维生素C对TNF-α及血清剥夺诱导的人髓核细胞凋亡的作用

目的探讨维生素C(Vitamin C,Vit C)在TNF-α及血清剥夺诱导人椎间盘髓核细胞凋亡中的作用及机制。方法取脊柱矫形手术患者的髓核组织,消化法获得正常髓核细胞,取第3代细胞按不同处理因素分为Vit C作用组(A组)、TNF-α诱导组(B组)和血清剥夺组(C组),每组再分为以下亚组:A组分为A1组(基础培养液)、A2组(100μg/m L Vit C)、A3组(200μg/m L Vit C);B组分为B0组(对照组)、B1组(100 ng/m L TNF-α)、B2组(100μg/m L Vit C+100 ng/m L TNF-α)、B3组(200μg/m L Vit C+100 ng/m L TNF-α);C组分为C0组(对照组)、C1组(FBS浓度由8%降低为2%)、C2组(2%FBS+100μg/m L Vit C)、C3组(2%FBS+200μg/m L Vit C)。各组作用24 h后,采用流式细胞术检测各组膜联蛋白V、碘化丙啶双染后髓核细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测p53(基因编码相对分子质量为53×103的蛋白质)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Sox9和糖胺多糖(Aggrecan)m RNA表达。结果 A组:与A1组比较,A2、A3组的Vit C均能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达(P0.05),但A2、A3组间比较差异无统计学意义(P0.05);A2、A3组的Vit C可促进髓核细胞Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Aggrecan、Sox9 m RNA表达,且A3组促进作用显著大于A2组(P0.05)。B组:与B0组比较,B1组TNF-α促进了髓核细胞凋亡,增加了髓核细胞p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达(P0.05);与B1组比较,B3组的Vit C能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达,而B2组的Vit C则增加其凋亡及p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达,差异均有统计学意义(P0.05)。C组:与C0组比较,C1组2%FBS能诱导髓核细胞凋亡,但降低了髓核细胞p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达(P0.05);与C1组比较,C3组的Vit C能降低髓核细胞凋亡及p53、FAS、Caspase 3 m RNA表达,而C2组的Vit C则增加其凋亡及p53、FAS m RNA表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论 Vit C能延缓或降低髓核细胞凋亡、促进细胞外基质合成与分泌,200μg/m L Vit C可延缓或降低100 ng/m L TNF-α和2%FBS诱导的凋亡,而100μg/m L Vit C则促进其诱导的凋亡。     

CDMP-1诱导骨髓间充质干细胞分化成髓核细胞的实验研究

目的探讨软骨衍生形态发生蛋白-1(CDMP-1)能否诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核细胞分化,并检测其诱导的细胞是否具有髓核细胞分泌细胞外基质的功能。方法 BMSCs采用0 ng/ml(对照组)以及10 ng/ml(观察组)的CDMP-1处理,将正常椎间盘髓核细胞作为阳性对照组。BMSCs诱导后采用PCR检测Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因水平表达,用Western Blot法检测Ⅱ型胶原蛋白水平的表达。采用阿尔辛蓝染色及定量比较蛋白多糖含量的变化。结果 PCR检测结果发现,观察组和对照组中Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原均有增加,而阳性对照组中Ⅱ型胶原明显比观察组更少。基因水平检测结果发现,CDMP-1诱导BMSCs分化后Ⅱ型胶原基因表达比正常髓核细胞还高。观察组中Ⅱ型胶原的蛋白水平表达明显比阳性对照组和对照组细胞更高,对照组中Ⅱ型胶原蛋白水平表达几乎很少。阿尔辛蓝染色结果发现,观察组蛋白多糖含量稍高于阳性对照组,但差异无统计学意义(P0.05);阳性对照组与观察组蛋白多糖含量均高于对照组,差异有统计学意义(P 0.05)。结论 CDMP-1能够诱导BMSCs向髓核细胞分化,具有髓核细胞分泌细胞外基质的功能。     

