比较两种消化酶对分离大鼠肝细胞的影响

目的:比较胶原酶和胰蛋白酶在分离大鼠肝细胞数量、活力、原代培养及MTT试验等四个方面的差别。方法:分别用胶原酶和胰酶分离获取大鼠肝细胞,通过台盼蓝拒染试验测细胞活力并计数,将分离的肝细胞进行原代培养并观察肝细胞形态变化,采用噻唑蓝(MTT)试验测肝细胞的增殖状况。结果:胶原酶分离的肝细胞数量是胰酶的2．4倍,而胰酶分离的肝细胞活力是胶原酶的2．8倍;胶原酶分离的肝细胞原代培养时贴壁慢,生长不良,而胰酶分离的肝细胞贴壁快,生长良好;MTT试验结果表明胰酶分离培养的细胞活性明显高于胶原酶。结论:胶原酶分离的细胞数量及纯度优于胰酶,而胰酶分离的细胞活力优于胶原酶。     

白介素-10对肝纤维化大鼠星状细胞表达细胞间黏附分子-1的影响

目的:探讨外源性白介素-10(IL-10)对肝纤维化大鼠星状细胞(HSC)表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的影响.方法:60只♂性SD大鼠随机分为生理盐水对照组8只(N组)、CCl4组28只(C组)和IL-10干预组24只(Ⅰ组),建立正常对照、CCl4诱导肝纤维化模型及IL-10干预模型.造模第7周和第11周,采用链霉蛋白酶E、Ⅳ型胶原酶经门静脉离体灌流消化,11%Nycodenz密度梯度离心分离HSC.半定量RT-PCR法检测各组HSC的ICAM-1 mRNA表达水平.结果:成功构建纤维化大鼠模型并分离肝星状细胞.造模第7周、第11周新分离的HSC中,N组的ICAM-1不表达,C组与I组均检出ICAM-1表达,C组表达均明显高于Ⅰ组(P＜0.01);造模第11周,Ⅰ组的ICAM-1表达水平较第7周有明显下降(P＜0.01),C组较第7周则明显增多(P＜0.01).结论:ICAM-1随实验性大鼠肝纤维化进展表达升高;IL-10可通过抑制HSC ICAM-1表达,在抗纤维化中发挥作用.     

原代鸭肝细胞的原位灌流分离法

目的：探索优化的原代鸭肝细胞分离方法，为鸭肝细胞在体外研究中的应用奠定基础。方法：分别采用胶原酶（Ⅰ型与Ⅳ型）经门静脉或胆总管原位灌注分离鸭肝细胞，观测肝细胞产量、存活率及其形态。结果：1．经门静脉原位灌流分离鸭肝细胞效果明显优于经胆总管灌流法；2．右心室为灌流液流出道分离鸭肝细胞效果明显优于经下腔静脉流出道分离法；3．Ⅰ型胶原酶与Ⅳ型胶原酶灌流分离鸭肝细胞效果相当。结论：采用Ⅰ型或Ⅳ型胶原酶经门静脉 －右心室原位灌流分离鸭肝细胞为一较好的方法，有利于鸭肝细胞为模型的体外研究工作的开展。     

白介素-10对肝纤维化大鼠星状细胞EGF及HGF表达的影响

目的探讨IL10干预对实验性肝纤维化大鼠肝星状细胞EGF、HGF表达的影响及其抗纤维化作用的可能机制。方法60只♂SD大鼠随机分为正常对照组(N组,8只)、肝纤维化模型组(C组,28只)和IL10干预组(I组,24只),分别于CCl4造模第7周及11周采用链霉蛋白酶E、Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注分离肝星状细胞。半定量RTPCR法检测各组新分离肝星状细胞中EGF、HGFmRNA表达水平;SP免疫细胞化学法检测各组原代培养3天后肝星状细胞EGF的表达。并于上述两个时间段分别将各组肝组织行HE染色判断炎症和肝纤维化程度。结果成功建立大鼠肝纤维化模型和分离大鼠肝星状细胞。与正常组相比,纤维化模型组EGF、HGF的mRNA水平显著升高(P<001),经IL10干预后则明显降低(P<001)。对EGF而言,IL10组表达量高于正常组(P<005);对HGF而言,IL10组皆低于正常组(P<005)。肝纤维化模型组EGFmRNA水平在第11周较第7周有进一步的升高(P<005)。SP免疫细胞化法检测各组EGF的蛋白表达情况与上述mRNA结果相平行。结论EGF、HGF随肝纤维化进程逐渐升高,IL10可抑制纤维化大鼠肝星状细胞EGF、HGF的表达,具有抗纤维化作用。     

