法检测C6细胞中VEGF蛋白的表达，并用噻唑蓝（MTT）法检测肿瘤细胞的增殖状况。结果：反义寡核苷酸可抑制C6细胞VEGF蛋白的表达，其抑制作用随AODN浓度的升高而增强，错义和正义寡核苷酸却无此作用。其中，对照组和浓度为1．0、2．5、5．0、10．0μmol/L AODN的VEGF阳性细胞率分别为82．10％、73．10％、70．00％、57．85％和53．20％。但3种寡核苷酸对C6细胞增殖均不发生影响。结论：VEGF－AODN药物能抑制VEGF蛋白的产生和分泌，可作为胶质瘤基因治疗的新途径。     

Growth inhibition of pancreatic tumor cells by modified antisense oligodeoxynucleotides

Introduction: Pancreatic adenocarcinomas are largely resistant to apoptosis. More than 50% of pancreatic tumors reveal mutations in the p53 tumor suppressor gene. Methods: We investigated the growth of pancreatic tumor cells after downregulation of p53 protein expression by antisense oligodeoxynucleotides. Results: Proliferation and p53 expression of PancTu-I cells overexpressing mutant p53 protein were inhibited by antisense oligodeoxynucleotide treatment. When analyzed, two of three other pancreatic tumor cell lines with mutated p53 were also inhibited in their growth. Two of two wild-type (wt) p53 pancreatic tumor cells were not significantly influenced by p53 expression and were, only to a lesser extent, affected in their proliferation. K562 cells (lacking p53 mRNA) and normal human skin fibroblasts used as a target mismatch control showed no changes in proliferation rates with treatment. The different biological effects in the various cells were not caused by differences in the uptake of the oligodeoxynucleotides as monitored by confocal laser-scanning microscopy. Conclusions: Truncation and 5′- and 3′-lipophilic modifications of the oligodeoxynucleotides drastically enhanced the growth inhibition of PancTu-I cells, which were resistant to apoptosis-inducing agents. Furthermore, a higher sequence-specificity of the observed effects was achieved with these compounds. Received: 16 January 1998     

反义c-myc寡核苷酸对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的 研究反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸（ＯＤＮ）对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法 移植静脉外周涂以加有反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸的Ｆ１２７凝胶,于术后１、２周测量静脉内膜平均厚度及观察血管内膜内ｃ－ｍｙｃ蛋白表达情况。结果 手术后１、２周,移植静脉内膜的平均厚度、内膜中ｃ－ｍｙｃ蛋白表达在反义ｃ－ｍｙｃ寡聚脱氧核苷酸组均减少,并存在量效关系（Ｐ〈０．０１）。而只用Ｆ１２７胶组及正义寡聚脱氧