Eotaxin和CCR3在哮喘豚鼠肺和骨髓组织的表达及调控

目的:通过观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织Eotaxin/CCR3表达的变化及糖皮质激素对其影响,探讨哮喘及激素干预的可能机制。方法:用卵白蛋白(OVA)致敏法制备豚鼠哮喘模型,分为正常对照组、哮喘组和激素干预(治疗组)组,瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中白细胞比例,免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3的表达;制备豚鼠肺组织病理标本,苏木精-伊红染色,原位分子杂交技术检测肺组织中Eotaxin mRNA,免疫组织化学技术检测Eotaxin在肺组织中的表达。结果:哮喘组骨髓涂片及外周血涂片中嗜酸粒细胞(EOS)比例显著高于对照组及治疗组(P<0.01);与对照组比较,哮喘组肺组织中Eotaxin阳性细胞数与Eotaxin mRNA表达明显增强(P<0.01),且两者呈正相关性(r=0.804,P<0.01)。哮喘组肺组织Eotaxin的表达与EOS的数量呈显著正相关(r=0.795,P<0.01)。哮喘组骨髓涂片中CCR3阳性细胞比例显著高于对照组及治疗组(P<0.01),哮喘组骨髓涂片中CCR3阳性细胞比例和外周血EOS比例呈显著正相关(r=0.736,P<0.05),治疗组与哮喘组比较骨髓中CCR3阳性细胞的比例有显著性下降(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)。结论:哮喘豚鼠肺组织中Eotaxin和骨髓CCR3表达增强,为EOS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能,激素通过下调肺组织Eotaxin及骨髓CCR3的表达,发挥抗EOS性气道炎症的作用。     

miRNA-21在支气管哮喘患儿血清及哮喘小鼠模型肺组织中表达上调

目的探讨miRNA-21在支气管哮喘患儿外周血淋巴细胞及支气管哮喘小鼠模型肺组织中的表达,观察其靶基因PTEN在哮喘小鼠模型肺组织中的表达变化。方法应用real-time PCR方法检测支气管哮喘患儿与正常儿童外周血淋巴细胞miRNA-21的表达,卵蛋白致敏方法建立支气管哮喘小鼠模型,肺泡灌洗液(BALF)细胞计数,HE染色观察气道炎症。应用real-time PCR法检测哮喘组小鼠与对照组小鼠肺组织miRNA-21及其靶基因PTEN的表达,Western blot方法检测哮喘小鼠与对照组小鼠肺组织PTEN蛋白的表达。结果支气管哮喘患儿外周血淋巴细胞miRNA-21表达水平显著高于正常儿童(P0.01)。哮喘小鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数及肺组织炎症细胞浸润显著高于正常对照组,哮喘组小鼠肺组织miRNA-21mRNA表达水平显著高于正常对照,PTEN mRNA与蛋白水平明显低于正常对照组(P0.01)。结论 miRNA-21在支气管哮喘患儿及支气管哮喘小鼠模型中高表达,表明其可能参与支气管哮喘的发病机制。     