低浓度胶原酶原位循环灌流法用于原代大鼠肝细胞分离

目的探索高效的原代大鼠肝细胞分离方法.方法改进并建立低浓度胶原酶原位循环灌流法,比较肝细胞产量、存活率以及胶原酶用量等.结果低浓度胶原酶原位循环灌流法肝细胞产量为1.584±0.525×108/100g大鼠体重,存活率达95.2±2.9%,肝细胞纯度＞95%,胶原酶用量减少为4.5 mg/100g大鼠体重.而非循环门脉灌流法肝细胞产量为0.508±0.456×108/100g大鼠体重,存活率为84±8%,胶原酶用量10mg/100g大鼠体重.结论低浓度胶原酶原位循环灌流法为一经济、高效、实用的原代大鼠肝细胞分离技术.     

大鼠原代肝细胞与枯否细胞同步分离的优化研究

目的优化分离培养高纯度的大鼠肝细胞与枯否细胞,为肝细胞与枯否细胞的共同培养提供实验细胞。方法 1原位胶原酶灌注法分离细胞;2 Percoll液不连续密度梯度离心法分离枯否细胞;3选择性贴壁纯化枯否细胞;4台盼蓝拒染法判定细胞活力,PAS染色法鉴定肝细胞,墨汁吞噬及CD68免疫染色法鉴定枯否细胞。结果通过改良的原位胶原酶灌注法,不连续密度梯度离心法以及选择性贴壁法等手段,成功实现了肝细胞与枯否细胞的同时分离,且所分离出的2种细胞的得率与纯度均达到后续实验所需细胞的要求。结论通过该创新方法同时分离肝细胞与枯否细胞是有效可行的。     

大鼠肝星状细胞的分离和培养

目的:本文参考Friedman等的不连续密度离心法并作改良,建立了一种经济、简便、可靠的分离大鼠肝星状细胞(HSC)的方法。方法:用链霉蛋白酶和胶原酶灌流大鼠肝脏,Nycodenz密度梯度离心分离HSC,并进行体外培养,结果:分离培养的HSC经台盼蓝拒染实验活细胞大于98％,细胞得率为3.95×10个/肝脏。结论:该方法简便、实用、稳定、可靠,而且本方法的建立为进一步研究HSC与肝纤维化的关系,尤其是细胞水平及分子生物学水平的研究奠定了基础。     

小鼠肝脏原位持续灌流方法的建立及其在肝脏非实质细胞分离中的应用

目的建立一种小鼠肝脏原位持续灌流的方法,并将该法应用于肝脏非实质细胞的分离。方法利用三通管和静脉留置针将门静脉、蠕动泵软管以及下腔静脉连接形成封闭回路,自门静脉端注入37℃的胶原酶消化液约60 ml,调节蠕动泵转速为20 ml.min-1行循环灌注约30 min,摘除肝脏剪切成小块组织,加入胶原酶孵育液消化30 min后碾碎制备成细胞悬液,离心后取沉淀先后以50%和35%的Per-coll密度离心即可获得小鼠肝非实质细胞。结果肝脏非实质细胞的得率为0.5×107～1×107个/鼠肝,流式检测CD45+细胞占(27.21±1.47)%。结论胶原酶肝脏原位持续灌流+体外孵育消化结合Percoll密度离心是分离小鼠肝脏非实质细胞的可靠方法。     

大鼠肝细胞分离及体外损伤模型建立

目的:分离大鼠肝细胞,建立体外大鼠肝细胞损伤模型.方法:改进Seglen胶原酶(IV型)原位灌注分离大鼠肝细胞,培养液中加入不同浓度D-氨基半乳糖培养24 h,于培养1、3、6、12、24 h取上清测定ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸转移酶)、LDH(乳酸盐脱氢酶),同步测定肝细胞的细胞增殖活性(MTT)反应.结果:平均肝细胞产量(8.92±0.47)×108,Trypan blue拒染实验细胞活性率96.23%±2.41%,培养体系中加入D-氨基半乳糖后,部分肝细胞胞膜破损,随剂量增加及时间延长而逐渐加重;各剂量组随时间延长,培养上清液中生化指标水平逐渐升高,而MTT反应水平逐渐下降,以3 h与6 h变化最为明显;各时间点生化指标及MTT反应变化随剂量增加呈现相同趋势.结论:该方法可获得高产量高活性大鼠肝细胞;D-氨基半乳糖可成功诱导大鼠肝细胞体外损伤模型.     

