一种新的干扰素调节因子拼接异构体IRF-3b的结构及功能

目的　干扰素调节因子 (interferonregulatoryfactors ,IRF) 3是病毒感染后调节干扰素基因转录重要的转录因子 ,寻找IRF 3新的基因拼接异构体 ,研究其结构及功能。方法　抽提人类细胞RNA ,用IRF 3已发表序列设计引物 ,作cDNA末端快速放大 (RACE)及RT PCR ,生物信息学方法比较新序列 ,亚克隆IRF 3b至 pcDNA3.1 flag ,转染人胚胎肾上皮 2 93细胞 ,用抗flag抗体作Westernblot分析 ,用荧光素酶功能分析的方法观测IRF 3b对病毒诱导的干扰素 β启动子荧光素酶活性的影响。结果　发现了一种新的IRF 3拼接异构体IRF 3b ,IRF 3b用了紧接第七外显子前的 1 6个第六内含子的碱基 ,导致阅读框架移位 ,相应蛋白质的C端第 32 8～ 4 52位为不同于IRF 3的新C末端。Westernblot出现预期的相对分子质量 (Mr)为 57.75× 1 0 3的IRF 3b蛋白强阳性条带。新的外显子序列可在小鼠的表达序列标签 (EST)表达库中找到同源序列 ,提示这种新的异构体在生物演进中有其保守功能 ,IRF 3b荧光素酶功能分析显示 ,该同分异构体能抑制病毒诱导的干扰素 β启动子活性至对照组的 4 0 %～ 50 %。结论　新的异构体的发现为IRF 3这一重要分子的功能调节提供了新的线索 ,它可能是病毒感染通路中干扰素的显性负性抑制剂 ,提示其功能为干扰素产生的     

磷酸酶PP2CB 抑制RNA 病毒VSV 或SeV 介导的天然免疫应答

目的:研究蛋白磷酸酶PP2CB 在抗RNA 病毒天然免疫应答中的调控作用及其机制。方法:在小鼠腹腔巨噬 细胞中转染PP2CB 的特异siRNA,干扰其表达后通过Q-PCR 和ELISA 观察RNA 病毒诱导的玉型干扰素的产生变化、病毒在 细胞内的复制变化,Western blot 检测TBK1 和IRF3 的磷酸化水平的改变。结果:VSV 感染诱导巨噬细胞中PP2CB 的表达发 生显著改变。过表达PP2CB 抑制HEK293 细胞中IFN-β的转录活化。干扰PP2CB 表达显著升高RNA 病毒VSV 或SeV 诱导 的Ⅰ型干扰素的mRNA 和蛋白表达水平,并抑制VSV 复制。此外,RNA 病毒诱导PP2CB 和TBK1 结合。干扰PP2CB 的表达 能够增强TBK1 和IRF3 的磷酸化。结论:RNA 病毒VSV 或SeV 使蛋白磷酸酶PP2CB 能够结合TBK1 并抑制其磷酸化,下调 玉型干扰素信号通路的活化,从而负向调控RNA 病毒VSV 或SeV 诱导的Ⅰ型干扰素的产生。     

METTL3抑制抗病毒先天免疫信号转导

目的 进一步探究甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like protein 3,METTL3）对抗病毒先天免疫信号转导过程的影响。方法 在HEK293T细胞中过表达以及敲低METTL3,利用不同的病毒感染细胞后,通过免疫印迹法检测Ⅰ型干扰素信号通路中上游激酶TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1, TBK1）以及下游转录因子干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3,IRF3）和核因子κB（NF-κB）p65亚基活化情况,水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）复制标志分子VSV-G表达水平。通过尾静脉注射VSV建立小鼠感染模型,观察Mettl3敲除小鼠(Mettl3^F/F;Mx1-Cre)和对照小鼠(Mettl3^F/F)生存率以及肝系数和肺系数的变化情况;通过ELISA检测小鼠血清Ⅰ型干扰素IFN-α和IFN-β的产生情况。结果 HEK293T细胞中过表达METTL3后TBK1、p65以及IRF3的磷酸化减弱,VSV-G...     

