siRNA联合顺铂抑制骨肉瘤细胞增殖的研究

目的构建人Survivin基因的siRNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞MG63凋亡及顺铂化疗的增敏作用。方法应用pSilencer 3.0-H1 neo,构建Survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。半定量PCR和免疫荧光染色分别检测Survivin mRNA与蛋白的水平变化。Annexin V法检测细胞凋亡。MTT法检测顺铂对细胞的杀伤作用。结果构建Survivin基因siRNA真核表达载体PsiS。获得了稳定转染的细胞系。与MG63、阴性对照细胞比较,MG63/PsiS生长曲线则十分平缓。MG63/PsiS细胞中Survivin的mRNA及蛋白表达明显减少。MG63/PsiS凋亡率增加为17.8%(P<0.01)。1 mg/L顺铂作用下,MG63/PsiS死亡率是其他各组的2.3倍(P<0.01)。结论特异性siRNA能够明显阻断Survivin基因的表达促进MG63细胞凋亡,提高细胞对顺铂的敏感性。     

血管内皮生长因子重组腺病毒转染鼠骨髓基质细胞及其产物促内皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165(VEGF165)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后对VEGF基因的转录、表达及其产物生物活性的影响。方法体外培养4只大鼠骨髓基质细胞,用携带VEGF165基因的重组腺病毒转染培养细胞;通过逆转录聚合酶链反应、免疫印记法和酶联免疫吸附法检测VEGF在转染细胞内的转录、表达和细胞外分泌情况;通过血管内皮细胞增殖实验测定转染VEGF165基因后的BMSCs培养上清中VEGF蛋白的生物活性。结果腺病毒介导VEGF165基因转染BMSCs后可以获得有效的转录及表达,其分泌于培养上清中的表达产物可明显促进大鼠主动脉血管内皮细胞的增殖(P<001),具有很强的生物学活性。结论腺病毒可安全、有效地转染BMSCs,VEGF165基因转染的鼠BMSCs可有效表达具有生物活性的VEGF蛋白。     

顺铂诱导人成骨肉瘤耐药细胞系的建立及生物学特性研究

目的：建立顺铂诱导的人成骨肉瘤多药耐药细胞系MG63／R并观察其生物学特性。方法：以顺铂为诱导剂,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法诱导人成骨肉瘤MG63细胞,建立多药耐药系MG63／R。MTF法检测药物敏感性：光镜、透射电镜观察MG63、MG63／R细胞形态及超微结构变化;生长曲线、克隆形成试验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数、P—pg、bcl-2、p53蛋白表达。结果：经顺铂186d的诱导建立了MG63／R,MG63／R对顺铂的耐药指数为83．557,对阿霉素、长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰氨亦产生不同程度的交叉耐药;光镜观察可见MG63／R细胞排列不规则,形态呈三角形、多角形及多核现象;透射电镜显示MG63／R细胞表面突起增加,粗面内质网丰富;细胞周期分析显示细胞增殖能力明显增加而细胞凋亡明显降低;MG63／R细胞P—pg、bcl-2阳性表达较MG63细胞明显增加,p53表达则明显降低。结论：本研究建立了稳定的人成骨肉瘤多药耐药细胞系（MG63／R）,为进一步研究顺铂的多药耐药机制和耐药治疗提供了一种新的实验模犁。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子小干扰RNA对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的研究

目的 观察腺病毒介导的血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹状小分子干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤细胞株MG63增殖和凋亡的影响.方法 将携带VEGF短发夹状siRNA的腺病毒载体Ad-VEGF-siRNA感染MG63.噻唑蓝(MTT)比色分析细胞体外增殖力,Hoechst染色、流式细胞术观察细胞凋亡.建立30只裸鼠移植瘤模型,Ad-VEGF-siRNA组瘤内注射Ad-VEGF-siRNA病毒纯化液0.2ml,通过免疫组织化学技术,观察肿瘤组织中MG63细胞的增殖和凋亡.结果 与对照组比较,Ad-VEGF-siRNA组MG63细胞生长减慢,Hoechst染色可见到典型的凋亡细胞,24、48、72h凋亡率分别为7.27%、12.01%和20.09%.Ad-VEGF-siRNA明显抑制移植瘤生长,抑瘤率达40.7%.Tunel染色可见MG63细胞典型凋亡特征,同时肿瘤组织中PCNA、bcl-2表达明显减少(P<0.01). 结论 Ad-VEGF-siRNA可高效而特异地阻断VEGF基因表达,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡.     

