MG132对高糖刺激的肾系膜细胞中Smad7表达的作用

目的 观察不同浓度高糖刺激后大鼠肾系膜细胞胞内Smad7 的表达,并以蛋白酶体特异性抑制剂MG132作为阻断剂,探讨泛素化降解在Smad信号中的作用.方法 将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分别设正常对照组(葡萄糖浓度5.6 mmol/L)、20 mmol/L高糖组、30 mmol/L高糖组、30 mmol/L高糖+MG132组、甘露醇组、正常对照组+MG132、30 mmol/L高糖+溶剂组等.分别用Real time Quantitative PCR法和细胞免疫荧光染色法及激光共聚焦显微镜检测各组细胞Smad7的mRNA和蛋白的表达.结果 (1)与正常对照组比较,高糖作用后,各组Smad7 mRNA的表达差异无统计学意义;(2)而正常对照组细胞Smad7蛋白表达较强;高糖组较正常对照组表达减弱(P<0.05),呈浓度依赖性,30 mmol/L高糖组加入MG132后,Smad7蛋白表达增强.结论 (1)高糖可诱导肾系膜细胞Smad7蛋白降解增加;(2)MG132可阻止高糖所导致的上述变化.提示泛素-蛋白酶体途径参与了糖尿病肾病Smad通路的信号调节.     

高糖对肾小球系膜细胞Smurf2表达的影响

目的观察不同浓度高糖刺激后大鼠肾小球系膜细胞胞内Smad泛素调节因子2(Smurf2)的表达,探讨泛素化降解在糖尿病肾病中的作用。方法将体外培养的大鼠肾系膜细胞分别设正常对照组(葡萄糖浓度5.6 mmol/L)、20 mmol/L高糖组、30 mmol/L高糖组、甘露醇组。分别用real ti me quantitative PCR法和细胞免疫荧光染色法及激光共聚焦显微镜检测各组细胞Smurf2的mRNA和蛋白的表达。结果(1)正常对照组系膜细胞Smurf2的mRNA和蛋白表达较弱。(2)高糖组Smurf2的mRNA和蛋白表达较正常对照组增强(P<0.05),呈浓度依赖性。结论高糖可诱导肾系膜细胞Smurf2表达增强。提示泛素-蛋白酶体途径可能参与了糖尿病肾病的病理进程。     

高糖对大鼠肾系膜细胞IкB-α表达影响的泛素化研究

目的 探讨高糖对大鼠肾小球系膜细胞IkB-α表达的影响及其可能的作用途径.方法 将大鼠HBZY-1肾小球系膜细胞进行体外培养,设立正常对照组(5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组(包括10、20和30mmol/L葡萄糖)、甘露醇组、30 mmol/L高糖加特异性泛素蛋白酶体阻断剂MG132组及5.6 mmol/L葡萄糖加MG132组,作用48h,用Western Blotting法检测各组IkB-α蛋白的表达,实时定量PCR法检测各高糖组IkB-α及泛素mRNA的表达.结果 各高糖组IkB-α蛋白的表达下降(P＜0.05),具有浓度依赖效应;各高糖组IkB-α mKNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05);各高糖组泛素mRNA的表达增加(P＜0.05);30mmol/L高糖加MG132组较30mmol/L高糖组IkB-α蛋白的表达下降被明显逆转(P＜0.0).结论 高糖可增加大鼠肾系膜细胞泛素表达,上调泛素蛋白酶体系统活性,增加IkB-α蛋白泛素化降解.     