大鼠白细胞介素-6重组腺病毒构建及初步鉴定

目的构建携带大鼠白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)基因的重组腺病毒,为研究IL-6在神经损伤中的生物学作用提供技术手段。方法体外扩增大鼠IL-6基因,定向克隆到pAdTrace-TOX腺病毒穿梭质粒中,构建重组pAdTrace-IL-6过表达腺病毒质粒,并与骨架质粒pAd-Easy-1在BJ5183菌中发生同源重组,获得pAd-IL-6腺病毒载体,经PacⅠ酶切后转染HEK293细胞进行包装扩增。通过Ad-IL-6腺病毒感染PC12细胞,Real-time PCR和Western blot检测PC12细胞中IL-6及STAT3的表达。结果 PCR电泳及酶切、测序鉴定均证实目的基因IL-6正确克隆至腺病毒载体中,所构建的腺病毒Ad-IL-6可感染PC12细胞,有效增加IL-6的表达水平,促进IL-6信号通路中关键蛋白磷酸化STAT3的表达。结论成功构建携带IL-6的重组腺病毒载体,该载体可显著增高PC12细胞中IL-6基因和蛋白表达水平,并上调IL-6相关信号通路。     

多囊卵巢综合征患者骨骼肌氧化应激基因的识别及其转录因子的预测

目的 探究多囊卵巢综合征（PCOS）骨骼肌氧化应激差异基因,识别PCOS患者骨骼肌关键的氧化应激基因,并预测基因及转录因子调控网络。方法 以PCOS患者的骨骼肌为研究对象,筛选GEO数据库数据集GSE8157和GSE6798,通过R软件获得差异表达的氧化应激相关基因。然后对差异表达的基因进行基因（GO）富集分析、KEGG信号通路富集分析及转录因子的预测。结果 在26例PCOS患者和26例对照女性,共鉴定出7个氧化应激差异基因（PDX1、SLC1A1、SMPD3、PAWR、CHEK2、WRN、S100A8）及4个转录因子（NFKB1、STAT3、YY1、FOXC1）。GO和KEGG富集分析表明,有多个与氧化应激及其相关的富集术语,在IL-17信号通路,p53信号通路等KEGG通路富集。结论 我们鉴定出的7个PCOS骨骼肌潜在的氧化应激相关基因和4个转录因子,可能通过调节骨骼肌氧化应激在PCOS的发生发展中发挥重要作用。     

IRF3 shRNA腺病毒包装及其对RAW264.7细胞IRF3表达的抑制效应

目的重组并包装干扰素调节因子3(interferon regulator factor 3,IRF3)短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)腺病毒,研究该病毒对RAW264.7细胞IRF3基因表达及对细胞增殖活性和吞噬功能的影响。方法采用酶切和连接方法构建p Adeno-U6-CMV-EGFP-IRF3 sh RNA质粒;借助Ad MaxTM病毒包装系统完成IRF3基因干扰腺病毒的重组与包装;IRF3基因表达分别采用real-time PCR和Western blot分析方法检测;RAW264.7细胞的增殖活性和吞噬功能分别采用CCK8分析和吞墨试验检测。结果 IRF3基因的干扰片段及对照序列被正确插入p Adeno-U6-CMV-EGFP质粒AgeⅠ和Eco RⅠ酶切位点之间,经PCR扩增及DNA测序证实;RAW264.7细胞组成性表达IRF3基因,针对IRF3基因后部序列的干扰腺病毒Y2147明显抑制了IRF3 m RNA和蛋白质的表达,而针对IRF3基因前部及中部序列及对照序的干扰腺病毒对IRF3的表达无明显沉默或封闭效应;腺病毒Y2147对RAW264.7细胞的增殖活性及吞噬功能无明显不良影响。结论成功构建并包装了IRF3 sh RNA腺病毒,该病毒能有效抑制RAW264.7细胞IRF3 m RNA和蛋白表达,且对细胞的增殖活性和吞噬能力无不良影响。     

基于生物信息学方法鉴定艾滋病抗病毒治疗病毒学失败的关键基因

目的 探究HIV感染者接受高效抗逆转录病毒治疗失败后的外周血单核细胞基因表达差异和信号通路的表达情况.方法 从GEO数据库中下载了数据集GSE52900,进行差异化基因的筛选,并通过GO、KEGG和PPI等网络分析确定关键基因和重要生物学通路.结果 从高效抗病毒治疗失败的外周血单核细胞基因表达谱中按照P<0.05和|log2(FC)|>1筛选出79个表达差异化基因,包括55个表达上调基因和24个表达下调基因.PPI网络鉴定出5个关键基因:CD4、CCL5、CXCR4、ITGAL、C1 QB.结论 GO和KEGG分析发现差异化基因主要富集在免疫应答通路,提示免疫因素在抗病毒治疗中发挥了重要作用.     