支气管哮喘豚鼠肺组织中丝裂原活化蛋白激酶对γ-谷氨酰半胱氨酸合酶的作用

目的： 研究在支气管哮喘豚鼠肺组织中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路对γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）的影响。方法: 成年雄性豚鼠20只随机分成哮喘组和对照组，每组10只，以腹腔内注射联合雾化吸入卵蛋白复制哮喘模型。测支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞总数并进行分类计数；原位杂交和RT-PCR测肺组织中γ-GCS-h mRNA表达；免疫组化测γ-GCS、磷酸化细胞外激活蛋白激酶（p-ERK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和磷酸化 p38（p-p38）在肺组织中的表达;Western blotting 测 p-ERK、p-JNK和p-p38在肺组织中的表达；双酶法测γ-GCS的活性。结果: （1）哮喘组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞明显多于对照组 (P<0.01)。（2）免疫组化显示肺组织中p-ERK、p-p38、p-JNK和γ-GCS 蛋白质表达哮喘组明显高于对照组（P<0.01）；Western blotting 亦显示肺组织中p -ERK、p-JNK和p-p38 蛋白质表达哮喘组均明显高于对照组。（3)原位杂交和RT-PCR显示在肺组织中γ-GCS-h mRNA 表达哮喘组明显高于对照组(P<0.01)。（4) γ-GCS活性哮喘组明显高于对照组（P<0.01）。（5）直线相关性分析显示：在肺组织中p-ERK、p-p38与γ-GCS-h mRNA、γ-GCS蛋白质呈显著正相关，p-JNK与γ-GCS-h mRNA、γ-GCS蛋白质无明显相关性。结论: 支气管哮喘豚鼠肺中 p-ERK、p-p38、p-JNK和γ-GCS表达均增加；p-ERK和p-p38可能上调γ-GCS表达。     

白细胞介素23在哮喘小鼠动物模型中表达的研究

目的:研究IL-23在哮喘小鼠模型中的表达。方法:构建动物模型,分为正常组、哮喘组,应用ELISA法检测两组小鼠外周血IL-23水平、RT-PCR法检测肺组织中IL-23p19mRNA表达、免疫组化法检测肺组织中IL-23表达;分离小鼠脾脏T淋巴细胞进行体外培养,应用RT-PCR法检测小鼠脾脏T淋巴细胞内IL-23p19mRNA表达水平、Western blot检测IL-23p19蛋白表达情况。结果:血清IL-23水平较正常对照组高(P<0.01),肺组织中IL-23p19mRNA及IL-23蛋白表达均较正常组高(P<0.01),哮喘组脾脏T淋巴细胞内IL-23p19mRNA及IL-23p19蛋白表达水平均较正常组高(P<0.01),有统计学意义。结论:哮喘小鼠中,IL-23在血清、肺组织、脾脏T淋巴细胞中表达均较正常小鼠明显增高,提示IL-23参与哮喘发病,且可能通过调控T淋巴细胞的功能而发挥作用。     

哮喘小鼠肺组织中转录因子RORγt的表达与气道炎症的关系

目的:探讨Th17细胞转录因子RORγt在支气管哮喘小鼠肺组织中的表达及其与哮喘气道炎症的关系.方法:采用卵清蛋白(OVA)致敏方法建立支气管哮喘小鼠模型;BALB/c小鼠30只随机分为对照组、哮喘组、地塞米松治疗组各10只.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测小鼠肺泡灌洗液(BALF)、血清中白细胞介素17(IL-17)水平;HE染色评价各组小鼠气道炎症情况;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺组织IL-17、RORγt mRNA表达水平;免疫印记(Western blot)方法检测肺组织RORγt蛋白表达水平.结果:哮喘组小鼠肺组织RORγt mRNA、蛋白水平及IL-17水平均明显高于对照组和地塞米松治疗组(P＜0.05),RORγt蛋白表达量与嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数、BALF、外周血中IL-17含量、肺组织IL-17 mRNA表达量均呈正相关关系(r＝0.789、0.795、0.902、0.669、0.806、0.883,P值均＜0.01).结论:RORγt在支气管哮喘小鼠肺组织呈高表达,其表达水平与气道炎症密切相关,参与了哮喘气道炎症的发生过程.     

端粒酶逆转录酶在野百合碱性大鼠肺动脉高压中的作用

目的:观察端粒酶逆转录酶(TERT)在野百合碱(MCT)性肺动脉高压(PH)大鼠模型中的肺组织中的表达变化。方法:用MCT复制大鼠慢性PH病理模型,用电磁血流量计观察肺血流动力学指标变化,用免疫组化法和图像分析技术测定肺组织中TERT的表达。结果:发现TERT可在大鼠肺血管平滑肌、支气管平滑肌和软骨组织中表达,并且MCT组肺组织中TERT表达较正常组呈明显阳性。结论:MCT性PH时TERT在肺血管平滑肌、支气管平滑肌的过度表达在MCT性PH的发病机制中可能具有重要意义。     