转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1对体外培养人退变髓核细胞生物学活性的影响

目的：观察在体外培养条件下转化生长因子β1（TGF-β1）和胰岛素样生长因子1（IGF—1）对人退变髓核细胞生物学活性的影响。方法：体外培养人退变髓核细胞，台盼蓝染色法测定活细胞率。将每份髓核细胞样本分为对照组、TGF-β1组和TGF-β1＋IGF—1组。采用考马斯亮蓝法测定TGF—β1和IGF—1干预后第0、2、4、6天细胞内总蛋白含量。采用免疫组织化学和免疫荧光化学染色方法测定细胞在TGF-β1和IGF-1干预后0～6d合成Ⅱ型胶原的情况。结果：体外培养人退变髓核细胞的活细胞率为90％～95％。干预后第4、6天TGF-β1组和TGF-β1＋IGF—1组与对照组比较、TGF-β1＋IGF—1组与TGF-β1组比较细胞内总蛋白含量均显著增加（P〈0.05），TGF—β1＋IGF—1组Ⅱ型胶原的合成较对照组显著增加（P〈0．05）；干预后第6天TGF—β1组和TGF-β1＋IGF—1组与对照组比较、TGF-β1＋IGF—1组与TGF-β1组比较Ⅱ型胶原均显著增加（P〈0.05）。结论：一定浓度的TGF-β1能够促进人退变髓核细胞合成Ⅱ型胶原，改善其生物学活性，合用TGF-β1和IGF—1上述作用更加明显。     

人转化生长因子β1重组腺病毒转染传代髓核细胞对细胞外基质合成的影响

目的探讨人转化生长因子融（transforming growthfactorβ，TGF-β1）对传代羊髓核细胞的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和DNA合成调节因子的作用。方法取1岁龄成年山羊腰椎间盘，体外分离培养羊髓核细胞，传至第3代后以携人TGF-β1（humanTGF-β1，hTGF-β1）或lacZ基因的复制缺陷型腺病毒（Ad／hTGF—β1及Ad／lacZ）感染，分别为实验组和阴性对照组；未加病毒液的细胞为空白对照组；原代髓核细胞为原代组。然后继续单层或藻酸钙凝胶三维（3-D）培养10d。对两种系统培养的细胞分别行DNA荧光定量、Westernblot分析和蛋白多糖（glycosaminoglycan，GAG）定量检测。结果DNA荧光定量显示，单层培养时实验组细胞的DNA合成显著高于两对照组（P〈0．05），藻酸钙凝胶3-D培养各组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。Western blot检测hTGF—β1、Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原和Aggrecan的表达显示，两种培养系统中，实验组hTGF—β1、Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达均显著高于两对照组（P〈0．05），Ⅰ型胶原的表达显著低于两对照组（P〈0．05），实验组Ⅱ型胶原／Ⅰ型胶原比值较两对照组显著增高（P〈0．05）。GAG定量结果显示，两种培养系统中实验组细胞的GAG合成均显著高于两对照组（P〈0．05）。结论hTGF-β1在很大程度上可起到维持髓核细胞表型，并在细胞传代后仍发挥表型的调节作用。通过基因工程方法使髓核细胞表达hTGF—β1，有望遏制、甚至逆转椎间盘退变；而以Ad／hTGF—β1感染过的髓核细胞，在藻酸钙凝胶3-D培养系统中培养则表现出原始表型。     

