孕激素受体B亚型在子宫内膜癌细胞中的功能

目的:通过反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)技术特异性下调子宫内膜癌细胞系中孕激素受体亚型B(progestrone receptor isoform B, PR-B),在此基础上观察激素对转染前后细胞作用的改变,了解子宫内膜癌细胞中孕激素受体亚型功能的不同.方法:体外培养高分化子宫内膜癌细胞Ishikawa和中分化子宫内膜癌细胞Hec-1B, 转染PR-B的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸及错义寡核苷酸后,提取细胞蛋白,采用Western blot 方法测定各个条件下内膜癌细胞中两种孕激素受体亚型的表达;并在转染PR-B的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸及错义寡核苷酸后,用MTT法测定转染前后各种激素对细胞生长作用的改变.结果:转染孕激素受体亚型PR-B的反义寡核苷酸后, 两种细胞系PR-B的表达较非转染组显著下调,孕激素受体亚型A(progesterone receptor isoform A,PR-A)的表达无明显变化.雌激素(17β-estradiol,E2)作用后72 h Ishikawa细胞生长显著高于对照组,Hec-1B细胞较对照组有升高趋势,但差异无统计学意义.孕激素(R5020)作用72 h后对Ishikawa细胞有显著抑制作用,96 h后对Hec-1B细胞有显著抑制作用.在雌、孕激素作用基础上加入米非司酮(mifepristone,RU486),96 h后Ishikawa细胞明显增生,而仅48 h后HEC-1B细胞明显增生.转染PR-B的反义寡核苷酸后,雌激素对内膜癌细胞生长的刺激作用较转染前增强 ,孕激素对细胞的生长抑制作用减弱甚至消失,米非司酮拮抗孕激素的作用较转染前显著降低. 结论:(1)向子宫内膜癌细胞系中转染PR-B的反义寡核苷酸可以下调PR-B的表达,使细胞优势表达PR-A;(2)雌激素可以刺激内膜癌细胞的生长,PR-B可能参与下调雌激素对内膜癌细胞的促生长作用;(3)孕激素在雌激素基础上抑制内膜癌细胞的生长,主要可能通过PR-B起抗内膜癌细胞增生作用;(4)米非司酮有拮抗孕激素抑制子宫内膜癌细胞生长的作用.PR-B可能参与介导了米非司酮拮抗孕激素的作用.     

PRA、PRB在子宫内膜癌孕激素治疗耐药机制中发生的分布及活性状态变化研究

目的：探究子宫内膜癌组织中的孕激素受体PRA（孕激素受体亚型A）、PRB（孕激素受体亚型B）的分布以及表达情况,并分析其意义。方法选取2011－01～2015－01间于我院接受治疗80例子宫内膜癌患者,作为观察组。另选取同期来我院体检的80例正常人作为对照组。观察两组患者子宫内膜癌组织中孕激素受体PRA、PRB受体的表达情况。另应用免疫细胞化学法观察耐药细胞与母代Ishikawa细胞的PR表达情况。结果观察子宫内膜癌患者PRA、PRB表达情况与临床病理资料的关系,结果发现PRA的表达与子宫内膜癌分化程度有关,PRB的表达与子宫内膜癌分化程度、淋巴结转移以及FIGO分期有关。观察组患者PRA蛋白、PRB蛋白、PRmRNA（孕激素受体信使RNA）均显著小于对照组,差异有统计学意义,P＜0.05。 PRA／PRB、PRBmR-NA（孕激素受体亚型B mRNA）无明显差异;耐药细胞PRB阳性表达率显著低于母代Ishikawa细胞,差异有统计学意义,P＜0.05。而PR 阳性表达率则无明显改变。结论 PRB表达的下降以及TGFɑ－EGFR（转化生长因子α－表皮生长因子受体）信号通路活性的增强可能参与了子宫内膜癌孕激素耐药的发生。     

