miR-199a-5p下调NF-κB信号通路激活水平抑制宫颈癌细胞恶性生物学行为

目的探讨miR-199a-5p对宫颈癌细胞生长、侵袭和迁移的影响和机制。方法 Real-time PCR测定miR-199a-5p在宫颈癌HeLa、HCC94、Ca Ski细胞和正常宫颈Ect1/E6E7细胞中的表达差异。在宫颈癌细胞中转染miR-199a-5p mimics,real-time PCR检测过表达效果,MTT检测增殖,克隆形成实验测定克隆形成能力,Transwell小室测定侵袭和迁移能力,Westernblot检测细胞中p-p65、p-IκB蛋白表达变化。使用核因子-κB(NF-κB)激活剂PMA处理转染miR-199a-5p mimics后的宫颈癌细胞,同样使用上述方法测定细胞生长、克隆、侵袭和迁移能力变化。结果 miR-199a-5p在宫颈癌HeLa、HCC94、CaSki细胞中的表达水平低于正常宫颈Ect1/E6E7细胞。miR-199a-5p mimics提高宫颈癌细胞中miR-199a-5p表达水平,降低细胞增殖、克隆、侵袭和迁移能力,减少细胞中p-p65、p-IκB蛋白表达。NF-κB激活剂PMA可以逆转miR-199a-5p对宫颈癌细胞增殖、克隆、侵袭和迁移能力的抑制作用。结论 miR-199a-5p通过下调NF-κB信号通路激活水平抑制宫颈癌细胞生长、侵袭和迁移。     

NF-κB p65 siRNA抑制人脐静脉内皮细胞迁移的研究

目的:观察RNA干扰技术(RNAi)特异性抑制人脐带静脉血管内皮细胞( EAhy926)内NF-κB p65基因效果及对细胞迁移力的影响.方法:10 μg/L血管内皮生长因子(VEGF)刺激培养EAhy926细胞,给予转染NF-κB p65 siRNA,同时设立对照组,分别是阴性对照siRNA转染组、空白脂质体组及正常对照组(不给予其他任何处理),48 h后分别采用RT-PCR、 Western blot检测细胞内NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达水平,并计算细胞迁移抑制率.结果:与正常对照组比较,NF-κB p65 siRNA组的细胞内NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达量均明显减少( P <0.05);而阴性对照siRNA转染组及空白脂质体组的细胞内相应的表达量则无统计学意义.同时,siRNA转染后对细胞的迁移抑制率达64.5%,空白脂质体组和阴性对照siRNA组则仅为7.5%和11.3%.结论:siRNA能通过抑制血管内皮细胞内NF-κB p65的信号通路,抑制细胞的迁移能力,这为今后抗血管生成治疗研究打下了基础.     

KDR调节PI3K/AKT/mTOR信号通路对宫颈癌增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨激酶插入区受体（KDR）调节磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路对宫颈癌增殖、迁移和侵袭的影响。方法 通过实时荧光定量PCR实验和免疫组织化学染色测定人宫颈癌组织和其癌旁组织中KDR的表达。体外培养HeLa细胞,随机分为对照组、KDR siRNA组、KDR siRNA阴性对照组、KDR siRNA+740 Y-P(PI3K激活剂)组,分组转染后,通过MTT实验、平板集落形成实验检测各组HeLa细胞增殖;通过Hoechst 33258染色检测各组HeLa细胞凋亡;通过划痕实验、Transwell实验分别检测各组HeLa细胞迁移及侵袭;通过免疫荧光染色检测各组HeLa细胞Bax、Bcl-2表达;通过免疫印迹实验检测各组HeLa细胞上皮间充质转化相关蛋白（Claudin-1、ZO-1、Vimentin、E-cadherin）、KDR蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白（p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR）表达。结果 与癌旁组织相比,宫颈癌组织中KDR mRNA表达和KDR阳性表达率明...     