雷公藤对哮喘豚鼠外周血淋巴细胞IL—5,粒细胞—巨噬细胞 …

目的探讨哮喘豚鼠白介素-5(IL-5)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及CD4+和CD8+T细胞在哮喘发病中的作用及雷公藤的干预作用.方法实验分为哮喘组、雷公藤治疗组(处理组)和对照组,每组各10只豚鼠,采用原位杂交方法检测豚鼠外周血淋巴细胞的IL-5、GM-CSFmRNA表达;应用免疫细胞化学方法检测外周血淋巴细胞CD4+和CD8+的表达.结果哮喘组外周血淋巴细胞IL-5、GM-CSF-mRNA表达均明显高于处理组和对照组(P＜0.01),而处理组和对照组无显著差异.哮喘组外周血淋巴细胞CD4+表达明显高于对照组和处理组(P＜0.01),CD8+表达低于对照组和处理组(P＜0.05).结论哮喘豚鼠外周血淋巴细胞IL-5、GM-CSFmRNA表达增高、CD4+表达增高,CD8+表达降低,而雷公藤甲素可降低外周血淋巴细胞IL-5、GM-CSFmRNA表达,并可提高CD8+表达,降低CD4+表达.表明雷公藤可能在抗哮喘气道炎症中发挥一定作用.     

miR-200C与miR-16在哮喘患儿血清及哮喘小鼠肺组织中的表达上调

目的探讨miR-200C与miR-16在支气管哮喘患儿外周血淋巴细胞及支气管哮喘小鼠模型肺组织中的表达。方法应用real-time PCR方法检测支气管哮喘患儿与正常儿童外周血淋巴细胞miR-200C与miR-16的表达,卵蛋白致敏方法建立支气管哮喘小鼠模型,肺泡灌洗液(BALF)细胞计数,HE染色观察气道炎症。应用real-time PCR法检测哮喘组小鼠与对照组小鼠肺组织miR-200C与miR-16的表达。结果与正常儿童相比,支气管哮喘患儿外周血淋巴细胞miR-200C与miR-16表达水平显著升高(P0.01)。哮喘小鼠模型组BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数,炎症细胞浸润,肺组织miR-200C与miR-16表达水平显著高于正常对照组(P0.01)。结论miR-200C与miR-16在支气管哮喘患儿及支气管哮喘小鼠模型中高表达。     

豚鼠哮喘模型核因子-κB的表达特点及灯盏花素对其作用的研究

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)在豚鼠哮喘模型中的表达特点以及蛋白激酶C(PKC)抑制剂灯盏花素对其表达的影响。方法:将48只豚鼠随机分为正常对照组、哮喘即刻激发组、哮喘发作1周组、哮喘发作2周组、灯盏花素治疗1周组和治疗2周组等6组,每组8只,测定肺功能并观察气道壁嗜酸性粒细胞(EOS)浸润情况;用免疫组织化学染色方法观察NF-κB在豚鼠肺组织中的表达变化。结果:NF-κB主要表达于气道上皮细胞,哮喘各组NF-κB的表达水平均显著高于正常对照组(P＜0101),治疗2周组NF-κB的表达水平显著低于哮喘各组(P＜0.01)。NF-κB的表达水平与气道阻力及气道壁EOS计数均呈显著正相关(P＜0101)。结论:哮喘豚鼠气道上皮细胞NF-κB的表达水平显著高于正常豚鼠,提示NF-κB可能参与哮喘的发病过程;PKC抑制剂灯盏花素能显著降低哮喘豚鼠气道上皮细胞NF-κB的表达水平,提示PKC可能通过NF-κB的作用参与哮喘的发病机制。     

