用于培养1-6型HCV颗粒的免血清高滴度培养体系的生产和特征

<正>【据《Virology》2014年6月报道】题:用于培养1-6型HCV颗粒的免血清高滴度培养体系的生产和特征(作者Mathiesen CK等)最近制造HCV颗粒(HCVcc)的细胞培养系统被研发出来。构建无血清培养环境可能更利于无活性全病毒疫苗的发展。丹麦哥本哈根卫生和医学科学学院Mathiesen CK等描述了通过培养于腺病毒的Huh7.5细胞表达介质获得基因型1-6型的无血清HCVcc(sf-HCVcc)。与HCVcc相比,sf-HCVcc显示出0.6~2.1 log10倍(4.7~6.2 log10Focus Forming Units/ml)的感染性滴度的增加,可能与sf-HCVcc的释放增加和特异性感染力相关。与HCVcc相反,sf-HCVcc在密度梯度谱中只有一个同源性高峰。sf-HCVcc的进入依赖于HCV共同受     

紧密连接蛋白claudin-1对HCVcc易感性的影响

目的 利用HCV体外培养细胞模型,观察紧密连接蛋白claudin -1对于HCV易感性的影响.方法 构建pEGFP - claudin -1真核表达载体,脂质体转染293T细胞,观察claudin -1的表达,检测claudin -1对HCVcc感染性的影响;使用化学合成claudin -1 siRNA序列,抑制Huh -7.5细胞中claudin -1的表达,检测HCVcc感染性的变化.结果 293T细胞上外源性瞬时表达claudin -1后,获得对HCVcc的易感性,化学合成的siRNA序列可有效抑制Huh -7.5细胞上的claudin -1的表达,阻断HCVcc对Huh -7.5细胞的感染.结论 紧密连接蛋白claudin -1影响细胞对HCV的易感性,可能与HCV的嗜肝性有关.     

慢性丙型肝炎患者病毒基因分型与血清HCV RNA水平的关系探讨

目的研究HCV基因型的分布,以探讨不同基因型感染者血清HCV RNA载量的差异。方法采用PCR法检测218例慢性丙型肝炎患者血清HCV RNA;采用ELISA法检测抗-HCV抗体;使用全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶;采用化学发光免疫分析法测定血清肝纤维化指标;采用基因芯片法进行HCV基因分型。结果在218例HCV RNA阳性血清中共检出9种基因型,分别是lb、2a、3a、3b、6型单基因型共208例和lb+2a、lb+3b、lb+6型、2a+3a共10例四种混合基因型,其中以lb型168例(77.1%)、2a型19例(8.7%)为主;在208例HCV单基因型感染患者中发现不同基因型感染者血清HCV RNA载量无统计学差异(F=0.932,P>0.05);在168例1b基因型和40例非lb基因型感染者,性别差异无统计学意义(x2=0.857,P>0.05),两型感染者之间肝纤维化指标差别比较也无统计学意义。结论我国HCV基因型以lb型为主,基因型与HCV RNA载量及ALT水平之间无相关性。     

C型凝集素CLEC4M对HCVcc易感性的影响

目的利用HCV体外培养细胞模型,观察C型凝集素CLEC4M对于HCVcc易感性的影响。方法构建GV166-CLEC4M慢病毒表达载体,脂质体转染293T细胞,获取的慢病毒转染Huh7.5细胞,获得稳定过表达CLEC4M的Huh7.5细胞系(即Huh7.5-CLEC4M),Western印迹和RT-PCR检测CLEC4M的过表达情况。利用HCVcc病毒液感染过表达CLEC4M的Huh7.5细胞系,并设置单克隆抗体干扰组及甘露聚糖干扰组,检测CLEC4M对HCVcc感染性的变化。结果 Huh7.5细胞系获得稳定过表达的CLEC4M。Huh7.5-CLEC4M获得对HCVcc的高度易感性。经鼠抗人CLEC4M单克隆抗体和甘露聚糖干扰后,Huh7.5细胞的感染效率较前降低。结论 C型凝集素CLEC4M影响细胞对HCVcc的易感性,可能与HCV的嗜肝性有关。     