沉默p53和p21基因延缓髓核细胞衰老退变实验研究

目的髓核细胞衰老凋亡是椎间盘退行性变的病理基础,探讨髓核细胞表型分子及延缓髓核细胞衰老退变的机制。方法原代培养8～10周龄雄性SD大鼠髓核细胞,免疫细胞化学染色鉴定髓核细胞表型分子低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、HIF-1β、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)及Ⅱ型胶原表达。小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)瞬时转染髓核细胞沉默p53、p21后行RT-PCR及Western blot检测沉默效率,siRNA转染前后细胞衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-gal)染色检测髓核细胞衰老变化,流式细胞仪检测髓核细胞周期变化,MTT法生长曲线分析髓核细胞增殖变化。结果免疫细胞化学染色显示髓核细胞表达HIF-1α、HIF-1β、MMP-2及Ⅱ型胶原。第35代髓核细胞转染p53、p21 siRNA后RT-PCR及Western blot检测示p53、p21表达明显受到抑制。第35代髓核细胞SA-β-gal染色阳性率明显高于第1代髓核细胞(P<0.001);正常第35代髓核细胞经p53 siRNA(p53转染组)和p21 siRNA(p21转染组)转染后,SA-β-gal阳性率明显低于正常第35代髓核细胞(正常组)和加入脂质体LipofectaminTM2000而无siRNA的第35代髓核细胞(阴性对照组),差异有统计学意义(P<0.001)。细胞周期分析显示,p53转染组及p21转染组G1期百分比均明显低于正常组和阴性对照组(P<0.05),S期百分比明显高于正常组和阴性对照组(P<0.05)。MTT生长曲线显示转染p53、p21 siRNA后可促进髓核细胞增殖。结论沉默p53、p21基因可通过调节细胞周期而抑制髓核细胞衰老退变,改善椎间盘退变过程;沉默p53、p21基因可能是潜在的治疗椎间盘退行性变的方法。     

腺相关病毒载体介导hTGFβ1、β3体外转染退变腰椎间盘细胞的生物学效应

目的比较研究腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体介导人转化生长因子β1（human transforming growth factor β1,hTGFβ1）与hTGFβ3逆转兔腰椎间盘细胞退变的生物学效应.方法分离、培养兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,并传代建立退变早、晚期细胞模型.采用荧光标记的pSNⅡ型腺相关病毒（pSNAV2）,分别检测其对不同退变程度兔腰椎间盘细胞的转染效率,并在此基础上应用pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3转染不同退变程度的兔腰椎间盘细胞.通过细胞形态、胶原的免疫组织化学染色和35S标记蛋白多糖等方法,检测比较pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3对于退变早、晚期兔腰椎间盘细胞基质合成的影响.结果pSNAV2可高效转染退变早期兔腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞,而对于退变晚期兔腰椎间盘细胞的转染效率低.hTGFβ1和hTGFβ3可显著促进退变早期兔腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,其中hTGFβ1的作用较hTGFβ3强.hTGFβ1可促进退变早、晚期兔腰椎间盘纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成.hTGFβ3可促进退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原的合成.结论pSNAV2-hTGFβ1和pSNAV2-hTGFβ3可促进退变早期兔腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成以及纤维环细胞Ⅰ型胶原的合成,从而延缓和逆转椎间盘退变.对于退变晚期兔腰椎间盘髓核细胞,hTGFβ3可促进Ⅱ型胶原的合成.     

兔髓核细胞体外培养和重组人转化生长因子-β1对其代谢影响的研究

目的：探讨体外单层和立体培养兔髓核细胞时的变化及重组人转化生长因子-β1（rhTGF-β1，10ng／ml）对其代谢的影响。方法：体外培养兔髓核细胞，分为3组。A组，单层培养组；B组，Ⅱ型胶原支架立体培养组；C组，Ⅱ型胶原支架立体培养＋rhTGF-β1（10ng／m1）组。利用倒置显微镜、扫描电镜、RT-PCR、^3H-proline掺入法观察髓核细胞形态学、基因表达水平和总胶原合成的变化。结果：B、C组兔髓核细胞由A组的多角形转为类圆形；与A组相比，B组Ⅱ型胶原、集聚蛋白多糖基因表达水平升高（P〈0．05），总胶原合成升高（P〈0．01）。与B组相比，C组Ⅱ型胶原、集聚蛋白多糖、核心蛋白多糖基因表达水平增高（P〈0．01、P〈0．01、P〈0．05），总胶原合成升高（P〈0．01）。结论：兔髓核细胞由单层培养转到Ⅱ型胶原支架上培养时其基因表达和总胶原合成增强。rhTGF-β1（10ng／ml）增强立体培养的兔髓核细胞基因表达和总胶原合成。     