下调IRAK1基因调控NF-κB信号通路抑制宫颈癌细胞生长的机制研究

目的探索下调白介素1受体相关激酶1(IRAK1)对宫颈癌细胞恶性生物学特性的影响以及可能作用机制。方法以宫颈癌Caski细胞作为研究对象,在脂质体2000的介导下转染siRNA IRAK1以及阴性对照,正常培养的细胞作为对照,蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后Caski细胞中IRAK1蛋白的表达量;噻唑蓝(MTT)检测细胞的增殖活性;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞的凋亡;Transwell以及黏附实验检测细胞的侵袭、黏附能力;荧光定量PCR检测细胞中IRAK1 mRNA以及核因子-κB(NF-κB)mRNA水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化因子蛋白-1(MCP-1)水平。结果转染siRNA IRAK1显著降低细胞中IRAK1的表达量;下调IRAK1能抑制宫颈癌Caski细胞的增殖(P0.05),诱导其凋亡,降低细胞的侵袭、黏附能力,抑制NF-κB mRNA以及TNF-α、MCP-1水平。结论下调IRAK1可能通过调控NF-κB信号通路抑制宫颈癌Caski细胞的恶性生物学特性,从而抑制宫颈癌细胞的生长。     

冬凌草甲素通过上调miR-204-5p抑制PC-3细胞迁移与侵袭的作用机制研究

目的 探索冬凌草甲素影响PC-3细胞迁移及侵袭的作用及机制,为冬凌草甲素治疗前列腺癌骨转移提供前期体外实验参考。 方法 通过CCK8检测冬凌草甲素对PC-3细胞增殖的影响,Transwell检测冬凌草甲素对PC-3细胞迁移和侵袭的影响,qRT-PCR分析冬凌草甲素溶液处理PC-3细胞后miR-204-5p及NF-κB信号通路表达情况,Western blotting分析冬凌草甲素溶液处理PC-3细胞后NF-κB信号通路蛋白表达情况。 结果 冬凌草甲素溶液以浓度依赖性和时间依赖性方式抑制PC-3细胞的增殖,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）,冬凌草甲素IC50值为10 μmol/L;冬凌草甲素溶液呈浓度依赖性抑制PC-3细胞的迁移和侵袭,差异较对照组有统计学意义（P<0.01）;冬凌草甲素溶液能促进PC-3细胞表达miR-204-5p并阻断NF-κB信号通路下游基因表达;过表达miR-204-5p和冬凌草甲素均能抑制PC-3细胞NF-κB信号通路下游基因表达。 结论 冬凌草甲素能抑制PC-3细胞的增殖、迁移及侵袭,其作用机制可能与其能上调miR-204-5p阻断NF-κB信号通路有关。     

靶向核因子κB p65siRNA促人血管内皮细胞EAhy926的凋亡

背景:作者前期工作已经证实,子宫内膜异位症患者的在位、异位内膜中核因子κBmRNA和蛋白均表达升高,核因子κB参与了子宫内膜异位症细胞黏附、侵袭和血管形成的病理过程。目的:观察RNA干扰技术(RNAi)靶向抑制核因子κB p65基因对人血管内皮细胞(EAhy926)增殖的影响。方法:10μg/L血管内皮生长因子刺激下培养EAhy926细胞,给予转染核因子κB p65 siRNA,同时设立对照组,分别是阴性对照siRNA转染组、空白脂质体组及正常对照组(不给予其他任何处理),48h后分别采用Heochst 33342荧光检测法、MTT法及流式细胞仪术检测细胞的增殖抑制与凋亡情况。结果与结论:与正常对照组比较,核因子κB p65 siRNA组的细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均明显升高(P0.05);而阴性对照siRNA转染组及空白脂质体组的细胞增殖抑制率及细胞凋亡率则差异无显著意义。结果证实,核因子κB p65 siRNA能显著抑制人血管内皮细胞增殖,促进内皮细胞的凋亡发生。     

TNFAIP3 siRNA对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-LY1细胞NF-κB活性及增殖的影响