玉郎伞多糖对四氯化碳诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用

目的:研究玉郎伞多糖(YLS)对大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养,用四氯化碳(CCl4)体外诱导肝细胞损伤,检测培养上清液中天门冬氨酸转换酶(AST)和丙氨酸氨基转换酶(ALT)水平,测定肝细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果:YLS(0.125~1.000g.L-1)可明显降低由CCl4升高的肝细胞培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞MDA含量,还可提高CCl4降低的肝细胞存活率和GSH含量。结论:提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用,该作用可能与其抗氧化作用有关。     

肝部分切除术对大鼠门静脉途径肝细胞转基因效率的影响

目的 :探讨肝部分切除术对大鼠肝细胞门静脉途径转基因效率的影响。方法 :Wistar大鼠分 4组 ,每组 5只 :A1组 :30 %切肝并于门静脉注射脂质体—质粒 DNA混合物 (lipofectamine- p EGFP- N1DNA complexes,lipoplexes) ;A2组 :30 %切肝并于门静脉注射生理盐水 (NS) ;B1组 :70 %切肝并于门静脉注射 lipoplexes;B2组 :70 %切肝并于门静脉注射 NS。转染后 15 d均以胶原酶消化、Percoll液梯度离心法获取纯化肝细胞悬液 ;以 NS组为对照并以 GFP为荧光标记物 ,用流式细胞仪 (flow cytometry,FCM)分析各实验组肝细胞的转染率。结果 :A1组和 B1组的平均转染率分别为 :(1.12± 0 .5 0 ) %、(3.91± 1.6 8) % ;B1组明显高于 A1组 (P<0 .0 5 )。结论 :与 30 %肝部分切除术相比 ,70%切肝可显著提高大鼠肝细胞门静脉途径转基因的效率     

猪肝脏体外不同灌流系统建立和评价

目的：探讨体外肝脏灌流系统中的影响因素，建立稳定有效的体外肝脏灌流系统。方法：根据灌流和氧合的方式建立不同的体外猪肝脏灌流系统，随机分为3组(每组n=4)。A组单独灌流门静脉，氧合灌流液；B组同时灌流门静脉和肝动脉，共同氧合门静脉和肝动脉的灌流液；C组同时灌流门静脉和肝动脉，分别氧合门静脉和肝动脉的灌流液。观察体外肝脏灌流时间、胆汁分泌量、病理变化和血液动力学等指标。结果：A组的灌流时间明显低于B组和C组。在1，3，6h的时间点A组胆汁分泌量、血液动力学等指标和B、C组比较差异有统计学意义。在12h时间点B组和C组胆汁分泌量和血液动力学的差异也有统计学意义。结论：同时灌流门静脉和肝动脉，分别氧合门静脉和肝动脉灌流液的灌流系统更稳定，对体外肝脏功能的维持效果较好。     

Sendai virus-mediated gene delivery into hepatocytes via isolated hepatic perfusion

The recombinant Sendai virus vector is a promising tool for human gene therapy, capable of inducing high-level expression of therapeutic genes in tissue cells in situ. The target tissues include airway epithelium, blood vessels, skeletal muscle, retina and the central nervous system, but application to hepatic tissues has not yet been achieved, because direct intraportal injection of the vector is not feasible. We report an efficient and harmless procedure of gene delivery by recombinant Sendai virus into rat parenchymal hepatocytes, based on isolated hepatic perfusion with controlled inflow. Critical parameters for successful hepatic gene delivery are a brief preperfusion period (25 degrees C, 5 min); appropriate vector concentration in the perfusate (10(7) pfu/ml); moderate portal vein pressure (12 mmHg) and a brief hyperthermic postperfusion period (42 degrees C, 5 min). Under these optimized conditions, marker genes were expressed in most parenchymal hepatocytes without significant damage to hepatic tissues. Furthermore, expression of the marker genes was undetectable in nonhepatic tissues, including the gonads, indicating that this approach strictly targets hepatic tissues and thus offers good clinical potential for human gene therapy.     

An isolated dual-perfused rabbit liver preparation for the study of hepatic blood flow regulation.

An original, isolated dual-perfused rabbit liver preparation was developed for investigations into mechanisms that control the hepatic vascular tone. The hepatic artery (HA) and portal vein (PV) were perfused at constant flows of 0.16 +/- 0.01 and 0.64 +/- 0.05 mL/g/min (n = 5), respectively. Responses of the hepatic arterial and portal venous vascular beds to noradrenaline (NA) were measured as changes in perfusion pressure. Noradrenaline injected directly into the hepatic artery and portal vein produced dose-dependent increases in pressure in the respective vascular beds, the maximum response in the hepatic arterial bed being two to three times greater than that in the portal venous bed. A restricted transmission of vasoconstrictor stimulus between the intrahepatic portal venous and hepatic arterial vasculature was demonstrated. The results demonstrate the suitability of the dual-perfused rabbit liver model for detailed studies of the control of hepatic vascular tone.     