缺氧诱导因子1α调控wnt/β-catenin信号通路对常氧条件下大鼠髓核细胞衰老的作用及机制

【摘要】 目的：探究缺氧诱导因子1α（HIF-1α）调控wnt/β-catenin信号通路对常氧培养下大鼠髓核细胞衰老的影响及作用机制。方法：取5只4周龄雌性SD大鼠，提取鼠尾髓核原代细胞进行研究。（1）将髓核细胞分为5组：转染对照组[用磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理髓核细胞]、空载腺病毒组（用空载腺病毒处理髓核细胞）、过表达HIF-1α组（用载过表达HIF-1α质粒的腺病毒处理髓核细胞）、空载siRNA组（用空载siRNA处理髓核细胞）、敲减HIF-1α组（用siRNA敲减HIF-1α处理髓核细胞），在常氧下培养48h后，免疫蛋白印迹（western blot，WB）检测HIF-1α和衰老相关基因p53、p21、p16，β-gal染色检测细胞衰老，评估常氧条件下HIF-1α对于髓核细胞衰老的影响。（2）取髓核细胞，分为空载腺病毒组、过表达HIF-1α组、空载siRNA组、敲减HIF-1α组，处理方式同前，在常氧下培养48h后，WB检测HIF-1α、GSK-3β和β-catenin通路的表达。取髓核细胞，分为对照组（用PBS处理髓核细胞）、过表达HIF-1α组（用载过表达HIF-1α质粒的腺病毒处理髓核细胞）、XAV-939组（用XAV-939处理髓核细胞）、XAV-939+过表达HIF-1α组（用XAV-939+载过表达HIF-1α质粒的腺病毒处理髓核细胞），WB检测HIF-1α、p53、p21、p16和wnt/β-catenin的表达，β-gal染色检测细胞衰老，以检测HIF-1α与wnt/β-catenin信号通路的关系以及对髓核细胞衰老的影响。结果：（1）腺病毒转染HIF-1α后，与转染对照组和空载腺病毒组相比，过表达HIF-1α组HIF-1α表达增加（P<0.05）。小干扰RNA转染HIF-1α后，与转染对照组和空载siRNA组相比敲减HIF-1α组HIF-1α表达降低（P<0.05）。WB结果显示，与空载腺病毒组相比过表达HIF-1α组HIF-1α表达增加（P<0.05），而p53、p21和p16表达降低（P<0.05），与空载siRNA组相比敲减HIF-1α组HIF-1α表达降低（P<0.05），而p53和p16表达增加（P<0.05）。β-gal染色显示，在常氧条件下培养48h，与空载腺病毒组相比，过表达HIF-1α组衰老细胞降低（P<0.05），与空载siRNA组相比，敲减HIF-1α组衰老细胞数量则增加（P<0.001）。（2）与空载腺病毒组相比，过表达HIF-1α组β-catenin表达升高（P＜0.01），同时GSK-3β表达降低（P＜0.05）。与空载siRNA组相比敲减HIF-1α组β-catenin表达降低（P＜0.0001），同时GSK-3β表达升高（P＜0.05）。与对照组相比，XAV-939组β-catenin表达降低（P<0.001），p53、p21和p16的表达升高，XAV-939+过表达HIF-1α组β-catenin表达降低（P<0.05），p21表达升高（P<0.05）。与过表达HIF-1α组相比XAV-939+过表达HIF-1α组衰老细胞数增加（P<0.001），与对照组相比过表达HIF-1α组的细胞核内β-catenin表达更多，而XAV-939组和XAV-939+过表达HIF-1α组则相对较少（P<0.05）。结论：HIF-1α通过激活wnt/β-catenin信号通路抑制常氧条件培养下大鼠髓核细胞的衰老。     