子宫肌瘤孕激素受体A、B亚型的表达

目的 :探讨两种孕激素受体亚型 (hPR A和hPR B)在子宫肌瘤发生、发展中的意义 ,为临床药物治疗子宫肌瘤提供理论依据。方法 :选取 30例因子宫肌瘤行全子宫切除术的标本 ,取肌瘤组织和正常肌层组织分别制成石蜡切片和冰冻标本。前者经免疫组化定位研究孕激素受体亚型 ;后者经蛋白质提取和Western印迹定量研究孕激素受体亚型的蛋白表达 ;从冰冻组织中提取RNA ,通过逆转录 多聚酶链反应 ,半定量研究孕激素受体亚型的mRNA表达。结果 :(1)免疫组化显示子宫肌瘤和正常肌层细胞的细胞核中 ,可见hPR阳性颗粒 ;(2 )蛋白定量中hPR (A +B)和hPR A在子宫肌瘤的表达均高于正常肌层 ;子宫肌瘤和正常肌层中 ,hPR B表达均明显高于hPR A ;(3)hPR A、hPR B和hPR (A +B)的mRNA在肌瘤的表达量均高于周围正常肌层 ;(4 )无论在子宫肌瘤还是在正常肌层组织中 ,hPR A与hPR B的mRNA表达量差异无显著性 ,与A、B亚型受体蛋白在子宫肌瘤和正常肌层的分布差异有显著性的情况不平行 ,提示可能存在转录后调控的差异。结论 :hPR A、hPR B为核受体 ;A亚型蛋白表达在子宫肌瘤高于正常肌层 ;A、B亚型的mRNA在子宫肌瘤表达均高于正常肌层 ;孕激素受体亚型 ,特别是hPR A与子宫肌瘤的发生有关     

环氧化酶-2与雌、孕激素受体在子宫内膜癌中的表达及相关性研究

目的探讨环氧化酶-2（COX-2）与雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）在子宫内膜癌的表达及相关性。方法应用免疫组化法对我院收治的58例子宫内膜癌患者进行COX-2、雌激素受体、孕激素受体检测,探讨检测结果与子宫内膜癌病理相关性。结果COX-2表达与子宫内膜癌病理分级呈正相关,与淋巴结转移无相关性,雌激素受体、孕激素受体表达与子宫内膜癌病理分级、淋巴结呈负相关。结论COX-2、雌激素受体、孕激素受体在子宫内膜癌中均高度表达,与子宫内膜癌预后有一定的相关性。     

子宫内膜样腺癌不同激素受体差异基因表达谱分析

目的：探讨子宫内膜样腺癌（内膜癌）雌、孕激素受体不同表达状态的基因表达谱的差异。方法：采用14785条人cDNA表达谱芯片,筛选雌、孕激素受体均阳性,雌、孕激素受体均阴性,雌激素受体阳性、孕激素受体阴性子宫内膜癌的特异性差异基因表达谱。结果：雌、孕激素受体阳性内膜癌差异表达基因571条,其中上调399条、下调172条;雌、孕激素受体阴性内膜癌差异表达基因645条,上调443条、下调202条;雌激素受体阳性、孕激素受体阴性内膜癌则为1125条,上调608条、下调517条。结论：不同激素受体状态有不同的基因表达谱特征,各型受体特异性表达基因可望成为高效的治疗靶点。     

雌、孕激素对去卵巢大鼠肝脏维生素D受体mRNA表达的影响

目的：探讨雌、孕激素对去卵巢大鼠维生素D受体mRNA的影响。方法：25只成年SD雌性大鼠，随机分为 Sham组（假手术组）、OVX组（单纯去卵巢组）、OVX＋E组（去卵巢＋补充 雌激素组）、OVX＋P组（去卵巢＋补充孕激素组）、OVX＋E＋P组（去卵巢＋补充雌、孕激素组），每组5只。喂养3个半月后处死，取肝脏检测1，2，5－二羟维生素D3受体mRNA结果:与去卵巢组比较 :(1)雌激素对去卵巢大鼠肝脏1,2,5-二羟维生素D3受体mRNA的表达有显著上调作用;(2)雌、孕激素联合用药组1，25－二羟维生素D3受体mRNA的表达介于单用雌激素和孕激素之间；（3）孕激素对去卵巢大鼠肝脏1，25－二羟维生素D3受体mRNA的表达无显著上调。结论：雌激素能促进去卵巢大鼠肝脏1，25－二羟维生素D3受体的表达。     