高糖刺激肾小球系膜细胞Bcl-2、Smac、Fas的表达研究

目的:研究高糖刺激肾小球系膜细胞后,凋亡相关基因Bcl-2、Smac、Fas的表达情况。方法:将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组(糖浓度为5.6 mmol/L)和高糖组(糖浓度为30 mmol/L),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同作用时间(12 h、24 h、36 h、48 h)下,系膜细胞的增殖状况,且在各时间点,采用免疫荧光染色法观察Bcl-2、Smac、Fas的表达情况并测定其荧光强度。结果:MTT比色法检测结果显示高糖组较对照组系膜细胞增殖明显,与作用时间呈正相关。同时,免疫荧光检测结果显示高糖组Bcl-2在以上不同时间作用下,与对照组相比,荧光强度增强(P<0.05),且高糖组随作用时间的延长,强度也相应增强,24 h、36 h、48 h各时间点的荧光强度与12 h相比,差异有统计学意义(P<0.05)。而Smac、Fas的荧光强度与对照组相比则减弱(P<0.05),且随作用时间的延长,强度也逐渐减弱,24 h、36 h、48 h各时间点与12 h相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2的荧光强度与Smac或Fas的荧光强度之间存在明显的负相关关系(P<0.05)。Smac的荧光强度与Fas的荧光强度之间存在明显的正相关关系(P<0.05)。结论:高糖刺激系膜细胞后,细胞增殖明显,Bcl-2的表达增加,Smac、Fas的表达下降,呈时间依赖性。     

肌肽对高糖作用下肾小球系膜细胞的影响

目的探讨肌肽对体外高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞MCs生长的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞（mesangial cells,MCs）,分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）、高渗甘露醇组（HM）、正常糖加20 mmol/L肌肽组（NG＋C20）和高糖加20 mmol/L肌肽组（HG＋C20）5组。采用MTT法测定肾小球系膜细胞24 h、48 h的增殖情况。结果在24 h、48 h时间段,在与正常对照组相比高糖组出现明显的增殖现象（P〈0.01或P〈0.05）;高糖加20 mmol/L肌肽组与高糖组相比,具有显著的抑制作用（P〈0.01）。结论肌肽通过抑制高糖条件下肾小球系膜细胞的增殖来对糖尿病肾病起到保护作用,为糖尿病肾病的防治提供新途径。     

高糖对肾小球系膜细胞p38MAPK表达的影响

糖尿病肾病（DN）是糖尿病患者的主要死因之一。肾小球系膜细胞（GMC）是肾脏合成分泌细胞外基质蛋白如纤连蛋白、胶原等的主要细胞，也是免疫性和非免疫性病因（包括糖尿病）损伤的靶目标。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是细胞内重要的信号级联反应系统，细胞运用这一系统将细胞外的刺激反应到胞核，介导细胞的反应，参与多种细胞生理功能的调节。在糖尿病患者的体内存在的多种代谢紊乱可活化p38MAPK信号通路，从而导致了DN的发生和发展。[第一段]     

高糖浓度对人肾小球系膜细胞的作用

目的 模拟相血糖控制不佳出现的糖浓度波动,研究波动性细胞外高糖浓度（ＦＥＨＧ）对肾小球系膜细胞（ＭｓＣ）增殖及其纤维连接蛋白合成的影响。方法 利用四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）比色法和竞争抑制ＥＬＩＳＡ法动态观察不同葡萄糖浓度及波动性高糖浓度对ＭｓＣ增殖和ＦＮ合成的作用。结果 高糖浓度抑制ＭｓＣ增殖,此抑制作用和糖浓度成正相关,同时刺激ＭｓＣ的ＦＮ合成增加;     

Resveratrol对高糖所致大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响

目的:探讨高糖对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响及Resveratrol的干预作用.方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞.①分为正常对照组(NC组,匍萄糖浓度5.6 mmol/L)、高糖组(HG组,葡萄糖浓度30 mmol/L),分别观察24、48、72 h;②分为NC组、HC组、Resveratrol组(Res组,葡萄糖浓度5.6 mmol/L+Resvemtrol 20 μmol/L)和高糖+Rcsvcratrol组(HG+Res 组,葡萄糖浓度30 mmol/L+Resveratrol浓度分别为5、10、15、20 μmol/L),各组细胞分別培养48 h.用半定量RT-PCR和Western blotting法检测细胞内TGF-β1 mRNA和蛋白表达变化.结果:①与NC组相比,HG刺激后大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达明显增加,差异均有显著性,P值均<0.01;②与HC组相比,HG+Resveratrol干预后,大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达呈浓度依赖性减少,差异均有显著性(P值分别为<0.05,<0.01).Res组和NC组之间TGF-β1 mRNA和蛋白表达的差异无显著性(P>0.05).结论:高糖能上调大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达,Resveratrol可能通过抑制高糖引起的系膜细胞TGF-β1高表达而在糖尿病肾病中起治疗作用.     