目的探讨A20(TNFAIP3)基因对弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)细胞生长的影响及其与细胞内核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化的关系。方法采用RNA干扰技术沉默A20,设计3条针对人A20mRNA的siRNA序列,经过lipofectamine RNAiMAX转染至OCI-LY1细胞(DLBCL细胞),用RT-PCR技术检测转染后OCI-LY1细胞内A20 mRNA的表达,用Western blot法检测A20和NF-κB(p65)蛋白的表达。用MTT法检测A20基因沉默后OCI-LY1细胞体外生长活力变化。结果 (1)siRNA转染组A20 mRNA及编码蛋白表达较未转染组及阴性对照组明显降低(P0.05);(2)转染组p65蛋白的表达较未转染组和阴性对照组明显增高(P0.05);(3)转染组细胞较未转染组、阴性对照组的OCI-LY1细胞体外生长活力明显增强。三组siRNA序列中siRNA-2序列干扰效果最明显。结论 DLBCL细胞中A20基因沉默会导致NF-κB活性增强,从而增强淋巴瘤细胞的生长活力。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κB p65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景.利用阳离子脂质体LipofectamineTM000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达,Westem blot检测细胞内NF-κB p65蛋白水平.同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用.结果显示在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κB p65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κB p65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κB p65的表达也明显受到抑制.说明RNAi技术可以抑制NF-κB p65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法.     

骨膜蛋白siRNA转染抑制ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞系损伤

目的探讨骨膜蛋白(Postn)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人主动脉内皮细胞系(HAECs)损伤的影响及其作用机制。方法将HAECs随机分为4组:对照组、ox-LDL组、Postn siRNA组和negative siRNA组。RT-q PCR检测mRNA水平;Western blot检测蛋白表达;MTT检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;EMSA检测NF-κB的DNA结合能力。结果与对照组相比,ox-LDL组Postn的mRNA和蛋白水平显著提高(P0.05);细胞增殖能力降低(P0.05);细胞凋亡率升高(P0.05);VCAM1、ICAM1、E-selectin、IL-1β、IL-6、TNF-α、p65和p-IκB-α的蛋白表达水平显著上调(P0.05),且NF-κB的DNA结合能力提高(P0.05),Postn siRNA转染能够逆转以上结果。结论 Postn siRNA转染能够抑制ox-LDL诱导的内皮细胞损伤,这可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

siRNA沉默染色质解旋酶DNA结合蛋白1对卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的:探究siRNA沉默染色质解旋酶DNA结合蛋白1(CHD1L)对卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移及相关分子如核因子κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶(MMP)的影响。方法:将si-CHD1L、si-NC质粒转染至卵巢癌HO-8910PM细胞,命名为si-CHD1L组、si-NC组,以未经转染细胞作为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞CHD1L mRNA表达; CCK-8法检测细胞增殖抑制情况;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室系统检测细胞迁移、侵袭能力;蛋白免疫印迹(WB)检测NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达。结果:与对照组、si-NC组比较,si-CHD1L组细胞CHD1L mRNA表达降低(P0.05),细胞增殖抑制率升高,细胞迁移能力降低,迁移、侵袭数量降低(P0.05)。与对照组、si-NC组相比,si-CHD1L组NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P0.05)。结论:siRNA沉默CHD1L能够抑制卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移,并能抑制NF-κB、MMP蛋白的表达,为卵巢癌的靶向治疗提供一定的理论依据。     

TLR4通过NF-κB信号途径对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)小干扰RNA(siRNA)是否通过NF-κB信号途径下调Bcl-2而抑制宫颈癌细胞的增殖。方法:设计并合成针对TLR4基因的3条特异性siRNA)及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体LipofectamineTM2000转染细胞。通过半定量RT-PCR和Western印迹法分别检测转染前后He La细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达水平,Western印迹法检测p65及Bcl-2蛋白表达水平,MTT法和平板克隆检测细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期。结果:3条针对TLR4基因的siRNA均能抑制TLR4的mRNA和蛋白表达,其中TLR4-siRNA-003的沉默效率最高。转染TLR4-siRNA-003 48 h后细胞中TLR4的mRNA和蛋白表达水平分别下调62%和89%,p65及Bcl-2蛋白水平明显下调,同时细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率显著升高,细胞周期被阻滞于G1期。结论:TLR4特异性siRNA能够有效沉默TLR4基因表达,并通过NF-κB信号通路下调Bcl-2而显著抑制宫颈癌He La细胞的增殖。TLR4可能成为治疗宫颈癌的一个新靶点。     