雌、孕激素和米非司酮对子宫内膜癌细胞的作用

目的:了解雌、孕激素和米非司酮对子宫内膜癌细胞生长的影响.方法:体外培养高分化子宫内膜癌细胞Ishikawa和中分化子宫内膜癌细胞Hec-1B,分为对照组、雌激素组、雌孕激素联合组、雌孕激素和米非司酮联合组,在24,48,72,96 h测定各组细胞生长趋势的变化.结果:雌激素作用72 h Ishikawa细胞生长显著高于对照组,Hec-1B细胞较对照组有升高趋势,但差异无统计学意义.孕激素作用72 h对Ishikawa细胞有显著抑制作用,96 h后对Hec-1B细胞有显著抑制作用.在雌、孕激素基础上加入米非司酮96 h后Ishikawa细胞明显增生,48 h后Hec-1B细胞明显增生.结论:雌激素可以刺激子宫内膜癌细胞的生长.孕激素在雌激素基础上抑制内膜癌细胞的生长.米非司酮有拮抗孕激素的抑制子宫内膜癌细胞生长的作用.     

金雀黄素对子宫内膜癌细胞Erα和ERβmRNA水平的调节

目的:研究金雀黄素对子宫内膜癌细胞ERα,ERβ mRNA的调节作用,探讨植物雌激素对子宫内膜癌的作用机制,为临床应用植物雌激素提供理论依据.方法:体外培养子宫内膜癌细胞系Ishikawa,采用实时荧光定量RT-PCR方法,观察不同剂量金雀黄素对两种雌激素亚型表达的影响,阳性对照为雌二醇、孕酮作用组.结果:(1)低剂量金雀黄素能提高子宫内膜癌细胞ERα mRNA表达,但其作用较雌二醇明显弱;低剂量金雀黄素能降低ERβ mRNA的表达,而雌二醇对ERβ mRNA作用不明显.(2)高剂量金雀黄素的作用与孕酮相似,能下调子宫内膜癌细胞ERα mRNA和ERβ mRNA表达,但较孕酮作用弱.结论:金雀黄素对子宫内膜癌细胞ERα mRNA和ERβ mRNA的表达作用不同,而且与其剂量有一定关系.推测金雀黄素有雌激素受体调节剂的作用.     

子宫肌瘤孕激素受体亚型表达的研究

目的　研究子宫肌瘤中孕激素受体亚型的表达 ,探讨孕激素受体亚型 (hPR)在子宫肌瘤发病中的作用。方法　运用Westernblot、RT -PCR方法和计算机图像分析、半定量技术测定子宫肌瘤及正常肌层中孕激素受体亚型在蛋白和mRNA水平的表达。结果　子宫肌瘤中hPRs的表达均明显高于周围正常肌层 (P <0 .0 5 ) ,肌瘤及正常肌层组织中hPR -A含量均高于hPR -B ;而在mRNA水平上则无显著性差异 (P >0 .0 5 )。本实验中同时检测到第 3种亚型hPR -C的表达 ,且肌瘤中hPR -C显著高于正常肌层 (P <0 .0 5 )。在增生期和分泌期之间 ,hPR及其亚型无论在蛋白水平还是在mRNA水平均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　①子宫肌瘤hPRs蛋白的表达均明显高于周围正常肌层 ,而在mRNA水平上却无显著性差异 ;hPR蛋白的活性可能受转录后调节。②子宫肌瘤中hPR -C表达显著高于正常肌层 ,hPR -C的局部高表达可增强hPR -A、hPR -B的转录激活作用 ,可能与肌瘤局部的增生活跃有关     

孕酮联合奥曲肽抑制人非小细胞肺癌A549生长的实验研究

目的：探讨孕酮对人非小细胞肺癌A549细胞生长抑素受体（somatostatin recepter，SSTR）表达的调节及孕酮联合奥曲肽对A549细胞生长的抑制作用。方法：免疫组化法检测孕激素受体的表达；RT-PCR检测SSTR亚型mRNA的表达；MTT法检测孕酮与奥曲肽联合应用后A549细胞的生存率。结果：A549细胞表达孕激素受体及SSTR2、SSTR1、SSTR4和SSTR5，不表达SSTR3。10nmol/L孕酮作用24?h后，A549细胞出现了SSTR3的表达，延长药物作用时间至48h，SSTR3继续上调(P＝0.012)。孕酮联合奥曲肽抑制A549细胞生长的作用比奥曲肽单药更强(P<0.05)。结论：孕酮上调A549细胞中SSTR各亚型mRNA的表达；孕酮联合奥曲肽对A549细胞的生长具有更强的抑制作用。     

