受体酪氨酸激酶EphA1的研究进展

EphA1基因是受体酪氨酸激酶Eph家族中第一个成员,不仅参与胚胎发育和血管生成,而且在正常成人组织中也广泛表达。其独特的受体和配体复合物的结构特点和信号转导模式,使其在肿瘤发生、发展和转移中的作用日益受到重视。在不同器官、不同组织类型的肿瘤,甚至在同一种肿瘤发展的不同阶段,EphA1基因表达状况也有很大差异,提示该基因功能的多元性。深入研究EphA1在血管生成和肿瘤发生、发展和转移中的作用,有可能为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的靶点。     

表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的表达、纯化及活性测定

目的:采用原核表达体系对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)受体型酪氨酸激酶(recep-tor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达、纯化及活性鉴定.方法:以包含EGFR cDNA的pRK5质粒为模板,PCR选择扩增编码EGFR-RTK的cDNA片段,插入pQE30质粒后转染大肠杆菌M15.IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体蛋白经复性后亲和层析法纯化,ELISA方法测定蛋白活性.结果:成功地将933 bp的EGFR-RTK cDNA片段插入载体pQE30中,构建了表达载体pQE30-RTK.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为37 000的EGFR-RTK融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的65.2%.复性、纯化后的EGFR-RTK蛋白经ELISA检测,结果发现随着加入蛋白量的增加,酶促反应产物磷酸化酪氨酸的量也逐渐增加,两者具有线性关系.结论:本实验成功地利用原核表达系统表达了具有生物学活性的EGFR-RTK,较传统的昆虫细胞表达系统更为简便、经济.     

鼠PS1-GFP融合蛋白表达载体的构建研究

Presenilin1(PS1)的突变是早发家族性老年痴呆发生的重要因素之一。目前对于PS1结构和功能的研究表明,PS1作为一种多次跨膜并具有γ-secretase活性的蛋白酶,很可能参与众多的细胞信号传导通路,影响细胞分化和调亡、组织及个体的发育等等。但对于PS1的精细结构和功能目前了解甚少,为探讨PS1的精细结构和功能,本研究构建了鼠PS1-GFP融合蛋白表达载体。方法:我们设计了扩增PS1的cDNA全长的引物,以C57BL/6小鼠9天胚的RNA为模板,利用RT-PCR的方法从C57BL/6小鼠9天胚中获得PS1的cDNA,经测序确认后,将其克隆到pMD18-TVector中。设计引物:上游5’-GCCGAATTCTATGACAGAGATACCTGCACC-3’;下游5’-GAAGGATCCGATATAAAACTGATGGAATGC-3’,上游含有EcoRI酶切位点,下游含有BamHI酶切位点。利用高保真DNA聚合酶通过PCR方法将pMD18-T-PS1质粒中的PS1基因亚克隆到pEGFP-C1载体中,获得pEGFP-C1-PS1融合蛋白表达载体,然后利用EcoRI和BamHI从pEGFP-C1-PS1融合蛋白中切下PS1基因,从pMD18-T-PS1质粒中切下载体部分,经过连接,获得中间载体,利用该重组载体中的EcoRI和SalI酶切位点,酶切连接入pEGFP-N2载体中,获得pEGFP-N2-PS1融合蛋白表达载体,经测序鉴定后备用。     

GRα-GST融合表达载体的构建及重组蛋白的表达

[目的]构建GRα-GST融合表达载体并获得重组蛋白,以期为筛选类糖皮质激素样中药提供工具.[方法]运用RT-PCR扩增得到包含CDS的GRα基因序列后,经T-A克隆插入PMD-18载体.以此重组载体为模板扩增含有BamH I与Xho I酶切位点的GRαORF,插入pGEX-4T-1载体后形成了重组载体,并使其在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达融合蛋白,再用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达.[结果]成功的将GRα-全基因构建入原核表达载体pGEX-4T-1中.测序结果表明载体构建成功,无插入和移码突变.经IPTG诱导后获得与预测大小(112kDa)完全一致的目的蛋白即GRα-GST融合蛋白.[结论]成功获得了含重组载体的大肠杆菌,并在IPTG诱导下较好的表达,得到了GRα-GST融合蛋白.     