NF-κB亚基p50在病毒诱导的IFN-β表达中的作用研究

目的探究核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)家族成员p50的缺失对不同类型病毒诱导的IFN-β(interferonbeta)表达的影响。方法建立小鼠病毒感染模型观察p50-/-小鼠(knockout,KO)和野生小鼠(wild type,WT)生存率;酶联免疫吸附法检测病毒感染后小鼠血清以及骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)上清IFN-β水平。免疫印迹检测IFN-β产生过程中重要转录因子干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)的表达和活化。结果致死剂量的病毒感染后,p50-/-小鼠和野生小鼠生存率没有差异;p50的缺失导致病毒感染后小鼠血清和BMDMs培养上清中IFN-β水平轻微降低,IRF7的诱导表达和IRF3的活化在病毒感染早期略有下降。结论 NF-κB家族成员p50促进病毒诱导的IFN-β表达,但作用较小。     

敲低肝癌细胞STAT3抑制IFN1诱导的HepG2肝癌细胞增殖和迁移

目的筛选并制备信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(STAT3 shRNA)慢病毒,感染Hep G2肝癌细胞抑制其STAT3表达,观察对1型干扰素(IFN1)诱导的肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法设计并合成4段人STAT3基因的干扰序列(STAT3 shRNA 1~STAT3 shRNA 4)以及对照序列(Ctrl shRNA),与p LKO.1-sp6-pgk-GFP连接构建慢病毒表达载体,随后与骨架质粒ps PAX2、p MD2.G共转染HEK293T细胞制备慢病毒并感染Hep G2细胞。Western blot法检测STAT3的蛋白水平,筛选有效序列。敲低STAT3水平后,CCK-8法检测Hep G2细胞的增殖,TranswellTM迁移和划痕实验检测Hep G2细胞的迁移。同时观察2000 U/m L重组人IFNα2b诱导的肝癌细胞增殖、迁移能力的变化,Western blot法检测IFN相关STAT1信号的磷酸化水平。结果筛选对STAT3敲低效果最显著的STAT3 shRNA1和STAT3 shRNA2,敲低STAT3水平后,肝癌细胞增殖和迁移降低。2000 U/m L IFNα2b对细胞的增殖抑制作用更显著,迁移细胞的数量显著下降。敲低STAT3水平后,肝癌细胞STAT1的磷酸化水平升高,在IFNα2b处理后STAT1磷酸化水平进一步升高。结论敲低肝癌细胞STAT3通过上调STAT1信号通路活化,抑制细胞的迁移、增殖,恢复IFN在肝癌细胞中的应答。     

接头蛋白STING介导信号通路在抗病毒感染中的研究进展

干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon gene,STING)是一种介导胞内DNA诱导固有免疫应答的重要接头蛋白,在机体抗病毒免疫反应中起关键作用。宿主细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别入侵病原体的DNA,将信号传递给STING,导致TANK连接激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)和干扰素调控因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)磷酸化,从而促进Ⅰ型IFN的上调表达,进而抑制病毒复制。文章介绍了STING分子的结构、转导通路以及分子调控机制,重点概述STING介导的信号通路在抗病毒感染中的作用以及病毒对该信号通路的调控机制,以期为抗病毒药物的研究提供新的靶点和思路。     

基于GEO数据库筛选川崎病的差异表达基因及通路的研究

目的 应用生物信息学方法分析与川崎病发病可能相关的基因及蛋白信号通路。方法 从综合基因表达数据库中下载川崎病基因表达数据集GSE18606和GSE68004。利用GEO2R工具对数据集进行预处理，筛选差异基因，将两者进行交集，得到差异表达基因（DEGs）。利用R软件富集分析DEGs的生物学功能和信号通路，利用STRING数据库和cytoscape软件构建并改进蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，在mirdip数据库中预测核心基因对应的靶miRNAs。结果 在GSE18606和GSE68004数据集中共筛选出269个DEGs;DEGs的生物学功能主要包括免疫反应、中性粒细胞活化、细胞因子产生的正向调控、免疫反应T细胞活化、分泌颗粒膜和葡萄糖结合免疫受体活性等；信号通路主要包括造血细胞系、白细胞内皮细胞迁移、Toll样受体信号通路、胰岛素信号通路和T细胞受体信号通路；PPI网络包含218个DEGs和674对互相作用关系，其中STAT3、FGR、IL7R、HOOK3、MAPK14、LILRB2、CD2、CSF3R、SOCS3、GZMA、H2AC20、GZMK、H2BC5、ITK共14个为网络中...     