下调Notch3对小鼠T淋巴细胞体外活化增殖及NF-κB的影响

研究siRNA下调Notch3对小鼠T淋巴细胞体外增殖的影响,并初步探讨其免疫调节机制。从小鼠脾脏分离制备T淋巴细胞悬液;将化学合成的靶向Notch3基因的siRNA在Lipofectamine 2000介导下转染小鼠淋巴细胞;通过Westernblot检测各组细胞中Notch3蛋白水平的变化;以不同浓度的Notch3 siRNA作用于该小鼠T淋巴细胞模型,流式细胞术检测CD3~+T细胞早期活化标志CD69分子的表达;MTT检测Notch3-siRNA对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用;EMSA检测NF-κB活性。在淋巴细胞体外培养试验中,转染Notch3 siRNA可以明显降低小鼠淋巴细胞内Notch3的表达,下调Notch3可以显著抑制刀豆蛋白A(ConA)诱导的T细胞CD69的表达;同时下调Notch3对小鼠淋巴细胞的增殖有抑制作用;而且发现下调Notch3能明显抑制ConA诱导的NF-κB活化。实验结果提示,下调Notch3信号可通过抑制NF-κB活化对小鼠T淋巴细胞活化与增殖发挥抑制作用。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κBp65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景。利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κBp65的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)转染入小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κBp65mRNA表达,Westernblot检测细胞内NF-κBp65蛋白水平。同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用。结果显示:在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κBp65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κBp65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κBp65的表达也明显受到抑制。说明RNAi技术可以抑制NF-κBp65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法。     

乙型肝炎病毒X蛋白通过激活ERKs和NF-κB上调大鼠系膜细胞表达TNF-α

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因转染大鼠系膜细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)高表达的细胞外蛋白调节激酶(ERKs)、核因子κB(NF-κB)、P38 MAPK信号传导机制.方法 将含有HBV X基因的质粒pCI-neo-X导入体外培养的大鼠系膜细胞,分别采用特异性抑制剂U0126阻断ERK1/2通路,Lactacystin阻断NF-κB通路和SB203580阻断P38 MAPK通路,观察培养细胞TNF-α及其mRNA表达,以不加抑制剂作为对照.RT-PCR检测TNF-α mRNA表达,ELISA检测培养上清液中TNF-α表达.Western blot检测乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达.结果 转染pCI-neo-X后,系膜细胞TNF-α mRNA及上清液TNF-α表达均增高,通过阻断ERK1/2或NF-κB通路,细胞TNF-α mRNA及上清液TNF-α表达均下降.而阻断P38 MAPK通路对系膜细胞TNF-α mRNA及上清液TNF-α表达无明显影响.结论 HBx蛋白通过激活ERKs和NF-κB信号通路使系膜细胞高表达TNF-α,而与P38 MAPK通路无关.     

长春新碱降低由转染A20 siRNA促进的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系增殖

目的研究A20小分子干扰RNA片段(siRNA)对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞(OCI-LY1)增殖和多药耐药基因(MDR1)表达的影响。方法分对照组、转染组、长春新碱干预组(VCR)组和转染+VCR组。用脂质体转染法将A20 siRNA转入OCI-LY1细胞,MTT法检测细胞对VCR的敏感性;流式细胞计量术检测细胞凋亡;用real-time PCR检测A20及MDR1 mRNA;用Western blot检测细胞内A20、Pgp蛋白及核蛋白NF-κB的表达。结果 1)A20 siRNA转染后,细胞增殖能力增强(P0.05),VCR刺激后转染细胞的增殖曲线下降缓慢。2)转染细胞凋亡率明显低于对照组,VCR刺激24 h后OCI-LY1细胞凋亡率较加药前明显增加(P0.05),VCR组凋亡率比转染+VCR组增高的幅度大(P0.05)。3)转染后,A20 mRNA及蛋白表达明显降低(P0.001),NF-κB蛋白(P0.001)、MDR1mRNA(P0.001)和Pgp(P0.001)表达都明显增高;但MDR1 mRNA和Pgp在药物刺激后表达降低(P0.05),且VCR组较转染+VCR组降低的幅度大(P0.01)。结论 A20 siRNA能有效的增强OCI-LY1细胞内NF-κB的表达,使得MDR1基因及编码蛋白Pgp蛋白增强,从而抑制细胞凋亡、促进细胞增殖;VCR刺激后细胞内MDR1 mRNA和Pgp的表达明显降低,A20 siRNA则减弱了VCR的这一作用。     