ARRB1融合蛋白表达载体ARRB1-EGFP的构建及其在神经胶质瘤细胞中的表达

目的 构建重组表达载体ARRB1-EGFP,在细胞中表达与鉴定,为进一步研究其功能奠定基础.方法 RT-PCR获得编码人ARRB1的全基因序列,克隆到真核表达载体pEGFPN1,构建重组表达载体ARRB1-EGFP,并转化于E.coli DH5 α中筛选阳性重组子,通过限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转染人HEK293细胞中表达,表达产物经Western blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光方法比较融合蛋白与内源性ARRB1在SNB19细胞的定位.结果 成功构建了ARRB1融合蛋白的真核表达载体,并经Western blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白与内源性ARRB1定位相似.结论 ARRB1-EGFP融合蛋白可以安全、高效地转导入HEK293以及SNB19细胞中.     

NY-ESO-1和热休克蛋白70融合基因的构建和原核表达

目的 构建热休克蛋白(HSP)70和肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1融合基因,并在大肠杆菌中诱导表达. 方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从人肝癌细胞株HepG2扩增HSP70基因,测序后插入pGEX-ESO1质粒中,构建NY-ESO-1与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-ESO1-HSP70,IPTG诱导含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)表达目的蛋白,Western blot 鉴定蛋白的特异性. 结果 扩增得到长度为1 917 bp的人HSP70全长基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致;获得pGEX-ESO1-HSP70融合基因原核表达质粒,经IPTG诱导,在BL21(DE3)中表达分子量约106 kD的融合蛋白(包括GST 26 kD,NY-ESO1 10 kD,HSP70 70 kD),Western blot检测该蛋白可与HSP70特异性结合. 结论 成功构建pGEX-ESO1-HSP70重组表达质粒,并获得高效表达的ESO1-HSP70融合蛋白,为HSP70-多肽疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础.     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

重组TRX-BNP融合蛋白的构建和表达

目的:构建人B型钠尿肽(BNP)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原TRX-BNP融合蛋白.方法:根据GenBank中检索到的人BNP成熟蛋白序列编码,设计合成编码BNP-32蛋白的DNA,并分别在5'端和3'端设计EcoR I和HindⅢ酶切位点,经聚合酶链反应(PCR)、构建重组质粒pET32a.BNP,并在BL21(DE3)经IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和层析制备TRX-BNP.通过DNA测序、融合蛋白的相对分子质量分析及Western印迹来鉴定TRX-BNP质粒及表达的BNP抗原的正确性.结果:DNA测序结果表明,所获得的BNP基因编码序列符合序列设计的要求,正确插入设计位点,重组质粒pET32a.BNP构建成功.IPTG诱导后SDS-PAGE电泳显示有特异性蛋白TRX-BNP表达,蛋白相对分子质量21 400,Ni-NTA亲和纯化,在UVP凝胶成像分析系统上作定量分析,BNP蛋白纯度达到95%.Western印迹结果证实TRX-BNP蛋白特异性表达.结论:成功制备TRX-BNP融合蛋白.     

pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建

目的 探索pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建.方法 在体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,将pTAT-XIAP质粒转化至DH5α.堵养筛选成功转化子,提取纯化质粒,电泳鉴定.结果 pTAT-XIAP质粒在含氨苄青霉素的LB固体培养基上呈分散菌落生长,在无氨苄青霉素的LB固体培养基上成片生长,未经质粒转化的DH5α感受态细胞在含氨苄青霉素的LB固体培养基上未见菌落生长.电泳结果 显示pTAT-XIAP质粒约4500bp,pTAT-HA质粒约3000 bp,条带大小与质粒图谱一致.结论 将大鼠XIAP基因插入PTAT-HA质粒,成功构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体.     