慢性吸烟对哮喘豚鼠肺内神经激肽A含量及基因表达的影响研究

目的：研究慢性吸烟对哮喘豚鼠肺组织中神经激肽A（NKA）含量及NKA mRNA表达的影响，探讨慢性吸烟对哮喘肺组织中NKA含量影响的机制。方法： 用卵蛋白超声雾化法复制豚鼠哮喘模型；随机分成：①诱喘前吸烟2周组，②诱喘后吸烟2周组，③诱喘后2周对照组（非吸烟），④常规诱喘组（非吸烟），⑤正常对照组。用酶联免疫法检测各组肺组织中NKA含量；用RT-PCR方法检测各组肺组织中NKA mRNA的相对含量。结果： ①哮喘豚鼠肺组织中NKA含量及NKA mRNA表达均明显高于正常豚鼠（均P<0.01）；②诱喘前吸烟2周豚鼠，诱喘后其肺组织中NKA含量及NKA mRNA表达均明显高于非吸烟诱喘豚鼠（均P<0.01）；③诱喘后吸烟2周豚鼠，其肺组织中NKA含量及NKA mRNA表达均显著高于诱喘后2周对照豚鼠（均P<0.01）。结论： 结果提示：①NKA可能参与了卵蛋白诱发的豚鼠哮喘发病机制；②慢性吸烟刺激可能增加哮喘豚鼠肺组织中NKA含量； ③慢性吸烟刺激可能具有在转录水平上调NKA mRNA表达的作用而导致肺内NKA蛋白含量增多。     

Anti IgE-induced asthma in guinea pigs; a new model for asthma. Physiological and pathological studies

We established an experimental animal model for IgE-mediated asthma by the use of intravenous injection of rabbit anti guinea pig IgE in normal guinea pigs. The degree of asthmatic airway obstruction was quantitatively estimated by Mead's apparatus which enabled us to use unanesthetized guinea pigs. With the injection of anti IgE, only an early asthmatic response was observed. Inhalation of anti IgE did not trigger asthma. Histo-pathological changes in the lung obtained immediately after the injection of anti IgE resembled those reported in human asthma. This system may be used for pathological and pharmacological studies of the IgE-dependent early asthmatic response.     

地塞米松对哮喘豚鼠肺组织嗜酸细胞bcl-2表达的影响及意义

目的 研究哮喘豚鼠肺内不同密度嗜酸细胞（Eos）凋亡与bcl-2 mRNA表达的关系及地塞米松（DM）对它们的影响。方法 应用DM干预哮喘豚鼠,分离哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中不同密度Eos,以TUNEL法检测细胞凋亡,以原位杂交检测bcl-2 mRNA表达。结果 哮喘组Eos凋亡率较正常组明显降低（P〈0．01）,应用DM后均显著增加（P〈0．01）。正常豚鼠Eos可检测到bcl-2 mRNA表达,不同密度Eos表达无显著差异（P〉0．05）。哮喘组bcl-2mRNA明显增加,应用DM后其表达明显减少。结论凋亡调节的缺失是导致组织及血中Eos增多的重要原因,bcl-2参预了哮喘Eos凋亡的调节。DM可促进哮喘肺组织中的Eos细胞凋亡,bcl-2可能是DM调节Eos细胞凋亡的重要途径之一。     

黄芪对豚鼠哮喘模型血红素氧合酶—1表达的影响

用免疫组织化学染色方法观察血红素氧合酶-1（HO-1）在哮喘豚鼠肺组织中的表达变化，测定全血一氧化碳血红蛋白（COHb)的百分比含量并观察气道壁嗜酸性粒细胞（EOS）浸润情况，以探讨黄芪对哮喘豚鼠HO-1表达的影响。发现HO-1主要表达在气道上皮细胞，哮喘各组HO-1的表达水平均显著高于正常组（P＜0.01)。黄芪治疗后HO-1的表达水平显著低于哮喘各组（P＜0.01)。可见黄芪能显著抑制哮喘豚鼠气道上皮细胞HO-1的表达，提示黄芪抑制细胞HO-1的表达可能是黄芪治疗哮喘的作用机制之一。     