VEGF-DsiRNA干扰对人结肠癌细胞增殖及侵袭能力的影响

目的利用人血管内皮生长因子-D(vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D)小RNA干扰(siRNA),研究VEGF-D表达下调对人结肠癌细胞增殖和侵袭的影响。方法设立3个细胞组:未处理的人结肠癌SW480细胞作为空白对照组,转染阴性对照siRNA的SW480细胞作为阴性对照组,转染VEGF-D siRNA的SW480细胞作为实验组。RT-PCR和Western-blot检测转染后SW480细胞VEGF-D基因和蛋白的表达,MTT法检测VEGF-D RNA干扰对结肠癌细胞增殖的影响,Transwell小室实验检测VEGF-D RNA干扰对结肠癌细胞侵袭的影响。结果 VEGF-D siRNA转染人结肠癌细胞SW480,VEGF-D基因和蛋白水平表达量明显低于对照组,MTT实验显示体外细胞存活率下降,Transwell小室中穿膜细胞数减少。结论 VEGF-D siRNA显著抑制结肠癌细胞SW480中VEGFD的基因和蛋白表达,明显抑制SW480细胞的体外增殖和侵袭能力。     

RNA干扰ATF5基因下调NF-κB信号诱导脑胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨RNA干扰转录激活因子5(ATF5)基因表达对脑胶质瘤细胞活力、凋亡率及NF-κB信号通路的影响。方法:将设计合成的ATF5特异性siRNA(siATF5组)和阴性对照siRNA(NC组)分别转染人脑胶质瘤U251细胞,采用NF-κB信号通路抑制剂PDTC处理细胞,MTT法、流式细胞术及Western blot法分别检测细胞活力、凋亡率及ATF5、血管内皮生长因子(VEGF)、环氧化酶2(COX-2)、 p-p65、p-IκB和Bax的蛋白水平。结果:转染siATF5的U251细胞中ATF5的蛋白表达显著低于空白对照组(P0.05)。与空白对照组比较,siATF5组细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,VEGF、COX-2、 p-p65和p-IκB的蛋白水平明显降低,Bax的蛋白水平明显升高(P0.05)。与siATF5组相比,siATF5和PDTC同时处理的U251细胞活力显著降低,凋亡率显著升高(P0.05)。结论:下调ATF5基因表达可降低脑胶质瘤细胞的活力,诱导细胞凋亡,降低免疫抑制因子VEGF和COX-2表达,其机制可能与下调NF-κB信号通路有关。     