儿童新诊断与慢性免疫性血小板减少症差异基因分析

目的筛选儿童新诊断与慢性免疫性血小板减少症(ITP)之间的差异表达基因(DEGs)并进行生物信息学分析。方法从基因表达数据库中下载芯片表达谱GSE46922数据集,利用BRB-ArrayTools软件鉴定DEGs,然后分别对差异基因进行基因本体(GO)功能富集分析、Pathway富集分析和互作网络分析。结果共筛选出1225个DEGs,其中上调基因665个,下调基因560个。GO富集分析发现DEGs主要参与转录调控、小分子代谢、蛋白泛素化、凋亡调控、固有免疫反应、病毒复制等生物学过程。Pathway富集分析发现DEGs显著富集于代谢通路、内质网蛋白加工、破骨细胞分化、MAPK信号通路、病毒感染、凋亡等。网络分析鉴定出的核心基因有CHD4、UQCR10、AP2M1、SIRPγ和GPR180,核心Pathways包括MAPK信号通路、细胞周期和细胞凋亡。结论明确了儿童新诊断与慢性ITP的基因表达谱不同,为进一步阐明儿童ITP发生发展的分子机制和指导早期治疗干预提供了基础。     

IL-28B基因多态性与丙型肝炎相关性研究进展

白细胞介素-28 B(Interleukin-28B,IL-28 B)属于Ⅲ型干扰素家族,是一种新型的白细胞介素.它通过活化JAK- STAT信号通路,调节干扰素刺激基因转录,发挥抗病毒等生物学效应.新近研究发现,IL-28B基因多态性与丙型病毒性肝炎的发病、抗病毒治疗应答和疾病转归等密切相关.因此,通过对二者相关性的研究,可能有助于临床医师更合理的选择丙型肝炎的治疗措施、开展个性化治疗、及早判断患者的预后.     

SARS-CoV的S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10的信号分子机制研究

目的：研究SARS冠状病毒S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10（interferon-gamma inducible protein 10）的信号分子机制。方法：通过基因芯片检测SARS冠状病毒的S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE后信号通路基因表达谱的变化；采纳RT-PCR、EMSA、Western blotting等方法进一步分析JAK-STAT通路中信号分子的磷酸化、IRF-1和IP-10基因表达的变化及其相应信号分子抑制剂对表达水平的影响。结果：S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE诱导了JAK-STAT信号通路涉及的重要转录因子基因IRF-1的表达，该信号通路的转录因子STAT1在刺激后15 min发生磷酸化，2 h即可检出IP-10基因的表达， IP-10的表达可以完全被STAT1、JAK2抑制剂阻断。EMSA显示：支气管上皮细胞在S蛋白的作用下，其核蛋白能够特异性与ISRE和GAS DNA基序相结合，而不能与NF-κB的 DNA基序相结合。结论： SARS－CoV的S蛋白通过激活JAK-STAT信号转导通路诱导IP-10在宿主细胞的生成。提示病毒诱导的JAK-STAT信号通路激活在病毒感染相关的急性肺损伤发生中具有重要地位。     

Pax5对B细胞分化发育调控作用的研究进展

转录因子Pax5在B细胞定向分化发育过程中发挥重要调控作用。B细胞定向分化发育相关的转录因子如PU.1、干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4,IRF4)、IRF8和NF-κB结合在Pax5基因5’上游增强子区,转录因子EBF、STAT5结合在Pax5基因5’上游启动子区,从而共同促进Pax5基因的表达。表达的Pax5蛋白不仅通过IgH的V(D)J片段染色质的甲基化和乙酰化修饰来调节IgH V(D)J重排,并且通过B细胞特异性基因(mb-1、VpreB、λ5、CD19、BLNK等)表达调控B细胞的定向分化发育。若Pax5基因缺失,影响组蛋白H3-K9的修饰,导致B细胞向非B细胞分化。总之,Pax5在B细胞定向分化发育中起到重要调控作用。     

干扰素调节因子在炎症性疾病中的作用

干扰素调节因子(IRF)家族是能对干扰素的基因表达进行调控的一类转录因子,参与炎症反应、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程.IRF4作为一种转录因子,通过影响淋巴细胞的分化及其分泌,干扰素转录调控,病原体免疫反应,细胞因子信号转导,细胞增殖调控,自稳平衡,先天性免疫调控和适应性免疫调控等方面来参与炎症的病理生理过程,成为新...     