Bcl2及Bak1重组表达腺病毒对MG63细胞的影响

目的研究Bcl2、Bak1重组表达腺病毒载体单独或共转染对MG63细胞活性及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的影响。方法收集对数期MG63细胞,分为4组:A组:空载腺病毒干预组;B组:Bcl2重组表达腺病毒转染组;C组:Bak1重组表达腺病毒转染组;D组:Bcl2、Bak1重组表达腺病毒共转染组。A组给予空载腺病毒转染,B、C组分别给予Bcl2重组表达腺病毒、Bak1重组表达腺病毒转染,D组给予Bcl2、Bak1重组表达腺病毒共转染,MTT法检测细胞活性,碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)活性检测试剂盒检测ALP活性,流式细胞仪检测钙离子浓度,Western Blot检测CTGF、Runx2、OPN、TNF-α的表达。结果与A组相比,B组细胞活性、ALP活性升高,钙离子浓度降低,CTGF、OPN、Runx2蛋白相对表达量均升高,TNF-α表达量则降低,差异有统计学意义(P0.05);C组细胞活性、ALP活性降低,钙离子浓度升高,各蛋白相对表达趋势与B组相反,差异有统计学意义(P0.05);D组细胞活性、ALP活性、钙离子浓度升高,CTGF、Runx2相对表达量升高,OPN、TNF-α相对表达量降低,但差异均无统计学意义(P0.05)。(2)B组、C组、D组各检测指标组间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 Bcl2重组表达腺病毒载体转染MG63细胞可增强细胞活性及钙化能力,促进骨形成。     

重组蛋白sCAR-TMTP1增强腺病毒对骨肉瘤细胞基因转染效率的研究

目的 提高腺病毒(adenovirus,ADV)在缺乏柯萨奇腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor,CAR)的骨肉瘤细胞中的转染效率.方法 通过昆虫(Bac-to-Bac)杆状病毒表达系统表达含有CAR胞外段(sCAR)及TMTP1肽的重组蛋白(sCAR-TMTP1),并对其纯化、鉴定.流式细胞仪分别检测骨肉瘤细胞及人胚肾细胞293(HEK293)的CAR表达水平,ADV对其的感染效率及FITC-TMTP1的结合能力.重组蛋白sCAR-TMTP1与ADV共同孵育形成复合物,流式细胞仪研究其在缺乏CAR的骨肉瘤细胞(MG-63)中的转染效率.结果 表达及纯化的sCAR-TMTP1蛋白在相对分子质量约31000处可见特异蛋白条带,感染的sf9细胞裂解上清可与兔抗小鼠sCAR单克隆抗体发生特异性反应.MG-63可与FITC-TMTP1特异结合,其CAR表达水平低,ADV转染效率低.经sCAR-TMTP1修饰后的ADV/GFP对MG-63细胞的感染效率显著高于未经修饰的含报告基因GFP的ADV(ADV/GFP).结论 重组蛋白sCAR-TM-TP1可显著提升ADV对缺乏CAR的骨肉瘤细胞的转染效率.     

