呼吸道生物被膜菌体外生长群感效应的研究

目的:观察体外细菌群感效应对呼吸道生物被膜菌的生物膜形成和铜绿假单胞菌色素产生的影响。方法:从呼吸道感染患者痰标本中分离铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌与肺炎链球菌,用改良平板法建立铜绿假单胞菌生物膜及上述混合菌的生物膜,观察两者形成生物膜的差别。用液体培养法观测混合菌对铜绿假单胞菌色素产生的影响。结果:铜绿假单胞菌单独培养需7 d可形成生物膜,与其他细菌混合培养48 h即可形成生物膜;肺炎链球菌与铜绿假单胞菌混合培养24 h可促进其绿色素的形成。结论:不同菌种之间的群感效应能改变细菌某些生物学性状。     

医院分离铜绿假单胞菌多药耐药与细菌生物被膜之间的关系

目的：研究临床分离铜绿假单胞菌耐药现状,分析细菌多药耐药的产生与生物被膜形成之间的关系。方法采用纸片扩散法进行药敏试验,结晶紫染色法定量分析细菌生物被膜形成情况。结果共分离出铜绿假单胞菌菌株202株,对临床常用抗生素阿米卡星、美罗培南、他唑巴坦敏感性较好,其敏感率分别为83.7％、82.7％、80.7％,耐药性较高的是替卡西林、氨曲南、哌拉西林,其耐药率分别为34.7％、28.7％、27.7％,其中多药耐药菌株78株（38.6％）;生物被膜形成中等阳性和强阳性者的OR值分别为13.75、16.00,多药耐药铜绿假单胞菌产生的危险性高于生物被膜形成阴性菌株。结论铜绿假单胞菌临床分离菌株多药耐药发生率较高,细菌生物被膜形成可能是细菌多药耐药产生的危险因素。     

红霉素、左氧氟沙星对铜绿假单胞菌生物被膜作用的体外研究

目的：建立铜绿假单胞菌生物被膜（BF）的体外模型,研究红霉素（EM）对细菌BF的影响及对左氧氟沙星（LFX）的增效作用。方法：采用生理盐水-吸痰管系统进行BF的培养,建立铜绿假单胞菌BF体外模型,银染法快速鉴定,扫描电子显微镜观察BF的变化。将头孢他啶（CAZ）、LFX单独或分别与EM联合作用于早期BF和成熟BF,连续稀释法进行各组几个作用时间的存活菌菌落计数,用试管二倍稀释法测定药物的最低抑菌浓度（MIC）。结果：小剂量的EM即可以抑制铜绿假单胞菌对吸痰管载体的黏附和抑制BF的形成（P〈0．01）。无论是对早期BF或成熟BF,LFX对BF内细菌的杀菌活性均强于CAZ（P〈0．01）,LFX与EM联合应用后效果优于LFX单独应用（P〈0．01）。结论：相对于CAZ,LFX对BF有较强的通透性,对BF内细菌有较强的清除作用。EM可以减少细菌的黏附,抑制铜绿假单胞菌BF的形成,增加抗菌药物对BF的渗透性,从而增强抗菌药物对铜绿假单胞菌的杀菌作用。LFX和EM联合应用效果更佳,是治疗细菌生物被膜相关感染的良好选择。     

14、15环-大环内酯类药物在清除铜绿假单胞菌生物膜中的作用

目的研究14、15环-大环内酯类药物及抗铜绿假单胞菌药物对铜绿假单胞菌生物膜的清除作用.方法以硅胶片制备生物膜后,与不同抗生素相互作用一定的时间后,进行硅胶片菌落计数,观察药物对细菌生物膜的清除作用.结果MH空白对照组各时间段的BF内细菌存活率没有显著差异,单加MPM、AMK和MPM、AMK与MDM联合用药处理组的BF内细菌存活率与空白对照组相近.MPM、AMK与AZ或EM组合用药处理组的BF内细菌存活率在各时间段明显下降.结论红霉素、阿奇霉素可增强抗铜绿假单胞菌药物对生物膜的渗透性,对抗铜绿假单胞菌药物杀灭生物膜内细菌有增效作用.     