雌激素受体在椎间盘组织中的表达及意义

【摘要】 目的：通过观察雌激素α、β受体在正常与退变的人椎间盘组织的表达,探讨雌激素受体（ER）与椎间盘退变的关系。方法：根据改良Pfirrmann分级将收集的椎间盘组织分为三组：对照组,外伤导致腰椎爆裂性骨折手术取出的正常髓核组织（Pfirrmann分级1~2级）;观察组,女性腰椎滑脱及腰椎间盘突出症手术取出的退变髓核组织,Pfirrmann分级3～4级为A组,5级为B组。用HE染色法观察对照组和A、B组各15例人腰椎椎间盘髓核组织及髓核细胞的形态学变化;用免疫组织化学染色法（Elivison二步法）检测对照组和A、B组髓核组织中ER-α、ER-β的表达;采用Western-blot法检测对照组和观察组髓核组织中ER-α、ER-β的表达。结果：HE染色示对照组髓核组织中髓核细胞分布均匀,形态完整,未见明显细胞凋亡现象,细胞外基质染色鲜亮,分布均匀;A、B两组髓核细胞分布不均匀,形态不规则,凋亡现象明显,细胞核增大,染色深,细胞外基质减少,色彩灰暗,B组较A组更为明显。免疫组织化学染色示ER-α、ER-β在对照组的髓核组织见有明显棕黄色颗粒,在A、B两组表达减少,以ER-β减少最显著,经统计学分析,A、B两组与对照组间ER-β的表达有显著性差异（P＜0.01）,ER-α的表达较对照组无统计学差异（P＞0.05）,其中A组和B组间无明显差异（P＞0.05）。Western-blot方法检测,ER-α表达A组（0.876±0.058）、B组（0.757±0.045）较对照组（0.885±0.036）降低,但无统计学差异（P>0.05）;ER-β表达A组（0.947±0.043）、B组（0.626±0.042）较对照组（1.275±0.150）显著降低（P＜0.01）,B组较A组表达明显减少（P＜0.01）。结论：在人的髓核组织中的髓核细胞（类软骨细胞）的胞核和胞浆中均存在ER。ER-α、ER-β在退变的椎间盘组织都明显减少,以ER-β最为明显,提示雌激素可能通过ER-β的介导对髓核细胞功能起调控作用。     

白藜芦醇通过Wnt/β-catenin信号通路调控髓核细胞细胞外基质表达

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)表达的调控作用及其相关分子机制。方法选取临床上接受椎间盘摘除术的10例患者,其中5例为年轻脊柱爆裂骨折患者,作为对照组;余5例为老年腰椎间盘突出症患者,作为退变组。取两组患者髓核组织,免疫组织化学染色比较β-catenin的原位表达,Western blot检测β-catenin、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白表达。取退变组髓核组织分离、培养NPC,分别用IL-1β单独(B组)或联合RES(C组)刺激第3代NPC,并设未刺激细胞作为空白对照组(A组),Western blot检测Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达。进一步采用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)靶向沉默SIRT1和β-catenin后,采用Western blot、实时荧光定量PCR检测β-catenin、SIRT1蛋白和基因表达。用完全培养基(1组)、IL-1β(2组)、RES+IL-1β(3组)、SIRT1-si RNA+RES+IL-1β(4组)刺激第3代NPC培养24 h后,细胞免疫荧光染色检测β-catenin核转位情况;用完全培养基(Ⅰ组)、IL-1β(Ⅱ组)、IL-1β+β-catenin-si RNA(Ⅲ组)、IL-1β+RES(Ⅳ组)、IL-1β+RES+SIRT1-si RNA(Ⅴ组)刺激第3代NPC培养24 h后,采用Western blot检测Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达。结果免疫组织化学染色及Western blot检测示,与对照组比较,退变组髓核组织中β-catenin阳性表达的细胞比例显著升高(t=4.616,P=0.010);β-catenin蛋白相对表达量显著升高,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白相对表达量显著下降(P0.05)。细胞学实验发现,B组β-catenin蛋白相对表达量显著高于A、C组,Ⅱ型胶原和Aggrecan相对表达量显著低于A、C组(P0.05)。si RNA转染后,Western blot检测显示SIRT1、β-catenin蛋白表达显著降低(P0.05)。细胞免疫荧光染色结果进一步提示与3组相比,4组SIRT1被si RNA沉默后,RES减弱的β-catenin核转位现象加剧。Western blot检测示,Ⅱ组Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅰ组明显降低(P0.05);Ⅲ组NPC转染β-catenin-si RNA后,IL-1β对ECM的降解作用被明显抑制,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅱ组明显升高(P0.05);Ⅴ组NPC转染SIRT1-si RNA后,抑制了RES对ECM降解的保护作用,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅳ组明显降低(P0.05)。结论 RES可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路维持NPC ECM的表达,为椎间盘退行性疾病的治疗提供了新思路。     