P16基因转染对人膀胱癌细胞生物学特性的影响

目的探讨P16基因修饰后人膀胱癌细胞体外培养生物学特性的变化。方法将携带P16基因的腺病毒体外转染人膀胱癌T24细胞,观察腺病毒对T24细胞的转染效率以及P16基因修饰的T24细胞体外生物学特性的改变。结果在多重感染度(MOI)值为50,转染时间为12h时,能够达到75％～80％的转染效率,并获得目的基因P16蛋白的高效表达。转染P16基因的T24细胞生长明显受到抑制,Fas和MHCI类抗原表达增高。细胞周期分析显示细胞阻滞于G0／G1期的比例明显高于对照组(85％比62％)。结论人膀胱癌细胞中外源P16基因的表达不仅直接抑制肿瘤细胞的恶性增殖。还可诱导细胞发生凋亡,同时能增强肿瘤细胞的自身免疫原性。     

携带Fas基因重组腺病毒治疗瘢痕疙瘩的体外研究

目的 应用成功制备的携带人Fas基因的两种重组腺病毒，感染瘢痕疙瘩(keroid，K)成纤维细胞(fibroblasts，FB)，使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白，并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法 腺病毒感染KFB后，检测及比较两种腺病毒转染前后，KFB内Fas蛋白的表达变化、蛋白功能以及细胞增殖-凋亡状况。结果 腺病毒感染后的KFB均能稳定提高Fas蛋白的表达，并且在Fas单克隆抗体的诱导下可以发生明显的细胞凋亡。结论 ①构建的两种重组腺病毒Ad-Fas在体外实验中能有效地提高KFB蛋白的表达，并可以重建原来阻断的死亡信号传导通道；②细菌内重组腺病毒体外治疗效果更佳；⑧再次估证了Fas基因突变与K之间的联系，为K基因治疗展示了一条新途径。     

微小RNA-184通过Janus激酶2/信号转导与转录激活因子3途径下调B细胞淋巴瘤/白血病-2样蛋白1介导骨肉瘤的化疗耐药的机制

目的探究微小RNA(miRNA, miR)-184通过Janus激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号通路影响B细胞淋巴瘤/白血病-2样蛋白1(BCL2L1)参与骨肉瘤细胞化疗耐药性的机制。方法选用骨肉瘤细胞株MG63, 采用聚合酶链反应(PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)等方法检测其中miR-184表达水平以及JAK2/STAT3、BCL2L1蛋白表达;转染miR-184模拟物、抑制物序列, 观察对MG63、顺铂培养下的MG63(DPP-MG63)的影响, 另将JAK2/STAT3通路抑制剂AG490与细胞一起培养, 观察细胞变化。采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析及组内两两比较LSD-t检验进行统计学分析。结果 miR-184在骨肉瘤细胞中降低(t=9.074, P<0.05), 在过表达miR-184后骨肉瘤细胞的增殖、侵袭能力减弱, 凋亡率升高(F=13.810、57.090、59.660, P<0.05), 且其中JAK2/STAT3通路的蛋白表达、BCL2L1蛋白(0.92±0.04)均被抑制, 细胞耐药性...     

肺癌抑癌基因1对人骨肉瘤细胞株MG63生长和增殖的影响

目的 观察肺癌抑癌基因1(TSLC1)对人骨肉瘤细胞株MG63的生长和增殖能力的影响.方法 将稳定表达TSLC1的人骨肉瘤MG63细胞株M8T设为研究对象,转染空载体的骨肉瘤MG63细胞株M8P设为对照组,人骨肉瘤细胞株MG63设为空白组.噻唑蓝(MTT)法检测M8T细胞增殖;FACSort流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡;将2×107个瘤细胞皮下注射裸鼠,观察体内成瘤的影响.结果 稳定转染TSLCl的实验组M8T细胞株与对照组及空白组细胞比较,其细胞增殖能力下降,生长速度明显受到抑制;M8T细胞G0-G1期细胞数为(63.76 ±2.78)％,生长周期出现了G0～G1期阻滞,细胞凋亡总数为(28.45 ±0.65)个,显著增加(P＜0.01);裸鼠皮下成瘤于皮下注射后3周开始形成.结论 TSLC1能明显抑制骨肉瘤MG63细胞的生长和增殖.     