鱼腥草素钠增强妥布霉素抗铜绿假单胞菌生物被膜作用及抗菌协同作用

目的：研究鱼腥草素钠增强妥布霉素抗铜绿假单胞菌生物被膜的作用。方法：微量倍比稀释法测定鱼腥草素钠、妥布霉素对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）,棋盘稀释法测定两者联合抗菌作用,结晶紫染色法测定单药及联合用药对铜绿假单胞菌生物被膜的最小抑膜浓度（SMIC）,扫描电镜下观察药物对铜绿假单胞菌生物被膜形态的影响,采用倾注平板法进行菌落数计数。结果：鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的MIC为512μg/mL,妥布霉素对铜绿假单胞菌的MIC为4μg/mL,两药联合后MIC分别为64μg/mL和1μg/mL,分级抑菌浓度指数（FIC）为0.375,提示两药协同作用明显。妥布霉素对铜绿假单胞菌生物被膜SMIC50黏附期为8μg/mL,早期生物被膜阶段为16μg/mL,成熟期生物被膜阶段为32μg/mL,两药联合后铜绿假单胞菌生物被膜SMIC50黏附期为8μg/mL,早期为0.5μg/mL,成熟期为8μg/mL,鱼腥草素钠对妥布霉素抗铜绿假单胞菌生物被膜有增强作用。结论：鱼腥草素钠与妥布霉素抗菌协同作用明显,鱼腥草素钠对妥布霉素抗铜绿假单胞菌生物被膜有增强作用。     

铜绿假单胞菌群体感应效应系统细菌毒力调节的研究进展

铜绿假单胞菌分布广,发病率、致死率高,是院内感染的第三大病原。铜绿假单胞菌有超过10％的基因组动态多变,随环境改变展示极强的种群遗传进化功能,以使其适应不同生长环境［1-2］。其中,群体感应效应（ quorum-sensing, QS）系统是其种内及种间相互交流、并完成生物学特性适应性表达的关键基因族群。 QS系统接受环境信号激活后可调节铜绿假单胞菌300多个毒力基因,包括：细菌生长、运动、鞭毛形成、分泌系统、生物被膜形成因子及参与细菌与宿主间的相互作用等关键致病环节。另外, QS系统调节生物被膜形成是铜绿假单胞菌临床顽固性耐药菌株产生的主要原因［3］。故,铜绿假单胞菌QS系统调节效应,与细菌致病和宿主逃避等行为密切相关,一直是临床细菌抗感染研究的热点［4-5］。     

氟喹诺酮类药物对铜绿假单胞菌生物膜的清除效应

目的研究氟喹诺酮类药物对乳胶镀膜尿管形成生物膜的膜内细菌的清除效应.方法以平板培养法建立体外乳胶尿管黏液型铜绿假单胞菌生物被膜模型;采用双倍稀释法测定环丙沙星(CI)、司帕沙星(SPLX)、加替沙星(GTX)、头孢他定(CAZ)及头孢噻肟(CTX)的最低杀菌浓度(MBC)和对浮游铜绿假单胞菌的杀菌曲线(Time-Kill curve).结果氟喹诺酮类药物对浮游细菌的杀菌作用,各种抗生素由强到弱的顺序是:加替沙星＞头孢他定＞司帕沙星＞环丙沙星＞头孢噻肟.5种抗生素在32MBC浓度时8h内均能完全清除细菌.对于生物被膜内细菌的杀菌活性,以司帕沙星、加替沙星最强.环丙沙星杀菌作用与加替沙星相似,头孢噻肟对生物被膜内细菌的清除作用最差.结论氟喹诺酮类药物对于生物被膜有较强的渗透性,尤以司帕沙星和新药加替沙星最强,而抗铜绿假单胞菌的β-内酰胺类抗生素头孢他定和头孢噻肟对于生物膜内细菌难于清除.     

牡荆素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

目的 探讨牡荆素与抗生素联用对铜绿假单胞菌生物膜的影响。方法 通过微量肉汤稀释法检测 铜绿假单胞菌对应各抗生素的最低抑菌浓度;利用96 孔细胞培养板结合结晶紫染色法探讨牡荆素单独使用 及与抗生素联用对铜绿假单胞菌生物膜的影响。结果 当牡荆素的浓度≥ 31.25 μg/ml 时,能抑制PAO1 生物 膜的形成,使生物膜的总量从100% 减少到（80.00±4.62）%,且随着牡荆素的浓度增高,其抑制能力越强;4 种 抗生素头孢他啶（CAZ）、环丙沙星（CIP）、庆大霉素（GEN）和左旋氧氟沙星（OFLX）的最低抑菌浓度（MIC） 分别为0.5、0.5、2.0 和8.0 μg/ml ;亚抑菌浓度的CAZ、CIP、GEN 和OFLX 与牡荆素联用时能协同抑制 PAO1 生物膜的形成,分别使生物膜的总量从100% 下降至（39.38±5.32）%、（40.31±2.95）%、（23.31±3.95） % 和（50.23±3.14）%。结论 牡荆素能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,且与抗生素联用时有协同作用。     

黏液性铜绿假单胞菌体外不同方法药敏试验的探讨

<正>铜绿假单胞菌是临床中常见的易形成生物膜的条件致病菌~([1])。细菌生物膜(bacterial biofilm,BBF)是细菌黏附于生物材料或机体腔道表面,分泌多糖蛋白复合物并将其自身包绕其中,形成大量细菌聚合体的膜状物~([2])。黏液型铜绿假单胞菌能在细菌表面形成一层生物被膜,对抗菌药物具有顽强抵抗性,而其生长速度较慢,24 h后接种的平板上难见到该细菌的菌落。使得K-B法药敏试验及最小抑菌浓度测定法(MIC     

肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的研究

目的研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用,探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法采用计算机软件设计和斑点杂交联合筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1早期生物膜形成关键基因motA mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,根据其序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell pene-trating peptide,CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA,分别采用不同浓度的CCPs、PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1,定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用。结果 PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且随着浓度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成基本没有影响,5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成都没有影响。与对照组相比,CCPs-PNA处理之后的PAO1,其运动能力明显下降,PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3∶5。结论针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附,从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成产生抑制作用,穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。     

泛耐药铜绿假单胞菌耐药机制研究进展

铜绿假单胞菌是医院感染最常见的病原菌之一,对多种抗生素有天生的耐药性。近年来随着广谱抗菌药物的大量应用其耐药情况日趋严重,甚至出现了多药耐药及泛耐药株。泛耐药铜绿假单胞菌的耐药机制极为复杂,主要包括耐药基因突变、产生灭活酶、改变药物的作用靶点、药物渗透障碍与主动外排机制高表达、形成生物被膜等。本文就近年来有关的研究进展进行综述。     

铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展

铜绿假单胞菌是医院内感染重要的致病菌.该菌易形成生物被膜,常给临床治疗带来很多困难.在生物被膜形成的细菌早期定植、蘑菇状结构形成以及细胞外基质生成的各个阶段均受多种分子及基因的调控,而密度感知信号系统整体调控生物被膜的形成.根据生物被膜的形成过程及调控机制,多种针对生物被膜的治疗对策已应用于临床,一些新药物和新方法也在研究之中.     

“除膜四部曲”策略:阿奇霉素/鼠李糖脂自组装纳米粒用于清除铜绿假单胞菌生物被膜的研究

  目的  探索阿奇霉素/鼠李糖脂自组装纳米粒（AZI-RHL NPs）在体外对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa）生物被膜的清除作用。  方法  制备并表征AZI-RHL NPs。采用微量肉汤稀释法测定AZI-RHL NPs对游离P. aeruginosa的最低抑菌浓度（MIC）。采用结晶紫染色法和SYTO 9/PI死活菌染色法评价AZI-RHL NPs对生物被膜的清除作用。采用荧光标记法探究NPs对生物被膜胞外聚合物（EPS）的清除作用。通过结晶紫染色法观察NPs对P. aeruginosa在人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）黏附中的抑制作用。通过测定NPs与黏蛋白溶液孵育后的粒径变化考察其与黏蛋白的相互作用,以推测其黏液穿透能力。  结果  AZI-RHL NPs的粒径约为（121.4±6.0） nm,表面带负电,具有高包封率高载药量,对AZI的包封率为96.72%,载药量为45.08%,对RHL的包封率为99.38%,载药量为53.07%。AZI-RHL NPs对游离P. aeruginosa的MIC是AZI组的一半。AZI-RHL NPs可有效破坏生物被膜的结构,去除EPS中的蛋白质和多糖,在清除生物被膜的同时降低膜内细菌存活率,并抑制P. aeruginosa在BEAS-2B细胞上的黏附,避免残余细菌形成新的生物被膜。与黏蛋白溶液共孵育后NPs粒径无明显变化,提示NPs与黏蛋白相互作用较弱,推测其可穿透黏液到达P. aeruginosa感染部位。  结论  AZI-RHL NPs通过“穿透黏液-破坏生物被膜-杀死膜内细菌-抑制残余细菌再黏附”的“除膜四部曲”策略,有效提高了P. aeruginosa生物被膜的清除,为治疗包括P. aeruginosa在内的由生物被膜引起的顽固性感染提供了一种可复制的通用型策略。     

铜绿假单胞菌QS系统缺陷对生物膜形成及大鼠肺部慢性感染的影响

目的研究lasI rhlI基因缺陷对铜绿假单胞菌体外生物膜形成的影响;观察铜绿假单胞菌PAO1野生型及其群体感应系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜致病性的差异,了解群感应系统的lasI rhlI基因在铜绿假单胞菌生物膜感染致病过程中的作用。方法采用生理盐水-吸痰管系统进行铜绿假单胞菌体外生物膜的培养,3d后用扫描电子显微镜观察PAO1、PAO1 lasI rhlI形成生物膜的情况。从大鼠支气管内直接予以PA(菌种为铜绿假单胞菌PAO1野生型,PAO1 lasI rhlI基因缺陷型)海藻酸盐微菌粒悬液(1×109CFU/mL)攻击,建立PAO1野生型及QS系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜肺部感染动物模型。于感染2周后评估各组大鼠的肺部病理学、细菌学的变化。结果3d后PAO1野生型的生物膜较厚,lasI rhlI基因缺陷型菌株所形成的生物膜结构呈薄膜状,明显薄于PAO1野生型。感染2周后,PAO1野生型组的病理学改变和细菌学改变均显著重于lasI rhlI基因缺陷组(P<0.001)。结论QS系统的lasI和rhlI基因影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力,并且在PA肺部感染过程中发挥着重要作用。     