HCV细胞培养系统研究进展

我国丙型肝炎患病率高,目前临床使用干扰素┼利巴韦林治疗,但仅对50%的HCV基因1型患者有效,因此急需有效的治疗方法。由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低,且病毒变异高,目前对HCV机制的研究仍处于初级阶段,至今尚未建立可靠、稳定的HCV动物模型及感染细胞系统。如能建立一个有效的体外复制系统,对研究HCV的附着、融合、内吞、入胞、复制、释放和发病机制等有重要意义。本文就近年来国内外出现的HCV体外感染细胞系统的研究新进展进行综述,重点对稳定性较好的HCV体外细胞培养模型和HCV假病毒感染颗粒加以阐述。     

一种竞争性HCV定量方法的建立及其应用

目的:建立检测丙型肝炎病人血清HCV RNA水平的竞争性定量方法。方法:采用含HCV5＇非编码区(5＇NCR)缺失突变重组质粒5Tld,将前期目的基因亚克隆进体外转录载体pCDNAI,获得特录重组体5Tld＇。线性化后用SP6 RNA聚合酶体外转录竞争性缺失突变模板RNA,定量后与血清HCV RNA一起作逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),建立检测血清HCV RNA水平的竞争性定量方法。结果;检测15例丙肝病人20份血清,滴度为6.6×10~(12)～6.6×10~6拷贝/ml,经干扰素治疗后病毒水平下降1～5个log,年龄<20岁者干扰素治疗效果较好。结论:竞争性逆转录聚合酶链反应是一种较好的检测HCV RNA水平的定量方法。     

HCV受体及入胞相关分子的研究进展

HCV是丙型肝炎的致病体，在被感染组织和血清中浓度较低，病毒高度变异及缺乏稳定的体外细胞培养系统及理想的实验动物模型等问题，阻碍了对HCV的进一步研究。近年来各种HCV体外培养系统的建立，为HCV的研究提供了强有力的工具，使人们对HCV的认识提升到新的层次。本文就CD81、低密度脂蛋白受体、清道夫受体B1及claudin—1等受体及入胞相关分子研究进展作一简要综述。     

贵州地区HCV感染者基因型分布特征

目的 探讨贵州地区丙型肝炎患者HCV基因型分布特征,为HCV感染的防控和个体化治疗提供临床依据。方法 选取2011年9月-2018年10月贵阳市公共卫生救治中心1211例HCV RNA阳性的丙型肝炎患者,采用PCR直接测序法,与GenBank中已知的HCV序列进行对比,获得HCV基因型及亚型,并分析其分布与性别、年龄、民族、地区、感染途径等因素的关系。计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。结果 1211例HCV感染者共检出4种基因型和11种基因亚型,其中以1b型(26.84%)、3b型(27.17%)和6a型(24.28%)为主。不同HCV基因型在男女感染者中分布差异有统计学意义(χ2=15.428,P=0.009),其中男性以3b型为主(29.34%),女性以1b型为主(32.21%)。不同HCV基因型分布在各年龄组中差异有统计学意义(χ2=67.439,P<0.001),≤18岁组与≥60岁组以1b型为主(分别为66.67%、58.93%),而19~39岁组以3b型(28.93%)、6型(29.29%)为主,40~59岁组以1b型(29.54%)、3b型(27.33%)和6型(24.28%)为主。各种感染途径的HCV基因型分布差异有统计学意义(χ2=153.916,P<0.001),感染方式以静脉药瘾为主(57.97%),其次是性接触和有创美容(均为8.42%);经静脉药瘾、有创美容感染HCV者均以3b型为主(分别为31.48%、32.35%),性接触感染者多为HCV 6型(36.27%)。不同民族、贵州地区间HCV基因型分布差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论 贵州地区HCV基因型分布呈多样性,3b、1b、6a型为主要流行株,存在HCV 6型中的多种少见基因亚型,且在不同的年龄、性别、感染途径方面HCV基因型分布存在差异。     

广西地区HIV合并HCV感染人群HCV基因型分布特征

目的了解广西地区艾滋病病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染人群HCV基因型的分布特征。方法收集广西地区51例HCV RNA阳性HIV感染者的血清,通过对反转录巢式聚合酶链反应(RT nested-PCR)扩增HCV NS5B区段,所得终产物直接测序进行HCV基因分型。结果在51例样本中,HCV基因型以3b和6a型为主,各占23.53%(12/51),其次为1a型,占19.61%(10/51);3a型、1b型、6d型分别占13.73%(7/51)、9.80%(5/51)、1.96%(1/51),2a型、6e型各占3.92%(2/51)。分析表明,HIV合并HCV感染者的HCV基因在性别、年龄、感染途径分布差异没有统计学意义(P0.05)。结论广西地区HIV合并HCV感染者流行的HCV基因亚型至少有1a、1b、2a、3a、3b、6a、6d、6e共8种,3b和6a可能为流行的主要基因亚型,1a型次之。初步说明广西地区HIV合并HCV感染人群流行的HCV基因亚型呈多样性,同时它们与性别、年龄及感染途径无明显相关性。     