大鼠子宫动脉和冠状动脉平滑肌细胞表现型的差异

目的:探讨大鼠体内雌激素对子宫动脉和冠状动脉的作用与两者的平滑肌细胞(SMC)表现型的关系.方法:HE染色观察子宫动脉和冠状动脉的的组织形态学结构.间接免疫荧光染色比较子宫动脉和冠状动脉SMC中平滑肌特异性肌动蛋白α-SM actin和非肌细胞型肌动蛋白β-NM actin平均荧光强度.Western blot检测子宫动脉和冠状动脉SMC的α-SM-actin和β-NM-actin含量,并检测β-雌二醇刺激下两者β-NM actin含量变化情况.结果:冠状动脉SMC以收缩型SMC为主,高表达α-SM actin;子宫动脉SMC以合成型SMC为主,高表达β-NMactin.在生理浓度β-雌二醇刺激下子宫动脉SMC的β-NM actin含量显著上升.结论:冠状动脉和子宫动脉的SMC表现型存在明显差异,前者显示收缩型SMC特点,后者接近合成型SMC.雌激素能够刺激合成型SMC的增殖.     

影响MCF-7细胞增殖试验相关因素的初步研究

目的 了解影响MCF-7细胞增殖试验相关因素，为MCF-7细胞增殖试验检测环境雌激素方法的标准化提供试验依据。方法 对不同来源的MCF-7细胞雌激素敏感性进行检测，对筛选出的敏感细胞在不同培养条件、去激素培养基中培养不同时间进行细胞增殖试验。结果 不同来源MCF-7细胞对雌激素敏感不同；培养基中酚红、血清中内源性雌激素对MCF-7细胞有刺激增殖作用；MCF-7细胞在去激素培养基中培养时间越长，对雌激素越敏感。结论 进行MCF-7细胞增殖试验前应进行雌激素敏感试验，选用敏感细胞；应在去激素培养基中培养适当时间后进行试验。     

成纤维生长因子2对人乳腺癌细胞MCF7骨涎蛋白表达的影响

【目的】研究成纤维生长因子2（FGF2）对人乳腺癌细胞MCF7骨涎蛋白（BSP）表达的影响。【方法】将MCF7细胞随机分为5组：空白对照组、FGF2（10 ng/ml）刺激3、6、12和24 h组,分别应用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术检测BSP mRNA和蛋白表达水平。【结果】各实验组均有BSP的mRNA表达,其表达水平在FGF2刺激后呈时间依赖性增加,6 h增强最为明显。BSP蛋白表达量也呈时间依赖性增加,12 h增强最为明显。【结论】乳腺癌细胞MCF7组成性表达BSP,在FGF2作用下BSP表达水平呈时间依赖性增强。     

长江流域某市饮用水雌激素污染物初步研究

目的　了解饮用水雌激素污染物污染状况。方法　应用气相色谱 /质谱 (GC/MS)分析技术、人乳腺癌(MCF/ 7)细胞增殖试验和子宫湿重实验 ,对某市饮用水雌激素污染物进行检测。结果　GC/MS分析表明 ,水源水中有机污染物 10 0余种 ,出厂水中 80余种 ;其中作为可疑雌激素物质的邻苯二甲酸二 ( 2 甲基丙基 )酯、邻苯二甲酸二丁酯检出率分别为 10 0 %和 90 %。此外 ,还检出 2 ,4 二甲基酚等酚类物质。嘉陵江水源污染重于长江 ,出厂水均为丰水期污染重于枯水期 ,而以C厂和E厂出厂水水质较好。生物学评价结果显示 ,水源水、出厂水有机提取物均刺激MCF/ 7细胞增殖和大鼠子宫生长 ,而且这种作用可被tamoxifen抑制。丰水期水源水水质比枯水期水源水水质好 ;丰水期水质是长江优于嘉陵江 ,枯水期水质则是嘉陵江优于长江。丰水期水源水经水厂处理后 ,对MCF/ 7细胞增殖的刺激作用均增加 ,而枯水期则相反。枯水期A厂和B厂的出厂水水质是较好的。结论　某市饮用水中存在雌激素污染物 ,但尚不构成对人体的危害。     