百肤青抗铜绿假单胞菌生物膜的作用

目的:观察百肤青体外抗铜绿假单胞菌生物膜的作用.方法:通过琼脂稀释法测定铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),用改良平板法建立体外铜绿假单胞菌生物膜并检定不同MIC浓度的抗铜绿假单胞菌生物膜的作用,扫描电镜确认. 结果:4种不同MIC的百肤青都有抗铜绿假单胞菌生物膜的作用.结论:中药复方百肤青由于其有抗铜绿假单胞菌生物膜的作用,不仅可用于治疗细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV),还有预防BV的作用.     

铜绿假单胞菌耐药机制的研究进展

铜绿假单胞菌(PA)是医院内感染及获得性感染的最常见革兰阴性条件致病菌之一。广谱抗生素的大量应用致其耐药情况日趋严重,特别是多重耐药及泛耐药株的出现,成为临床上治疗最棘手的问题。PA的耐药机制极为复杂,主要包括外膜蛋白的缺失或突变;主动外排机制;产生β内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶;青霉素结合蛋白和DNA拓扑异构酶的改变;生物被膜的形成等。     

铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜的表达

目的 研究携带Ⅰ类整合子的铜绿假单胞菌在浮游状态和生物被膜状态Ⅰ类整合酶基因(intI1) mRNA的表达水平,探讨生物被膜中整合子相关的基因转移的分子机制.方法 采用竞争RT-PCR方法定量检测intI1在两株临床分离的铜绿假单胞菌(PA10和PA39)生物被膜菌和浮游菌中mRNA的表达水平.首先用PCR方法从Ⅰ类整合子阳性铜绿假单胞菌全基因组DNA中扩增竞争体DNA (cDNA),再以cDNA为模板体外转录合成竞争体RNA (cRNA);再将不同稀释度的cRNA分别与铜绿假单胞菌的浮游菌和生物被膜菌的总RNA提取物进行竞争RT-PCR,产物经电泳分析,以已知cRNA的量确定待测样本中intI1 mRNA的表达量.结果 两株铜绿假单胞菌在其浮游状态和生物被膜状态都有intI1 mRNA表达;两菌的浮游菌和生物被膜菌intI1 mRNA表达量分别近似相等;但两菌生物被膜菌intI1 mRNA的表达量都较其浮游菌高(约15倍).结论 铜绿假单胞菌在生物被膜状态下Ⅰ类整合子intI1 mRNA的表达上调是耐药性广泛传递和多重耐药性形成的可能原因之一.     

The action of Pseudomonas aeruginosa biofilms in intrinsic drug resistance

Background There is a growing interest in studying the relationship between intrinsic resistance and biofilms resistance to drugs. However, the relationship still remains unclear in the macroscopic bacterial growth. Our study is to illuminate the change of bacterial drug resistance of gyrA mutant and active efflux pump during the development of Pseudomonas aeruginosa （ P. aeruginosa ） biofilms. Methods The strains of typeⅡ topoisomerase gene mutant （gyrA mutant） and multidrug resistance （MDR） efflux pump were clinical isolates and detected by polymerase chain reaction （PCR）. The process of bacterial biofilms development was observed by scanning electron microscope. Triparental mating experiments were performed to transfer report gene of green fluorescent protein （GFP） into P. aeruginosa biofilms strains and followed by analysis of bacterial survival rate between intrinsic resistance and biofilms resistance. Results The fluorescent strains with pGFPuv could develop mature biofilms on Teflon surface. Before a period of 72 hours, the survival rate of biofilms bacteria and intrinsic resistance strains in ciprofloxacin solution was significantly different （ P 〈 0.05）. The survival number of intrinsic resistance strains （gyrA mutation and active efflux pump） was illustriously higher than biofilm strain in the initial stage of biofilms development. After 72 hours incubation, there was no clearly difference between mutants and biofilms strains in the survival rate （P 〉 0.05）. The carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone and azithromycin could significantly reduce the drug resistance of biofilm strains and efflux pump strains. Conclusions In the development of P. aeruginosa biofilms, the strains of gyrA mutation and MDR efflux could be conferred with new level of drug resistance. When co-cultured mutated strains with biofilm strains, biofilms may play a major role in bacterial resistance. But after 72 hours incubation （ a mature biofilms had been developed） , there was no clearly difference between the number of mutant strains and biofilm strains.