茶多酚对高糖所致人肾系膜细胞活性氧、Ⅳ型胶原合成的影响

目的：探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧、Ⅳ型胶原合成的影响及其茶多酚的干预作用。方法：系膜细胞在高糖(35mmoL／L D-糖)条件下加入或不加入茶多酚(20μg／ml)培养至36h．运用化学比色法，放射免疫法检测高糖作用后培养系膜细胞上清液中活性氧(SOD和MDA)、Ⅳ型胶原的含量以及加入茶多酚后其含量的改变：应用免疫细胞化学法检测高糖作用后系膜细胞内Ⅳ型胶原的表达以及加入茶多酚后其表达的改变。结果：高糖使系膜细胞上清液中SOD含量减少．MDA含量增加，使培养的系膜细胞上清液中及细胞内Ⅳ型胶原含量增加；茶多酚可提高上清液中SOD活性．降低MDA含量．抑制系膜细胞合成和分泌Ⅳ型胶原。结论：高糖致人肾小球系膜细胞活性氧产生增加．促进Ⅳ型胶原合成和分泌．茶多酚可有效干预高糖的作用．     

高糖对人肾小球系膜细胞MAPK活性的影响

目的研究高糖对人肾小球系膜细胞丝裂原蛋白激酶(MAPK)活性的影响,探讨其在糖尿病肾病发病中的作用.方法采用人肾小球系膜细胞进行体外培养,按培养液中葡萄糖浓度分为对照组(含11mmol*L-1葡萄糖)、高糖组(含30mmol*L-1葡萄糖)、MAPK抑制剂组(含25μmol*L-1PD98059加30mmol*L-1葡萄糖)及甘露醇组(含20mmol*L-1甘露醇),以32P标记的髓磷脂碱性蛋白为底物,用同位素示踪技术测定培养细胞的MAPK活性.结果高糖组MAPK活性明显高于其它各组;加入MAPK抑制剂后,其活性明显降低,同时细胞的增殖受到抑制.结论高糖可增加人肾小球系膜细胞MAPK活性,且可能与渗透压引起的应激刺激相关.     

白藜芦醇改善高糖引起肾小球系膜细胞损伤的作用研究

目的:探讨白藜芦醇(RSV)对体外高糖刺激引起大鼠肾小球系膜细胞(RGMCs)损伤的影响及其潜在分子保护机制.方法:取处于对数生长期的RGMCs,分为甘露醇高渗透压对照组(OC)、正常对照组(NG)、高糖组(HG)以及高糖RSV处理组,分别处理24、48 h.试剂盒检测不同时间各组细胞上清液中LDH的水平;Wester...     

肌肽对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的影响及机制

目的探讨肌肽(carnosine)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(rat mesangial cells,RMCs)增殖的影响及作用机制。方法以RMCs为研究对象,分别采用MTT法和BrdU-ELISA法观察肌肽对高糖诱导的RMCs增殖的影响;乳酸脱氢酶(LDH)法检测肌肽对细胞的毒性作用;酶生化法测定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性等。结果肌肽可显著抑制高糖诱导的RMCs增殖,在5～30 mmol/L范围内呈一定的浓度依赖效应,且与其抗氧化作用密切相关。结论肌肽通过抗氧化作用抑制高糖诱导的RMCs增殖,且有浓度依赖趋势。     