长链非编码RNA(lncRNA)对巨噬细胞极化转录调控的研究进展

经典活化型巨噬细胞(M1型)和替代活化型巨噬细胞(M2型)是两种具有不同表型和功能的巨噬细胞亚群。巨噬细胞能响应微环境信号,迅速从一种极化状态转换到另一种极化状态。巨噬细胞极化受核因子κB(NF-κB)、信号转导子和转录激活子(STAT)、干扰素调节因子(IRF)等转录因子调控,进而参与多种炎症相关性疾病的发生发展。长链非编码RNA(lncRNA)可调控NF-κB抑制蛋白(IκB)磷酸化改变NF-κB核移位,或通过与p65/p50形成复合物抑制NF-κB与其靶基因启动子结合,进而调控巨噬细胞极性; lncRNA可直接调控Janus激酶2(JAK2)/STAT通路,或间接通过细胞因子信号传送阻抑物(SOCS)调控STAT表达参与巨噬细胞极化调控; lncRNA通过调控多梳抑制复合物2(PRC2)等间接影响IRF的转录,调控巨噬细胞极化。深入了解lncRNA对巨噬细胞极化转录调控的作用机制,有助于为这些疾病的诊断和治疗提供新的策略。     

干扰素相关基因芯片在预测干扰素治疗慢乙肝患者疗效中的应用探索

本文旨在筛选干扰素（IFN）治疗应答不同的慢性乙型肝炎（CHB）患者间IFN通路的差异表达基因，明确IFN疗效不佳的可能宿主因素，并探索干扰素功能分类基因芯片在预测干扰素治疗CHB患者疗效中的应用前景。从我院干扰素治疗队列中随机选取有应答CHB患者（Rs）、无应答CHB患者（NRs）各3例，在健康体检者中招募受试者3例，利用IFN功能分类基因芯片检测Peg-IFN-α 2a治疗前后CHB患者及健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）中IFN相关基因的表达水平。结果发现，与IFN治疗前相比，治疗后Rs组IFN通路相关的差异表达基因数量多于NRs组。与健康对照者相比，Rs和NRs在治疗前的IFNG、IL7R、IRF1和IRF8均下调；CXCL10、IFIT1、IFITM1在Rs中上调；IL13RA1和IFI35在NRs中上调，IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1和ADAR在NRs中下调。Rs组与NRs组相比，IL15、IFI35和IFI44分子的表达分别下调4.09(t=10.58,P <0.001)、5.59(t=3.37,P=0.028)和10.8...     

靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人转录因子STAT3基因的shRNA慢病毒载体.方法:设计合成针对人STAT3基因的shRNA序列,运用基因重组技术将其插入到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pSicoR中,构建shRNA重组质粒pSicoR-STAT3-shRNA.经双酶切及DNA测序鉴定后,利用转染试剂X-tremeGENE HP将第3代慢病毒载体共转染至HEK293细胞进行病毒包装.以阴性载体为对照,用RT-PCR和Western blot分别检测STAT3基因和蛋白表达水平.结果:双酶切及测序证实载体构建正确,在HEK293中成功包装出高滴度慢病毒颗粒,感染HEK293后STAT3基因表达和蛋白质表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体.     

脂多糖刺激干扰素调节因子3促进小鼠腹腔巨噬细胞白介素-17表达

目的：探讨干扰素调节因子3（IRF3）对脂多糖（LPS）刺激小鼠腹腔巨噬细胞促进白细胞介素-17（IL-17） 表达的初步作用机制。方法：小鼠腹腔注射3%巯基乙酸肉汤,3 d 后提取C57BL/6 野生和IRF3 基因敲除小鼠的 腹腔巨噬细胞,培养过夜后添加LPS。收集细胞培养上清液,酶联免疫吸附试验检测细胞因子IL-17 和白细胞介素-6 （IL-6）的表达;提取细胞蛋白质,免疫印迹检测细胞核因子κB抑制蛋白（IκB）α、IRF3、磷酸化信号转导子和 转录激活子3（STAT3）的蛋白水平。结果：LPS 刺激小鼠腹腔巨噬细胞后,IRF3 可显著地促进IL-17 的产生,同 时伴随着IL-6 的产生、IκBα 蛋白的降解及STAT3 的磷酸化。结论：IRF3 可能通过促进IL-6 的产生,间接地激活 STAT3 的磷酸化,进而促进IL-17 的产生。