CDMP-1逆转人退变椎间盘髓核细胞的实验研究

[目的]通过CDMP-1促进退变髓核细胞外基质合成来逆转椎间盘退变.[方法]分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第3代髓核细胞,应用CDMP-l分组进行干预实验.A组为对照组,B组和C组为实验组,B组加人100ng/ml CDMP-1,C组加入200ng/rnl CDMP-1.采用光学相差显微镜及透射电镜对对照组和实验组细胞形态和超微结构进行对比观察:XTT-PMS法检测各组髓核细胞12d的生长曲线,研究三组细胞间的生长动力学差异;实时荧光定量PCR检测髓核细胞,7,14,21d Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达.[结果]光学相差显微镜及透射电镜示:两剂量实验组形态学上没有明显差异,与对照组相比,CDMP-1实验组能较好的维持髓核细胞生物形态学特性,延长退变髓核细胞的衰老;三实验组12d的生长曲线一致,两剂量的CDMP-1没有增加退变髓核细胞的增殖;实时荧光定量PCR示100ng/ml CDMP-1组:Ⅱ型胶原mRNA表达总体均数及3个时间点均高于另外两组任一时间点(P<0.05);糖胺多糖mRNA表达总体均数及14、21d 2个时间点均高于另外两组相应时间点(P<0.05),且Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA表达量随刺激时间增加而增加.200 ng/ml CDMP-1组:提高了糖胺多糖mRNA表达水平的同时,却降低了Ⅱ型胶原mRNA水平.[结论]100ng/ml的CDMP-l可以延长体外培养人退变髓核细胞的衰老,维持细胞生物形态学特性,提高退变髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA表达水平,在一定程度逆转了椎间盘髓核细胞退变.     

髓核细胞表型标记的研究进展

目的综述髓核细胞表型标记的研究进展。方法广泛查阅近年关于髓核细胞表型标记的文献,并对其进行分析。结果由于不同的生物力学特性,髓核细胞和关节软骨细胞的形态及细胞外基质组分如蛋白多糖与Ⅱ型胶原α1的比率存在差异;通过髓核细胞的表面标记(CD24)、基因标记(低氧诱导因子1α、葡萄糖转运蛋白1、基质金属蛋白酶、VEGF-A等)及细胞内各种分子标记(角蛋白19和磷脂酰肌醇聚糖3、配对盒1、叉头蛋白和整联蛋白涎蛋白等)可以初步鉴别髓核细胞。结论髓核细胞与关节软骨细胞表型标记存在差异,但仍缺乏特异性标记物。     

人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养的形态学及活性观察

[目的]观察平面培养体系内人退变椎间盘髓核细胞的形态及活性变化.[方法]收集20例人退变椎间盘髓核,分离髓核细胞行平面培养,倒置相差显微镜和HE染色观察髓核细胞的生长过程与形态变化,流式细胞仪量化细胞周期分布和凋亡率,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色髓核细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,观察平面培养传代对髓核细胞活性和基质合成能力的影响.[结果]原代髓核细胞呈类圆形或多角形,平均7d贴壁,31 d融合至95％,P1代髓核细胞呈长梭形或多角形,平均12h贴壁,6.6d融合至95％,两代细胞增殖能力的差异有统计学意义(P＜0.01).原代与P1代髓核细胞的细胞浆阳性染色聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,生长融合至95％后约90％的细胞分布于G1期,约16％的细胞凋亡,两代细胞的细胞活性和基质合成能力无统计学差异(P＞0.05).[结论]人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养将经历显著的形态学变化.传一代后髓核细胞增殖能力提高,但能维持细胞活性以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成能力.     