HLA-G 14 bp基因插入/缺失多态性和HCV病毒载量的关系

目的:探讨人类白细胞抗原G(HLA-G)14 bp插入/缺失多态性与慢性丙型肝炎病毒(HCV)载量的相关性。方法:联合采用聚合酶链反应技术(PCR)及荧光毛细管电泳技术,对196例慢性丙型肝炎患者进行HLA-G 14 bp插入/缺失多态性的检测;采用实时PCR方法检测患者血清HCV病毒载量。结果:慢性HCV患者HLA-G基因型(+14 bp/-14 bp)、(-14 bp/-14 bp)及(+14 bp/+14 bp)的频率分别为41.8%、47.5%、10.7%,HCV载量分别为9.405×10~6(1.012×10~6～4.715×10~7)IU/mL、8.200×10~6(1.465×10~6～3.28×10~7)IU/mL、1.080×10~(11)(7.995×10~5～5.300×10~7)IU/mL。携带不同HLA-G基因型患者的HCV病毒载量差异无统计学意义(P0.05)。结论:HLA-G14bp基因插入/缺失多态性与HCV病毒载量无相关性。     

5339例感染者丙型肝炎病毒基因型特征分析

目的研究北京佑安医院收治患者的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因型及临床特征。方法选取2015年5月至2017年11月北京佑安医院诊治的患者,通过对病历号及身份证号识别排除重复病例,明确HCV感染及HCV基因型者共计5 339例,并对其临床资料进行统计分析。结果 5 339例感染者共检测到HCV的5个基因亚型:1b、2a、3a、3b、6a,占比分别为65.1%(3 478例)、28.5%(1 521例)、1.9%(101例)、3.2%(168例)、1.3%(71例);1b和2a型男女无显著差异,42.5%(2 126例)有单采浆献血史,27.4%(1 368例)有明确接受输血史;340例3a、3b和6a型感染者中,94.1%(320例)年龄30~60岁,70.6%(240例)为男性,75.3%(256例)有静脉药瘾史。临床分期依次为慢型肝炎、分期不明、肝硬化、肝癌等,占比分别为76.8%(4 099例)、15.1%(808例)、6.7%(358例)、1.4%(74例)。结论北京地区HCV基因型的分布以1b型和2a型为主,3型和6型主要分布在30~60岁静脉吸毒男性人群中;绝大多数HCV感染者的临床症状轻微或无,但具有传染性,主动筛查至关重要。     

软肝化坚颗粒调节肝星状细胞分泌胶原及相关细胞因子的研究

目的:观察软肝化坚颗粒药物血清对肝星状细胞(HSC)分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原及肝纤维化相关细胞因子的影响.方法:通过灌胃制备小鼠软肝化坚颗粒及秋水仙碱药物血清.将HSC-T6细胞分为3组,分别加入含10％软肝化坚颗粒血清、10％秋水仙碱血清和10％正常小鼠血清的培养基,培养24小时后,收集培养上清.采用ELISA法检测Ⅰ型胶原、转化生长因子β1 (TGF-β1)、瘦素(LP)及血小板衍生生长因子(PDGF)的含量;采用放射免疫法检测Ⅲ型胶原含量.结果:与正常血清对照组相比,秋水仙碱血清组和软肝化坚颗粒血清组培养上清中Ⅰ型胶原含量均显著降低,P值均为0.000;Ⅲ型胶原的含量也均显著降低,P值分别为0.005和0.001.与正常血清对照组相比,秋水仙碱血清组培养上清中TGF-β1、LP和PDGF的含量均明显降低,P值均为0.000;软肝化坚血清组也均显著降低,P值均为0.000;软肝化坚颗粒血清组与秋水仙碱血清组相比,培养上清中TGF-β1、LP的含量均明显降低,P值分别为0.006和0.043.结论:软肝化坚颗粒可抑制活化的HSC产生TGF-β1、PDGF及LP等细胞因子,从而对HSC分泌胶原产生抑制作用.     