雷帕霉素对高糖诱导肾小球系膜细胞增生、肥大及细胞外基质合成的影响

目的:观察雷帕霉素对高糖诱导肾小球系膜细胞增生、肥大及细胞外基质合成的影响.方法:在高糖状态下培养系膜细胞,予以不同剂量雷帕霉素进行干预,采用MTT的方法观察细胞增生能力,并用流式细胞仪检测各组系膜细胞体积,以前向角散射光平均强度表示细胞大小,Western印迹法检测细胞中纤维连接蛋白(FN)及Ⅳ型胶原(ColⅣ)的表达变化.结果:同正常糖及甘露醇组比较,高糖可使肾小球系膜细胞增生且发生肥大,同时高糖环境下系膜细胞分泌的FN及ColⅣ显著增加(P＜0.05),而雷帕霉素能显著抑制高糖的上述作用(P＜0.05),且呈剂量依赖性.结论:雷帕霉素可以抑制高糖状态下系膜细胞的增生、肥大及细胞外基质的合成,且呈剂量依赖性,有望用于糖尿病肾病的防治.     

氟伐他汀对高糖诱导的大鼠系膜细胞ERK1/2和CTGF表达的调控

目的：观察氟伐他汀对高糖刺激下的大鼠系膜细胞ERK1/2活性及CTGF表达的影响,阐明糖尿病肾病(DN)的发生机制和早期防治。方法：实验分两部分,第一部分为重复已有的高糖对系膜细胞刺激作用的实验,验证高糖可通过激活ERK通路使系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达增加,且这种变化与高渗状态无关,分组如下：①正常对照组(NG);②高糖组(HG);③高渗组(MN);④NG+ERK抑制剂PD98059组(NG+PD);⑤HG+ERK抑制剂PD98059组(HG+PD)。第二部分观察氟伐他汀干预前、后ERK1/2活性和CTGF蛋白表达的变化,分组如下：①正常对照组(NG);②高糖组(HG);③正常糖+氟伐他汀组(NG+F);④高糖+氟伐他汀组(HG+F);⑤高糖+氟伐他汀及甲羟戊酸组(HG+F+M)。采用Western blotting、RT-PCR方法检测肾小球系膜细胞ERK1/2、CTGF蛋白及mRNA表达量,ELISA方法检测肾小球系膜细胞培养上清纤维连接蛋白（FN）含量,用考马斯亮兰法测定肾小球系膜细胞内总蛋白变化。结果：第一部分实验HG的ERK1/2活性、CTGF蛋白表达较NG明显增加(P<0.01),HG+PD的ERK1/2活性、CTGF蛋白表达较HG明显减少(P<0.01),而MN、NG+PD与NG比较差异无显著性。第二部分实验观察到HG的大鼠系膜细胞ERK1/2活性、CTGF蛋白及mRNA表达量较NG明显增高(P<0.01),且系膜细胞内总蛋白量和FN量明显增高(P<0.01);HG+F的ERK1/2 活性和CTGF mRNA及蛋白的表达较HG明显减少(P<0.01),同时系膜细胞内总蛋白量和FN量减少(P<0.01);HG+F+M的上述指标与HG+F比较差异无显著性。结论：氟伐他汀可能通过抑制ERK1/2活性降低肾小球内CTGF表达及FN含量,减轻肾小球肥大,起到抑制和延缓DN进展的作用。     

螺内酯对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞PAI-1表达的抑制作用

目的 观察醛固酮拮抗剂--螺内酯对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)表达的影响.方法 采用正常糖(NG)、高糖(HG)及HG+不同浓度螺内酯体外培养大鼠系膜细胞.以RT-PCR检测PAI-1、醛固酮受体(MR)和保护其配体特异性的11β-羟类固醇脱氢酶2(11β-HSD2)的mRNA表达,采用ELISA检测培养细胞上清中PAI-1蛋白的浓度.结果肾小球系膜细胞表达MR和11β-HSD2 mRNA;高糖刺激系膜细胞后PAI-1 mRNA表达明显升高,培养上清液蛋白浓度增加,加入螺内酯干预后系膜细胞PAI-1 mRNA和蛋白表达明显下降,且随螺内酯浓度增大,作用更明显.结论 螺内酯可能通过降低高糖对系膜细胞PAI-1表达的刺激作用而发挥其肾脏保护作用.     