腺相关病毒载体介导的TIMP1对人退变腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖的影响

目的:探讨腺相关病毒(Adeno-associated virus;AAV)载体介导的基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1;TIMP1)对人退变腰椎间盘髓核细胞的生物学效应.方法:单层培养并鉴定人退变腰椎间盘髓核细胞.采用绿色荧光蛋白标记的腺相关病毒(rAAV2-EGFP)检测其对髓核细胞的转染效率.应用构建的rAAV2-TIMP1转染髓核细胞;通过细胞形态学观察、35S标记氨基酸整合法检测rAAV2-TIMP1对人退变腰椎问盘髓核细胞基质合成的影响.在35S检测中;以未转染的退变髓核细胞做为正常对照组.结果:光镜下观察所培养的细胞类型以成纤维样细胞为主;Ⅱ型胶原免疫组化和番红O染色鉴定培养细胞为髓核细胞.AAV转染人退变腰椎间盘髓核细胞的转染效率为12%.35S标记整合法检测rAAV2-TIMP1转染组每分钟计数值为341.43±42.85;正常对照组为224.20±29.26;两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:TIMP1能够促进退变椎间盘髓核细胞蛋白多糖的合成.     

整合素在人退变椎间盘髓核组织中的表达及意义

目的:观察整合素α1、α5、αv、β1、β3亚基在人退变椎间盘中的表达情况;探讨其在椎间盘退变中的意义.方法:术中收集人椎间盘髓核标本28个;其中6个来自6例脊柱骨折患者;设为对照组(n=6);22个来自20例椎间盘突出症患者;突出10个(突出组;n=10);脱出12个(脱出组;n=12).应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫沉淀技术测定整合素α1、α5、αv、β1、β3和整合素的配体——胶原蛋白(Ⅰ和Ⅱ型)、纤维结合蛋白在三组椎间盘髓核内的表达情况.结果:整合素α1、α5、αv、α1、α3在三组椎问盘髓核内都有表达;整合素α5在脱出组和突出组的表达分别是正常组的2.2倍和1.5倍;整合素β1在脱出组和突出组的表达分别是正常组的2.5倍和1.6倍;纤维结合蛋白的表达同样有升高的趋势.整合素α1、αv、β3在三组内的表达无统计学差异.结论:在退变的椎间盘髓核内整合素α5和β1亚基的表达增加;可能与椎间盘退变相关.     

17-β雌二醇对肾间质纤维化防治作用的探讨

目的探讨17-β雌二醇对肾间质纤维化防治作用可能的机制。方法雌性SD大鼠30只,随机分为4组：①对照组;②生理雌激素组;③低雌激素组;④17-β雌二醇组。21d后光镜观察单侧梗阻肾组织病理改变;通过免疫组化方法检测转化生长因子（TGF-β1）、α-平滑肌动蛋白（α-SMA）;并用RT-PCR方法检测肾组织α-SMAmRNA的表达。结果单侧输尿管梗阻各组出现肾小管间质纤维化改变,其肾组织TGF-β1。和α-SMA表达上调（P〈0．01）;与生理雌激素组相比,低雌激素组纤维化病变加重,上述物质表达均明显增多（P〈0．05）;而17-β雌二醇组则病变均减轻（P〈0．05）。结论注射17-β雌二醇可能通过下调TGF-β1,和α-SMA的表达,抑制细胞外基质的生成,进而韶到延绣肾间后纤维化的作用．     