新疆地区丙型肝炎病毒基因分型及临床意义的研究

目的研究新疆地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布特点,并探讨HCV基因型分布与性别、年龄、民族、病毒载量、肝脏损伤炎症程度、肝病转归的相关性,以及病毒载量与肝脏损伤炎症程度的关系。方法选取2013年6月至2016年10月期间于新疆医科大学第一附属医院住院病例331例,采用实时荧光定量PCR技术检测血清HCV RNA水平,并检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)等肝功能相关指标,HCV基因分型采用聚合酶链反应荧光探针法。结果 (1)331例患者中,男/女为156/175,年龄范围12~80岁,平均年龄50.8岁,其中1b型231例,占69.79%(102/129);2a型66例,占19.94%(32/34);3a型22例,占6.67%(13/9);3b型11例,占3.32%(8/3);6a型1例,占0.03%(1/0)。(2)HCV基因型分布与年龄的相关性差异有统计学意义(P0.05),与性别、ALT、AST、肝病转归的相关性差异无统计学意义(P0.05)。(3)HCV基因型分布与民族、病毒载量的相关性差异有统计学意义(P0.05)。(4)病毒载量与ALT、AST的相关性差异无统计学意义(P0.05)。结论新疆地区HCV感染以1b型为主。HCV基因型分布与性别、肝脏损伤炎症程度、肝病转归等无关,与民族、年龄、病毒载量有关。HCV病毒载量与肝脏损伤炎症程度无关。     

MDCK悬浮细胞制备及流感病毒敏感性研究

目的 建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性。方法 运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID₅₀滴度,分析其病毒敏感性。结果 成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×10⁶ cells/mL以上,且差异无统计学意义(P>0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P>0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×10⁶ cells/mL接种于5 L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×10⁶ cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h^-1、(0.028±0.013)h^-1、(0.027±0.013)h^-1(P>0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6~7)log₂HA/25 μL、CCID₅₀为(4.35~4.68)lgCCID₅₀/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9~10)log₂HA/25 μL,CCID₅₀为(6.38~7.31)lgCCID₅₀/mL。接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7~9)log₂HA/25 μL、CCID₅₀为(6.21~6.96)lgCCID₅₀/mL。结论 本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考。     

双核酶自切割HCV全基因组复制子的构建及其体内外复制的特性

目的 建立可在细胞内直接启动HCV复制并且能产生感染性病毒颗粒的HCV全基因组复制子,进行HCV体内外实验研究. 方法 在HCV JFH1及JFH1/GND cDNA序列两侧分别加上核酶序列与pcDNA3.1载体构建重组质粒pcDNA3.1-RZ-JFH1和pcDNA3.1-RZ-JFH 1/GND.用重组质粒直接转染Huh7.5细胞及进行昆明小鼠尾静脉高压注射.定量实时逆转录聚合酶链反应、细胞免疫荧光染色、免疫组织化学染色和血清学检查分别检测其体内外复制的特性.结果 在16周的检测期内,从转染HCV复制子的Huh7.5细胞培养上清液中持续稳定地检测出1×106 ～3 × 106拷贝/ml的HCV RNA(非稳定转染),产生的病毒颗粒具有感染性.在尾静脉高压注射HCV复制子的昆明小鼠,检查到短暂的病毒血症,免疫组织化学染色未能发现HCV抗原阳性细胞,未检测到血清中HCV特异性抗体.结论 构建的HCV复制子在体外能长期、稳定及高效的产生感染性病毒颗粒,但体内实验未能获得预期效果,可能与HCV JFH1病毒株的特殊性有关.所建立的HCV全基因组复制子可用于HCV病毒学及抗病毒药物筛选等方面的研究.     

山东地区丙型肝炎病毒的基因型及血清学分型的研究

探索山东地区丙型肝炎病毒(HCV)的基因型及血清学分型的分布,了解HCV基因型与感染途径的关系.对96例抗HCV阳性患者的血清进行HCV RNA检测,HCV RNA阳性者,应用限制性片段长度多态性分析(RELP)进行基因分型;同时应用Murex Serotyping HCV 1-6血清学分型试剂进行血清学分型.基因非2(1b)型79例,占83.16%,2(2a)型为16例占16.84%,44份血清标本的血清学分型可分型率为90.91%,与基因分型的符合率为90.00%.不同的感染途径之间,基因型分布没有差异(P=0.15).山东地区丙型肝炎病毒流行株为基因非2(1b)和2(2a)型,非2(1b)型为优势株,基因分型与血清学分型结果基本一致,基因型与丙型肝炎的感染途径无关.     