多囊蛋白1表达载体的构建及表达

目的：体我表达并纯化多囊蛋白1胞外区片段。方法：提取健康人肾组织总RNA，用一步法RT－PCR选择扩增编码多囊蛋白1胞外多拷贝区的2个cDNA片段，并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE30中，转染含有阻遏质粒pREP4的大肠杆菌M15。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白，用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。结果：克隆到2个编码多囊蛋白1胞外区的cDNA片段，其大小分别为502bp和471bp。构建的表达质粒pQE30-PKD1el和pQE-30-PKDle2经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为19800，189000的融合蛋白，经蛋白质印迹分析鉴定为多囊蛋白1的融合蛋白。结论：本实验克服了PKD1基因在体内多个同源序列的干扰，克隆了编码多囊蛋白1胞外多拷贝区的cDNA序列，并成功地获得了融合表达的目的蛋白，为进一步制备抗多囊蛋白1胞外区的抗体创造了条件。     

GST-Fank1融合蛋白表达载体构建及表达纯化的研究

 摘要 目的： 研究转录因子Fank1与GST融合蛋白原核表达载体的构建和表达。方法： 根据编码Fank1蛋白的DNA序列,经引物设计软件Primer Premier 5.0优化设计出上下游引物（Ⅰ,Ⅱ）,同时在5′端引入BamHⅠ酶切位点,3′端引入SalⅠ酶切位点。以pdsRED-Fank1质粒为模板进行PCR扩增Fank1目的片段,经限制性内切酶酶切后连接到原核表达载体pGEX4T-2, 构建成pGEX4T-2- Fank1原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导进行目的蛋白表达。 结果： 经菌液PCR、电泳分析及测序证明成功构建了Fank1融合表达载体,融合蛋白产物经蛋白印迹显示,相对分子量为44KD的蛋白条带,与预期一致。 结论： 成功构建了pGEX4T-2- Fank1原核表达载体,并在原核细胞中有表达,为进一步研究转录因子Fank1的功能奠定了基础。     

GST-HDAC4融合蛋白载体的构建及其蛋白表达

 目的构建人HDAC4蛋白与谷胱甘肽转移酶（GST）重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达和纯化。方法用Eco RI单酶切pcDNA3.1-HDAC4质粒,得到hHDAC4全长编码序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-5X-1构建成新载体GST-HDAC4,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21,通过异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并纯化获得目的蛋白。Western blot检测重组质粒的表达。结果酶切鉴定和测序结果显示, GST-HDAC4融合蛋白原核表达载体构建成功。考马斯亮蓝染色和Western blot结果显示,成功获得有生物活性的GST-HDAC4融合蛋白。结论成功构建了HDAC4原核表达载体,获得有生物活性的GST-HDAC4蛋白。     

IN-1重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的：设计并人工合成IN-1重组单链抗体（recombinant IN-1 single-chain antibody）的cDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。方法：根据gene bank中发表的IN-1抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段，该基因双链分35个小片段合成，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆载体pUC-18中，经全自动序列分析仪测序证实后，再亚克隆至表达载体pET-28a（ ），转化大肠杆菌BL21，诱导表达。结果：测序结果合成的基因序列与设计的仅差一个碱基；SDS-PAGE检测显示，表达出相对分子量31kd的融合蛋白。结论：IN-1重组单链抗体基因表达载体的构建和表达，为深入研究其生物活性奠定了基础。     

hPAK4基因重组质粒的构建及蛋白表达

 目的构建hPAK4真核表达载体,证实融合蛋白在细胞内表达,融合蛋白可以用于GST-pulldown实验。方法提取人乳腺癌细胞MCF-7mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有GST标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293中,提取细胞蛋白进行Western
      blot检测,同时进行GST-pulldown实验。结果hPAK4全长基因序列克隆到真核表达载体pEBG中,酶切鉴定片段为1800bp。Westernblot检测到融合蛋白GST-hPAK4的表达,分子量约为94kDa,融合蛋白能够被Glutathione
      Sepharose4B沉淀。结论成功构建了hPAK4全长基因真核表达载体,同时鉴定了GST-hPAK4融合蛋白的表达,并且能够被Glutathione
      Sepharose4B沉淀。     