TRAF6基因对宫颈癌细胞体外生物学行为的影响及其相关机制

目的:探讨肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因对于宫颈癌细胞生长、增殖、凋亡及浸润转移等生物学行为的影响,为将来人宫颈癌的生物治疗提供实验依据.方法:采用Western印迹方法检测TRAF6在宫颈癌细胞系(Hela,SiHa,CaSki和C33A)中的表达,构建TRAF6-shRNA干扰表达载体并转染人宫颈癌Hela细胞,而后使用MTT法、流式细胞仪分析法、Transwell侵袭小室实验法等方法分析TRAF6对Hela细胞活力、周期、凋亡以及迁移等生物学行为的影响,同时检测TRAF6对其靶基因NF-κB表达的影响,以及Cyclin D1,easpase 3和MMP-9等蛋白影响.结果:TRAF6在宫颈癌细胞系(Hela,SiHa,CaSki及C33A)中高表达,TRAF6 shRNA转染组Hela细胞的活力、增殖能力以及迁移能力明显低于阴性对照组和空白对照组Hela细胞(P＜0.05),TRAF6 shRNA转染组发生凋亡的Hela细胞所占比例明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05),阴性对照组和空白对照组Hela细胞的活力、增殖能力、凋亡情况以及迁移能力无明显差异;TRAF6 shRNA转染组Hela细胞中NF-κB,Cyclin D1和MMP-9蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05),caspase 3蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05),NF-κB,Cyclin D1,caspase 3和MMP-9在阴性对照组和空白对照组表达没有明显变化.结论:TRAF6基因可能具有促进Hela细胞生长增殖及其侵袭迁移能力,抑制Hela细胞凋亡的作用,TRAF6基因的表达下调可能与人宫颈癌Hela细胞迁移能力下降、凋亡能力增加有关.     

RNA干扰对宫颈癌细胞中E6AP基因的影响及其意义

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对宫颈癌细胞系HeLa细胞E6AP基因表达及细胞增殖和凋亡的影响.方法 实验分为3组:空白对照组(未经转染的HeLa细胞)、转染阴性对照的小干扰RNA(siRNA)组及转染特异性E6AP siRNA组.采用半定量RT-PCR技术、Western blot方法 检测E6AP mRNA、蛋白表达水平,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖状况,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染E6AP siRNA 24、48、72 h后,E6AP siRNA组E6AP mRNA表达水平与对照siRNA组比较下降33%、72%、70%.Western blot结果 显示,在转染48及72 h,E6AP蛋白表达下降38%、59%.MTT法检测显示,转染HeLa细胞24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低,E6AP siRNA组与空白对照组(F=101.38,P＜0.05)、对照siRNA组(F=38.64,P＜0.05)比较,差异均有统计学意义.E6AP siRNA作用24、48、72 h后E6AP siRNA组凋亡率明显高于对照siRNA组(F=41.48,P＜0.05)和空白对照组(F=86.36,P＜0.05),差异有统计学意义.结论 体外合成的siRNA能有效封闭宫颈癌细胞中E6AP基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据.     

南蛇藤醇抑制宫颈癌细胞生物学行为的机制研究

目的　探讨南蛇藤醇抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭的作用机制。 方法　将正常培养HeLa细胞分为对照组、南蛇藤醇低、中、高剂量组（终浓度分别为4 μmol/L、8 μmol/L和12 μmol/L）、阳性对照组（顺铂,终浓度为10 μmol/L）、LY294002组（LY294002,终浓度为20 μmol/L）和（南蛇藤醇+LY294002）组（南蛇藤醇和LY294002,终浓度分别为12 μmol/L和20 μmol/L）。MTT法检测各组细胞存活情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Transwell检测细胞的侵袭;蛋白质印迹法检测PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达;采用皮下注射HeLa细胞建立裸鼠模型,观察南蛇藤醇（120 mg/kg）对裸鼠移植瘤体积和重量的影响。 结果　与对照组相比,南蛇藤醇组、阳性对照组和LY294002组HeLa细胞的相对增殖率、侵袭细胞数均明显下降（P<0.001）,细胞凋亡率明显升高（P<0.001）,p-PI3K、p-AKT、NF-κB p65蛋白表达明显下调（P<0.001）,且随着南蛇藤醇浓度升高,其作用增强;与LY294002组相比,（南蛇藤醇+LY294002）组HeLa细胞的相对增殖率和侵袭细胞数明显下降（q=10.182,q=10.217,P均<0.001）,细胞凋亡率明显升高（q=23.636,P<0.001）;与对照组相比,南蛇藤醇组裸鼠体重、移植瘤的体积和重量明显下降（q=4.100,P<0.020;q=13.501,P<0.001;q=5.078,P=0.005）。 结论　南蛇藤醇可能通过抑制HeLa细胞的PI3K/Akt/NF-κB信号通路,抑制其恶性生物学行为。