雌激素对人乳腺癌细胞周期蛋白E表达及血清饥饿时细胞存活力的影响

目的：探讨雌激素对人乳腺癌细胞周期蛋白E表达及在血清饥饿状态下细胞存活力的影响。方法：以MCF-7乳腺癌细胞为模型,采用蛋白印迹分析法检测乳腺癌周期蛋白与表达、显微镜下观察细胞变化、台盼蓝染色及细胞计数法测算细胞存活力。结果：雌激素（10 nmol/L）处理可引起乳腺癌细胞周期蛋白E的过度表达,与对照组比较,增高56.42%（P〈0.05）;在无血清培养条件下,雌激素能减少乳腺癌细胞死亡,增强细胞的存活力,与对照组比较,72 h细胞存活率增高19.86%（P〈0.05）。结论：雌激素能显著上调周期蛋白E的蛋白表达,并增强乳腺癌细胞对血清饥饿的抵抗力。     

胰岛素样生长因子1及其受体在卵巢癌细胞增殖中的作用

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF1)及其受体(IGF1R)在卵巢癌HO8910PM细胞增殖中的作用。方法以不同浓度的IGF1作用于HO8910PM细胞24、48、72和96 h,通过CCK-8法检测细胞增殖活性;在脂质体介导下转染特异性IGF1R小干扰RNA(siRNA),通过实时PCR和Western blotting验证其在IGF1R mRNA和蛋白表达水平的抑制效果;于转染后48 h给予IGF1刺激,通过CCK-8法测定细胞增殖活性。结果IGF1作用48 h后可明显刺激细胞的增殖(P<0.05);转染IGF1R siRNA后48 h,IGF1R mRNA和蛋白表达均明显下调(P<0.05);转染IGF1R siRNA后48 h给予IGF1刺激,IGF1的促细胞增殖效应明显被抑制(P<0.05)。结论IGF1通过IGF1R途径促进HO8910PM细胞的增殖,IGF1R siRNA可以有效抑制该作用。     

重组人 HER3 胞外域Ⅰ区 183-227aa 的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定

目的 原核表达、纯化由人表皮生长因子受体3（HER3）183-227aa肽段（HER3Ⅰ）和麻疹病毒蛋白288-302aa肽段（MVF）融合构建的重组肽（MVF-HER3Ⅰ），并制备其多克隆抗体。方法 将MVF与HER3Ⅰ融合构建重组肽MVF-HER3Ⅰ，用化学合成法合成重组肽基因，并将其与pET21b质粒和含有硫氧还蛋白（Trx）基因的pET32a质粒连接构建重组肽表达质粒，重组质粒用双酶切法鉴定。将重组质粒导入到大肠杆菌BL21（DE3）并进行表达参数优化及诱导表达。融合蛋白依次经镍离子亲和层析、肠激酶酶切和再次镍离子亲和层析制备重组肽。表达和纯化过程中的样品纯度和相对分子质量用SDS-PAGE分析。以纯化的重组肽为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体。用ELISA法测定抗重组肽多克隆抗体效价，免疫印迹和免疫沉淀法分析抗重组肽多克隆抗体对重组肽和非变性状态HER3的识别，激光共聚焦法分析抗重组肽多克隆抗体与MCF7 细胞的结合，磺酰罗丹明B染色法测定在有无神经调节素刺激下抗重组肽多克隆抗体对高表达HER3的MCF7细胞的增殖抑制作用。结果 成功构建了重组肽的两种表达质粒，重组肽基因不能单独表达，但和Trx融合后可在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG条件下呈可溶高表达。融合蛋白经亲和层析、酶切和再次亲和层析后得到重组肽。重组肽可刺激大鼠产生效价达1:512 000的抗重组肽多克隆抗体。该抗体不仅可特异性识别重组肽,还可特异性沉淀非变性HER3和结合于MCF7细胞的细胞膜。不管有无神经调节素刺激，该抗体均呈浓度依赖性地抑制HER3高表达的MCF7细胞的增殖（P<0.01）。结论 成功进行了重组肽 MVF-HER3Ⅰ的原核表达和纯化，制备并鉴定了抗MVF-HER3Ⅰ多克隆抗体，为在体内外深入研究该抗体对HER3信号通路的影响打下基础。