肝癌及门静脉癌栓血供灌注特征的彩超与超声造影研究

目的探讨彩超(CDUS)与超声造影(CEUS)对不同类型肝癌及门静脉癌栓(PVTT)的血供灌注特征及临床价值。方法应用CDUS及CEUS对经临床证实的369例437个不同类型肝癌病灶及合并的PVTT进行血供灌注特征和血流动力学变化的研究分析。结果①肝癌血供灌注呈多样性:肝动脉血供为主型占72.8%(318/437),肝动脉和门静脉双重血供型占16.7%(73/437),肝动脉和门静脉双重血供兼动静脉瘘型占8.2%(36/437),门静脉血供为主型占2.3%(10/437)。②PVTT血供灌注也呈多样性,即肝动脉血供型或双重血供型。③肝癌血供的CEUS初始强化形态与肿瘤血管分布状态密切相关。结论 CEUS可明确判定肝癌及合并的PVTT的血供灌注特征,对肝癌的诊断、鉴别诊断及治疗方案的选择有重要的临床价值。     

Hepatic glutathione degradation within the sinusoids of guinea pig livers shows a periportal localization of gamma-glutamyl transferase activity.

In utilizing intact perfused guinea pig livers a probable periportal localization of gamma-glutamyl transferase (GGT) activity was apparent. Untreated livers perfused from the portal to hepatic vein had a significantly greater glutathione efflux than the same livers perfused from the hepatic to portal vein. Switching the perfusion direction also saw a significant rise in the cysteinylglycine efflux. It was apparent from the results that the efflux of glutathione degradation products from the guinea pig livers was significantly greater than those of the intact tripeptide. However, with maximal GGT inhibition glutathione accounted for 90% of the glutathione-related thiols exported from the liver with cysteine accounting for the remaining 10%. Therefore, glutathione exported from hepatocytes may act as a means of transporting its constituent amino acids. The periportal localization of GGT activity ensures that the more susceptible perivenous region faces the greatest concentration of glutathione degradation products.     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

大鼠离体肝脏灌流系统的建立

目的：建立大鼠离体肝动脉／门静脉灌流系统的实验方法。方法：雌性Wistar大鼠麻醉状态下,肝动脉、门静脉和肝静脉插管;经肝动脉冲净残留血液,灌流状态下游离肝脏;定量蠕动泵调节肝动脉或门静脉的Krebs—Henseleit平衡液（或加等渗葡聚糖）的灌流流速,泰盟BL-420S生物机能实验系统监测肝动脉或门静脉的压力变化,采用Prism-4非线型可变斜率回归获得“有或无胶体渗透压”KH液灌流的流速-压力曲线及方程式,计算半效流速及其95％的可信限。结果：无胶体渗透压灌流状态下的肝脏系数无差别,肝动脉的半效流速为2217（95％CI1209～4068）μl·min^－1,对数流速-压力直线方程为Y=142．4x＋706．9;门静脉半效流速为3791（95％CI3549～4049）μl·min^－1,对数流速-压力直线方程为Y：479．6X＋5034。等效胶体渗透压灌流状态下的肝脏系数无差别,肝动脉半效流速为3754（95％CI3175～4440）μl·min^－1,对数流速-压力直线方程为Y=133．5X-719．0;门静脉半效流速为6018（95％CI5565—6508）μl·min^－1,对数流速-压力直线回归方程为Y：538．3X4-4704。半效流速接近正常大鼠生理平均值,各半效流速95％可信限涵盖大鼠正常生理状态的变化范围。有或无胶体渗透压灌流状态之间总体无差别。结论：在恒流测压模式下,等渗灌流大鼠离体肝动脉和门静脉灌流系统的视窗时程长、机能变化稳定、操作流程简便,为认识肝动脉和门静脉离体舒缩机制奠定了基础。     

间接门静脉与直接门静脉灌注5-氟尿嘧啶的药动学比较

目的：研究经兔脾动脉、肠系膜上动脉（即间接门静脉）灌注5－Fu和直接门静脉灌注5－Fu的药动学变化，以证实临床经间接门静脉灌注化疗药物治疗肝肿瘤的合理性。方法：3组家兔分别经脾动脉（SA组）、肠系膜上动脉（SMA组）和门静脉（PV组）灌注5－Fu，用高产液相色谱仪检测不同时间门静脉血中的药物浓度。结果：PV组AUC明显高于SA组和SMA组（P＜0．01），SA组又高于SMA组（P＜0．05）；PV组T1／2明显低于SA、SMA组（P＜0．01），SA组又低于SMA组（P＜0．05）；30min后3组门静脉血中的5－Fu浓度趋向于一致。结论：经间接门静脉灌注可作为直接门静脉灌注的一个补充手段应用于肝肿瘤的“双灌注”治疗。