我国部分地区静脉吸毒人群HCV基因型分布的探讨

目的了解静脉吸毒人群丙型肝炎病毒(HCV)感染者的基因亚型分布及影响因素,为防治静脉吸毒人群感染HCV提供依据。方法收集828份静脉吸毒人群样本,HCV抗体初筛用酶联免疫吸附试验(ELISA),有反应性的样本再用重组免疫印迹法(RIBA)进行补充试验,阳性的样本进行核酸检测;核酸阳性的样本先用HCV基因分型试剂盒进行分型,未通过分型试剂盒确定型别的样本,再用巢式聚合酶链式反应扩增HCV CORE区进行测序,以确定HCV基因型。结果 828份静脉吸毒人群样本中,HCV抗体阳性498份,核酸检测呈阳性反应的样本390份,通过HCV基因分型试剂盒确定型别的样本311份,经CORE区测序确定型别的样本70份,有9份未成功扩增出序列,共有381份样本确定了基因亚型。其主要基因亚型为3b、3a、1b、6n及6a五种型别,分别占38.6%(147/381)、20.5%(78/381)、18.6%(71/381)、10.8%(41/381)、8.7%(33/381);不同地区之间流行的HCV基因型别差异具有统计学意义(χ~2=282.23,P0.01);男性和女性之间主要基因型不太一致;各年龄段间HCV基因亚型分布的差异无统计学意义(χ~2=40.93,P0.05),但30~50岁感染者居多。不同基因型之间HCV核糖核酸含量的差异有统计学意义(F=5.85,P0.01)。结论静脉吸毒人群HCV感染者的基因亚型主要为1b、3a、3b、6a及6n,基因型分布具有地域性差异,并且病毒载量与基因型的分布具有相关关系。     

血源性HCV在人类胎肝干细胞中的高效复制

<正>【据《Hepatology》2017年4月报道】题:血源性HCV在人类胎肝干细胞中的高效复制(作者Guo X等)由于缺乏可有效模拟HCV感染的细胞模型,使得HCV感染的机制研究、特异性抗病毒治疗药物筛选和预防性疫苗研制都受到了很大的限制。作者基于人类胎肝干细胞(hFLSC)建立了一套可以支持血液来源的HCV(bbHCV)感染的全生命周期体外细胞培养模型。在这个模型中,90%以上的细胞可以被不同型别的bb HCV感     

长春地区出入境人员感染丙型肝炎病毒的基因分型研究

目的研究长春地区出入境人员感染丙型肝炎病毒(HCV)的基因型分布。方法收集42例丙型肝炎阳性者的血清标本,采用基因测序法进行HCV基因型检测和分析。结果 42份HCV阳性血清基因分型分别为1b、1a、2a,其中基因1型21份(占50%),1b亚型13份(占30.95%),1a亚型8份,2a亚型9份。HCV基因型性别、年龄分布差异无统计学意义(P0.05)。结论长春地区出入境人员感染的HCV以1b型为主,2a型次之。     

激光共聚焦技术证实HCV NS5在人胎盘滋养层细胞的定位表达

目的胎盘屏障是营养物质以及某些药物、病原体、激素等从母体进入胎儿的必经之路。体外分离培养滋养层细胞是研究其功能及母体与胎儿之间物质交换的具体分子机制的细胞学基础。本研究的目的是探讨体外分离培养的人体胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)后HCV NS5在滋养层细胞中的定位表达。方法采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞,以HCV RNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染试验,应用RT-PCR法定性及定量检测感染后细胞培养上清中HCV RNA,用激光共聚焦技术观察免疫荧光染色后HCV NS5在滋养层细胞中的定位。结果HCV感染后的细胞培养上清中可间断检测到HCV RNA,而对照组始终未检出;激光共聚焦观察显示HCV NS5主要定位于细胞核周围。结论感染HCV的人滋养层细胞中存在HCV NS5表达。此研究为进一步深入研究HCV的母婴传播分子机制奠定了实验基础。