血红素氧合酶1对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用研究

目的探讨血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。方法取腰椎间盘突出症患者自愿捐赠的椎间盘组织,体外培养人退变髓核细胞并传代,取第3代细胞进行实验。采用细胞计数试剂盒8测定不同浓度(10、20、50、100和200 ng/mL)TNF-α对髓核细胞活性的影响,筛选最佳刺激浓度进行下一步实验。将髓核细胞分成4组,分别采用单纯基础培养液(对照组)、TNF-α刺激(TNF-α组)、TNF-α和CoPP 10μmol/L刺激(CoPP组)、TNF-α和ZnPP 15μmol/L刺激(ZnPP组)培养,24 h后采用Hoechst染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、上皮膜蛋白1(epithelial membrane protein 1,EMP-1)以及HO-1、p-P65的表达。为进一步探讨HO-1对髓核细胞凋亡的潜在分子机制,取髓核细胞分别采用TNF-α刺激(TNF-α刺激组)以及TNF-α和吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)5μmol/L刺激(TNF-α+PDTC刺激组)培养24 h,采用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。结果经检测确定TNF-α最佳抑制浓度为100 ng/mL。Hoechst染色示,对照组和CoPP组凋亡细胞较少;TNF-α组和ZnPP组可见凋亡样改变细胞核,其中ZnPP组最显著。流式细胞仪检测示,与对照组相比,TNF-α组、CoPP组及ZnPP组细胞凋亡率均显著提高(P0.05);与TNF-α组相比,CoPP组细胞凋亡率显著降低(P0.05),而ZnPP组显著提高(P0.05)。Western blot检测示,与对照组相比,TNF-α组HO-1蛋白表达降低,cleaved Caspase-3、EMP-1及p-P65蛋白表达升高(P0.05)。与TNF-α组相比,CoPP组HO-1蛋白表达明显升高,cleaved Caspase-3、EMP-1、p-P65蛋白表达明显降低(P0.05);而ZnPP组HO-1蛋白表达明显降低(P0.05),cleaved Caspase-3、EMP-1蛋白表达增高(P0.05),p-P65蛋白表达无明显变化(P0.05)。与TNF-α刺激组相比,TNF-α+PDTC刺激组细胞凋亡率明显降低(t=3.076,P=0.031)。结论 HO-1能够抑制TNF-α诱导的人椎间盘髓核细胞凋亡,其机制可能是通过调控NF-кB通路得以实现。     

TGF-β3修饰退变髓核细胞移植修复兔退变椎间盘的效果观察

目的探讨TGF-β3基因修饰后退变髓核细胞生物学效应以及植入兔退变椎间盘后对退变椎间盘的影响。方法将重组腺病毒载体Ad-TGF-β3与第2代退变髓核细胞按10∶1比例混合培养转染(Ad-TGF-β3组),待细胞融合后传代,MTT检测转染细胞增殖活性,Western blot检测TGF-β3蛋白含量,免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率;采用病毒空载体转染髓核细胞(Adv组)和未经转染髓核细胞(空白组)作为对照。取30只新西兰兔,体重3.2～3.5 kg,雌雄不限,通过针刺L3、4、L4、5和L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型。将实验动物按照随机数字法分为3组,转染细胞组(A组,n=12)、退变细胞组(B组,n=12)和空白对照组(C组,n=6)。A、B组将100μL浓度为1×105个/mL对应细胞悬液注射入退变椎间盘,C组同法注入等量PBS。注射后6、10、14周取A、B组各4只、C组2只实验动物处死,取L3、4、L4、5和L5、6椎间盘行组织学观察,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达。结果 Ad-TGF-β3转染后髓核细胞活性明显改善;转染后3、7、14 d,TGF-β3在髓核细胞内表达逐渐升高;Ad-TGF-β3组髓核细胞细胞质内见棕黄色Ⅱ型胶原阳性染色,阳性率显著高于Adv组及空白组(P<0.05)。组织学观察示,A组椎间盘退变程度较B、C组明显减轻。6、10、14周A组Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达显著高于B、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β3基因修饰退变髓核细胞后可明显改善细胞生物活性,转染后髓核细胞植入兔体内可明显增加退变椎间盘的基质分泌。     

雌激素对人胆管上皮细胞增殖作用的体外研究

目的 研究雌激素对体外培养的人胆管上皮细胞增殖的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 体外培养人胆管上皮细胞株,加入雌激素17β-雌二醇作用于人胆管上皮细胞,用CCK8方法检测17β-雌二醇对人胆管上皮细胞生长的影响；Western blot法检测胆管上皮细胞的雌激素受体(ER-a、ER-β)表达水平；并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上述两种培养条件下胆管上皮细胞培养上清中表皮细胞生长因子(EGF)的分泌水平.将雌激素组与无雌激素组(对照组)结果进行比较.结果 雌激素可以促进人胆管上皮细胞增殖,雌激素组的人胆管上皮细胞ER-α受体表达水平明显高于对照组(P＜0.05),两组上清中的EGF水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 雌激素17β雌二醇可以诱导人胆管上皮细胞增殖,为其作用于胆管上皮细胞的雌激素受体而发生生物学效应提供了进一步证据,此外,我们的研究提示雌激素17β-雌二醇可以诱导人胆管上皮细胞增殖与表皮细胞生长因子通路没有相关性.