哮喘豚鼠下呼吸道及内脏传入部位NGF表达的研究

目的　探讨哮喘豚鼠下呼吸道和内脏传入系统神经生长因子 (NGF)的作用。　方法　利用免疫组织化学和原位杂交结合显微图像分析 ,研究哮喘豚鼠下呼吸道和内脏传入系统NGF免疫反应及mRNA表达的变化。　结果　与对照组相比 ,哮喘豚鼠NGF免疫反应在气道上皮、C7～T5段脊神经节及脊髓背角明显上调 (P <0 0 1) ,NGFmRNA表达在气道上皮明显增多 (P <0 0 1) ,而在C7～T5段脊神经节及脊髓背角却未见明显改变。　结论　气道上皮、C7～T5段脊神经节及对应节段脊髓背角的NGF可能参与哮喘的发病过程 ;C7～T5段脊神经节细胞及对应节段脊髓背角神经细胞本身能合成NGF。     

原癌基因c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)在哮喘发病中作用的实验观察

目的：观察原癌基因c-myc、增殖细胞核抗原（PCNA）在正常和哮喘豚鼠气道肺组织中的表达与哮喘发病的关系。方法：应用Dot和Northen分子杂交和免疫组化技术。结果：c-mycmRNA及PCNAmRNA在正常豚鼠气道及肺组织可见低度表达。豚鼠哮喘发作后。c-myc及PCNAmRNA增高,30min达高峰分别为正常的3．51．4倍（P＜0．05）,免疫组化显示c-myc与PCNA蛋白主要分布在气道上皮细胞,平滑肌细胞,其分布及密度无显著差别。结论：c-myc及PCNA基因表达增高在哮喘病理过程中可能起重要作用。     

微卡对哮喘豚鼠肺组织嗜酸粒细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响

目的：研究微卡对哮喘豚鼠肺组织嗜酸粒细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响。 方法： 30只豚鼠随机分为生理盐水组、哮喘组及微卡组，每组10只。微卡组每只豚鼠在OVA致敏前10 d肌注22.5 μg微卡。应用TUNEL法检测肺组织嗜酸粒细胞的凋亡，免疫组化法检测肺组织Bcl-2蛋白的表达。 结果： 微卡组豚鼠肺组织嗜酸粒细胞凋亡指数（23.78±5.42）%显著高于哮喘组（4.56±0.68）%(P<0.01)；肺组织Bcl-2蛋白平均积分吸光度值（1 556.3±492.4）显著低于哮喘组（2 321.9±751.2）（P<0.05）。 结论： 微卡能诱导哮喘豚鼠肺组织嗜酸粒细胞凋亡，可能与其抑制Bcl-2蛋白在哮喘豚鼠肺组织的表达有关。     

哮喘支气管黏膜中类胰蛋白酶的表达增强

目的 观察含类胰蛋白酶的肥大细胞在豚鼠支气管黏膜的表达和分布特征。方法 Dunkin Hartley豚鼠随机分为哮喘组(A组)和生理盐水组(B组)。用100m/mL卵蛋白进行致敏，并于致敏后第5周行抗原特异性支气管激发试验。激发后2h取各组豚鼠支气管组织标本，免疫组化染色以抗人类胰蛋白酶(Tryptase)单克隆抗体(AAl)为一抗，过氧化物酶标记的绵羊抗鼠IgG为二抗，并用联苯二胺(Diaminobenzidine，DAB)显色。仅选择阳性染色细胞进行计数。结果 鼠抗人Trvptase单克隆抗体即可识别人支气管Tryptase又可识别豚鼠支气管Tryptase。哮喘支气管组织中Tryptase阳性细胞数明显多于正常支气管组织。相似地，支气管激发试验后的豚鼠支气管组织中的肥大细胞数要比生理盐水吸入组多出2．0倍以上。结论 抗人Tryptase单克隆抗体可以用于识别豚鼠支气管的肥大细胞。哮喘者和激发试验阳性的豚鼠支气管肺组织中的Tryptase阳性肥大细胞数明显多于正常支气管组织，表明肥大细胞在支气管哮喘发病机制中可能起重要作用。