反义表达人组织蛋白酶L对骨肉瘤细胞侵袭特性的影响

目的: 构建人组织蛋白酶L (cathepsinL, CATL) 基因的正、反义真核表达载体, 观察其转染后对人骨肉瘤细胞MG-63侵袭特性的影响。方法: 用基因重组技术构建人组织蛋白酶L正、反义真核表达载体, 转染人骨肉瘤细胞MG-63, RT-PCR和Westernblot检测CATL的mRNA和蛋白质的表达水平, 并对转染前后骨肉瘤细胞的侵袭能力进行检测。结果: 正、反义真核表达载体成功构建并转染入MG-63细胞中。反义载体转染后的细胞CATL的mRNA和蛋白质的表达水平下降, 体外侵袭实验表明细胞的侵袭力下降。结论: 反义CATL基因的转染使骨肉瘤细胞CATL的分泌水平下降, 细胞的体外侵袭力下降。     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

反义pEGFP-C1-Survivin对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察Survivin反义核酸载体对人骨肉瘤细胞株MG-63生物学行为的抑制效应,并探讨其机制.方法 MTY检测转染前后MG-63细胞增殖抑制率的变化,Boyden小室体外侵袭实验测定转染前后侵袭能力变化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后Ang-2基因mRNA表达的变化.结果 噻唑蓝(MTT)检测显示转染后骨肉瘤细胞增殖明显受抑制,转染组抑制率达到23.4%,与各对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),脂质体组、空质粒组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR分析显示转染组MG-63中Ang-2基因mRNA的表达较转染前明显下降,与其他组之间差异有统计学意义(P<0.01),而另3组之间差异无统计学意义(P>0.05).Boyden小室体外侵袭实验测定显示转染组侵袭百分数为17.9%,与其他各组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 Survivin反义核酸可以显著抑制人骨肉瘤细胞株MG-63的增殖、侵袭能力,部分逆转其恶性表型,这可能与其下调Ang-2的表达有关.     

化疗药上调DR4、DR5表达体外逆转人骨肉瘤对TRAIL的耐受

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）与化疗药对人骨肉瘤的联合作用及其受体（TRAILR）在人骨肉瘤中的表达间的关系。方法应用细胞计数、AO／EB染色、流式细胞术等方法比较检测阿霉素、顺铂、甲氨喋呤、紫杉醇单独作用和与TRAIL联合作用于MG-63及骨肉瘤组织的细胞毒效应；应用原位杂交、Western Blot方法检测人骨肉瘤细胞系MG-63及新鲜骨肉瘤组织用药前后TRAILR的表达。结果阿霉素、顺铂和紫杉醇增强死亡受体的表达，且与TRAIL联合作用诱导人骨肉瘤细胞凋亡的效率显著强于单用。结论阿霉素、顺铂、紫杉醇通过上调DR4、DR5表达逆转人骨肉瘤对TRAIL的耐受。     

DFU对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 观察选择性环氧合酶-2抑制剂DFU对人骨肉瘤细胞株MG-63增殖和侵袭能力的影响及其对Ang-2基因表达的调控.方法 体外培养骨肉瘤细胞株MG-63,免疫荧光法检测Ang-2在MG-63细胞中的表达,应用噻唑蓝(MTT)比色法和形态学检测研究不同浓度DFU对骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制作用,Boyden小室体外侵袭实验检测其对骨肉瘤细胞侵袭能力的影响,RT-PCR法分析DFU对骨肉瘤细胞株MG-63中Ang-2基因表达的影响.结果 免疫荧光染色结果显示Ang-2在骨肉瘤细胞株MG-63中呈阳性染色,MTT法和形态学检测提示DFU可抑制骨肉瘤细胞株MG-63的增殖,并具有剂量依赖性,在DFU浓度为200 μmol/L时,对细胞生长有明显的抑制作用.Boyden小室体外侵袭实验显示DFU可降低骨肉瘤细胞的侵袭能力,在DFU浓度为200 μmol/L时,作用最显著.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析显示经DFU作用后的骨肉瘤细胞株MG-63表达Ang-2较用药前明显下降.结论 DFU对骨肉瘤细胞株MG-63的增殖有抑制作用,其可能通过抑制Ang-2的表达,降低其侵袭能力.     

趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响

目的探讨趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响。方法Real-time PCR 检测人骨肉瘤细胞株 HOS-8603、U2OS 和 MG-63 中 CXCR4 mRNA 的表达情况;构建、鉴定pcDNA3/CXCR4 重组质粒并将其转染到 HOS-8603 细胞中（PCDNA3/CXCR4 组）,同时制备转染 pcDNA3 空质粒的阴性对照组（pcDNA3组）。MTT检测细胞增殖情况,穿膜小室重组细胞基底膜迁移实验检测细胞迁移情况。结果 HOS-8603细胞中CXCR4 mRNA相对表达含量低于U2OS、MG-63细胞（P 〈0.05）。转染后24、48h,pcDNA3/CXCR4 组 CXCR4 mRNA 表达量是 pcDNA3 组的 96 倍和 124 倍（P 〈0.05）。与 pcDNA3 组比较,转染后24、48、72 h,pcDNA3/CXCR4组细胞增殖率和发生迁移的细胞数明显增加（P 〈0.05）。结论 CXCR4的表达可能是促进骨肉瘤细胞增殖和迁移的重要因素。     

腺相关病毒载体介导p27Kip1基因转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

目的 观察p27Kip1基因转染后对骨肉瘤MG-63细胞增殖和生存能力的影响.方法 重组质粒在内的三质粒共转染包装、收集腺相关病毒颗粒,检测病毒滴度并感染MG-63细胞,细胞免疫组织化学检测p27Kip1基因的表达,并行细胞增殖实验、细胞周期分析,探讨p27Kip1基因对骨肉瘤MG-63细胞的体外作用.结果 三质粒成功共转染293细胞,X-gal染色观察转染率为60%;采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度1.6×108 PFU/ml;细胞免疫细胞化学鉴定p27Kip1基因高表达;细胞生长曲线显示转染组细胞增殖明显减慢;流式细胞仪观察转染AAV-p27Kip1组细胞周期见S、G2期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例增高.结论 p27Kip1基因重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后能高表达目的 基因,并阻滞细胞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.     

热疗联合特异性沉默趋化因子受体4对骨肉瘤增殖和侵袭的影响

目的观察热疗联合特异性siRNA沉默趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)对骨肉瘤增殖和侵袭的影响。方法培养人骨肉瘤细胞株MG 63至对数生长期,接种于6孔板中,分为三组,空白组细胞不进行任何处理常规培养,control siRNA组以control siRNA转染细胞,CXCR4 siRNA组以CXCR4 siRNA转染细胞,采用Western blot检测各组CXCR4的表达变化,评估CXCR4 siRNA转染效能。细胞及体内实验设置control siRNA组(对照组)、热疗联合CXCR4 siRNA组(联合组)、CXCR4 siRNA组(沉默组)和热疗组,以CXCR4 siRNA转染沉默组和联合组的细胞,control siRNA转染对照组细胞,热疗组和联合组进行热疗处理。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT qPCR)和Western blot检测各组细胞CXCR4的表达变化。CCK 8法和Transwell侵袭实验检测转染后MG 63细胞的增殖能力和侵袭能力变化。流式细胞技术检测转染后MG 63细胞的周期变化。体外裸鼠成瘤实验和肿瘤生长曲线观察转染后MG 63细胞增殖和裸鼠骨肉瘤生长情况。结果CXCR4 siRNA可以有效沉默MG 63细胞中CXCR4蛋白的表达。热疗联合CXCR4 siRNA有效沉默MG 63细胞中CXCR4的表达并能抑制MG 63细胞增殖和侵袭,阻滞细胞周期于G0/G1期(P均<0.05)。体内实验结果显示,从第14天起,联合组裸鼠骨肉瘤体积逐渐小于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。联合组的瘤重也低于对照组、沉默组和热疗组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论热疗联合特异性沉默CXCR4抑制骨肉瘤的增殖和侵袭,可作为一个有效的骨肉瘤基因治疗新方法。