甘草酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激损伤的影响

目的 探讨甘草酸(GA)对高糖诱导的肾小球系膜细胞氧化应激损伤的影响.方法 将HBZY-1细胞分为:正常对照组(NG组)、高糖组(HG组)、高糖+GA组(HG+GA组).采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性.用紫外分光光度法检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平,用激光共聚焦检测活性氧(ROS)变化.采用免疫组织化学和Westernblot检测锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)蛋白的表达,用Q-PCR检测Mn-SOD mRNA.结果 (1)各组HBZY-1细胞形态变化:HBZY-1细胞为菱形,NG组细胞形态正常,结构清晰可辨;HG+GA组细胞数量略增多,个别细胞胞体略肥大;HG组细胞结构不甚清晰,细胞扁平,数量明显增多,胞体略肥大.(2)各组HBZY-1细胞的增殖效应:与NG组相比,HG组OD值明显升高(P＜0.05),HG+ GA组与HG组相比OD值降低(P＜0.05).(3)RDS含量:HG组RDS相对含量较NG组有所上升,HG+GA组ROS相对含量下降(P＜0.05).(4)各组细胞中Mn-SOD的表达:与NG组相比,HG组Mn-SOD相对表达减少(P＜0.05),HG+GA组与HG组相比Mn-SOD表达升高(P＜0.05).结论 GA对高糖诱导的HBZY-1细胞异常增殖有一定的抑制作用,GA可通过氧化应激保护高糖诱导肾小球系膜细胞所致的细胞肥大和细胞损伤,GA能调节高糖诱导下Mn-SOD的表达.     

高糖诱导的MAPK激活对人肾小球系膜细胞的影响

目的：探讨高精对人肾小球系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性的影响及MAPK在人肾小球系膜细胞的纤维结合蛋白(FN)分泌和c-fos表达中的作用。方法：采用人肾小球系膜细胞进行体外培养，高精作为刺激因素，PD98059作为MAPK特异性抑制剂．同位素示踪法测定MAPK活性．ELISA法测定培养上清中FN含量，免疫细胞化学方法检测c-fos的表达．结果：高糖可增加MAPK活性、促进FN分泌、增加c-fos的表达、抑制MAPK后，可阻止高糖诱导的FN分泌以及c-fos表达：结论：高糖可激活人肾小球系膜细胞内的MAPK，促进FN的分泌，c-fos的表达及导致糖尿病肾病的发生。     

蟾蜍灵对高糖诱导大鼠系膜细胞过表达纤维连接蛋白和结缔组织生长因子的影响

目的:观察不同浓度蟾蜍灵对高糖诱导的大鼠系膜细胞(MC)过表达FN及CTGF的影响,拟探讨其防治糖尿病肾病的可能作用?方法:体外培养MC,将细胞分为5组:正常对照组?高糖组?高糖 + 低浓度蟾蜍灵(5 × 10-9 mol/L)组?高糖 + 中浓度蟾蜍灵(5 × 10-8 mol/L)?高糖+高浓度蟾蜍灵组(5 × 10-7 mol/L)?以台盘兰拒染法检测蟾蜍灵对MC的毒性作用,48 h后,采用RT-PCR法和Western-blot法检测各组MC中FN?CTGF mRNA和CTGF蛋白的表达及其变化?结果:蟾蜍灵在5 × 10-9 ~5 × 10-7 mol/L浓度间对MC无明显细胞毒作用?48 h后,与对照组相比,高糖组CTGF mRNA和蛋白以及FN mRNA表达均显著增加(P < 0.05);高?中?低浓度蟾蜍灵干预能显著降低高糖诱导的上述指标表达,且呈浓度依赖效应(P < 0.05)?结论:蟾蜍灵能部分抑制高糖诱导的MC过表达FN,呈浓度依赖效应,其作用可能部分是通过降低促纤维化因子CTGF合成而实现,提示蟾蜍灵在DN纤维化防治领域具有进一步研究的价值?