Limk1不同突变体HA融合表达载体构建及在细胞内定位

目的：构建LIM激酶（Limk）1不同突变体的HA融合表达载体,并在真核细胞中表达,观察这些突变体在细胞内定位.方法：利用聚合酶链式反应（PCR）扩增Limk1全长序列,构建HA-Limk1真核表达质粒;利用定点突变策略对HA-Limk1进行核定位信号（NLS）缺失突变,命名为Limk1-NLS（del）;用合成两条互补序列退火获得目标片段插入载体的策略构建Limk1-NLS;将2表达质粒转染HepG2细胞,细胞免疫荧光方法以及核质分离后用western-blot检测其在细胞中定位.结果：经测序鉴定Limk1及其不同突变体序列正确,在HepG2细胞中高表达;其中HA-Limk1在细胞质、细胞核均有表达,Limk1-NLS （del）主要定位于细胞质,Limk1-NLS主要定位于细胞核.结论：成功构建了Limk1全长及不同突变体的HA融合表达载体,初步明确突变体在细胞内的定位.     

麦芽糖结合蛋白-微管驱动蛋白11删除型融合基因表达载体的构建及其蛋白表达

目的:构建删除型微管驱动蛋白(KIF)11与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白的原核表达载体,并纯化得到高纯度的MBP-删除型KIF11融合蛋白。方法:PCR法从全长的KIF11基因组中扩增KIF11的相关删除型基因并连接到原核表达载体pMal中,此载体包含一个表达MBP的基因,删除型KIF11片段插入后与其融合,筛选和测序鉴定阳性克隆。将重组质粒转化到Rosseta大肠杆菌中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达和亲和层析分离纯化表达产物,对纯化的蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹杂交(Western blot)鉴定。结果:成功扩增删除型KIF11基因,构建MBP-KIF11-head,-stalk和-tail重组质粒并在Rosseta中诱导表达出MBP-KIF11-head,-stalk,-tail融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot法验证了高纯度纯化的融合蛋白。结论:建立了高效稳定的MBP-KIF11表达体系,为进一步研究KIF11与mRNA调控蛋白锌指结合蛋白1相互作用的区域打下基础。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体构建及表达的实验研究

目的 研究改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达.方法 首先通过基因拼接法合成VP3基因并委托生物技术公司合成改良型TAT基因.然后于原核表达载体pGEX-6p-1上构建改良型TAT-VP3融合蛋白的基因.最后将构建好的原核表达载体转导入基因工程菌DH-5α中并诱导其表达.结果 成功合成了VP3基因,构建了改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达载体,并经基因测序证明构建无误;成功的在基因工程菌DH-5α中诱导了改良型TAT-VP3融合蛋白的表达.结论 改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达是可行的,为进一步的蛋白制备及活性研究打下了基础.     

改良型TAT-VP3融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的表达改良型TAT-VP3融合蛋白,并对其进行纯化.方法利用IPTG温控诱导改良型TAT-VP3融合蛋白表达,并经GST亲和层析纯化,目的蛋白进行SDS-PAGE和Western bolt鉴定.结果改良型TAT-VP3融合蛋白经温控诱导后得到稳定表达,经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量42 kD的特异性目的条带,经GST亲和层析纯化后,得到了纯度较高的目的蛋白.Western bolt验证了表达蛋白的特异性.结论已成功表达及纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,为进一步研究其免疫原性和抗肿瘤活性奠定了基础.     

GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

 目的构建GST-LMO1 融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌（Ecoli ）中诱导表达。方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA 序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代茁-D 半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE 和Western blot 鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot 方法证实了GST-LMO1 全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了LMO1 全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1 结构与功能的研究提供了前提基础。