人血浆中MBL-MASP复合物的纯化与分离

目的从人血浆中分离纯化甘露聚糖结合凝集素(MBL)和MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASP)。方法用非活化Sepharose 4B两步亲和层析纯化MBL-MASP复合物．再以Sephacryl S-300柱凝胶过滤将MBL和MASP分离。在纯化MBL—MASP复合物的整个过程中，除凝胶过滤缓冲液外，均加入丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟(PMSF)和金属蛋白酶抑制剂1．10-邻二氮杂菲(1，10-phenanthroline)．并控制温度在4℃。结果获得高度纯化的MBL和酶原形式的MASP。SDS—PAGE和Western blotting表明所纯化的MBL相对分子质量为28000和32000肽链构成的功能性多聚体；配体结合测定和酵母菌凝集试验证实所纯化的MBL具有生物学活性：结论建立了一种比较简便的同时分离纯化MBL和MASP酶原的方法。     

PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建PcDNA4/HisC-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)。方法 应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/HisC真核表达载体。经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性。结果 从pGEM-MBL中扩增得到约750bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5100和750bp片段,测序鉴定与预期的完全一致。RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58000和87000条带,其中29000蛋白带可与6-His抗体反应。纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1:819200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1:25600。结论 获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件。     

MBL2与MASPs家族蛋白质相互作用的生物信息学分析

目的:通过生物信息学方法对甘露糖结合凝集素2(MBL2)蛋白与甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(MASPs)家族蛋白质的相互作用进行全面预测分析。方法:使用同源建模(Swiss-model)和折叠识别(Phyre2)分别来构建MBL2蛋白与MASPs家族蛋白质的结构,使用STRING数据库及ZDOCK3.02预测分析MBL2与MASP1、MASP2两个蛋白质的相互作用情况。结果:MBL2与MASP1和MASP2均存在直接相互作用,并且和COLEC11、COLEC10、FCN2、C4B等构成相互作用网络。MBL2与MASP1结合位点和MASP2的结合位点高度重叠。MBL2参与结合MASP1的残基,大部分(77%)也参与了与MASP2的结合,表明MBL2是通过同一个区域,分别与MASPs家族的蛋白质相互作用。结论:MBL2与MASPs家族蛋白质之间作用密切,从而可能在补体系统激活及机体免疫防御等方面发挥重要的作用。     

七种常见MBL基因单倍型标准质粒的构建

目的 构建7种常见的MBL基因单倍型标准质粒。方法 以已确认MBL基因单倍型及基因型的DNA样本为模板,利用SSP-PCR技术扩增出包含MBL基因启动子区及第一外显子的单倍型片段并将其克隆入T载体;用定点突变技术分别将其第一外显子52和57位密码相应的碱基突变;采用PCR和测序进行鉴定。结果 以单倍型及基因型已确认的DNA样本为模板,采用SSP-PCR和分子克隆技术获得单倍型HYPA、LXPA、LYQA、LYPA和LYPB重组质粒;以单倍型HYPA及LYQA重组质粒为模板,采用定点突变技术获得单倍型HYPD及LYQC标准质粒。结论 构建成功常见的7种MBL基因单倍型标准质粒,为采用SSP-PCR、Real-timePCR等技术分析MBL基因相应的SNP及其单倍型与基因型提供了标准对照。     

MASP2在小儿上呼吸道感染中的意义

目的探讨血浆甘露聚糖结合凝集素（MBL）相关丝氨酸蛋白酶2（MASP2）水平在儿童上呼吸道感染（上感）中的意义。方
法取103 例上感患儿和35 例健康体检儿童作为研究对象,测定其血浆MASP2 和C反应蛋白（CRP）浓度并进行白细胞计数
（WBC）。根据CRP和WBC值、感染不同时期及有无治疗,上感儿童分为CRP升高组（n=48）与正常组（n=54）、WBC升高组（n=
61）与正常组（n=40）、感染早期未用药组（n=68）与感染中后期已用药组（n=35）,对各组资料进行统计学分析。结果上感组
MASP2浓度显著高于对照组（P<0.001）,CRP升高组血浆MASP2浓度与CRP值正相关（r=0.310,P<0.05）,WBC升高组MASP2
水平与WBC值显著正相关（r=0.392,P<0.01）,感染早期未用药组MASP2 浓度显著高于感染中后期已用药组（P<0.01）,
MASP2、CRP、MBL2基因具有共同的转录因子HNF-4α结合位点。结论MASP2蛋白可能为急性期蛋白,血浆MASP2水平可作
为辅助诊断小儿上感的一个参考指标。
     

PcDNA4／His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建PcDNA4／His C-MBL表达载体，在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)。方法应用PCR从含有中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段，将其克隆至PcDNA4/His C真核表达载体。经酶切及测序鉴定后，以电穿孔法转染CHO细胞，以RT-PCR分析其mRNA表达，通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定，以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性。结果从pGEM-MBL中扩增得到约750bp的cDNA片段。构建成重组载体经酶切出现约5100和750bp片段，测序鉴定与预期的完全一致。RT-PCR证实转染细胞有MBL mRNA表达。纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58000和87000条带，其中29000蛋白带可与6-His抗体反应。纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1：819200，与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1：25600。结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL，为MBL分子的进一步研究提供了条件。     

甘露糖结合凝集素在小鼠葡聚糖硫酸钠结肠炎发病中的机制研究

目的甘露糖结合凝集素（Mannan-binding lectin,MBL）可与甘露糖相关丝氨酸蛋白酶（MBL—associated serine proteases,MASP）结合激活补体系统级联反应。文中检测葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导小鼠急性肠炎的血清MBL与MASP表达水平,以及在糖皮质激素治疗后两者的表达情况。方法将40只8周龄Balb／c小鼠随机分为正常组、模型组、治疗组和对照组,每组10只小鼠。自由饮用5％DSS溶液7d,造成急性溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）模型。小鼠腹腔麻醉后取主动脉血,并立即分离血清,用ELISA方法检测其MBL与MASP的浓度。结果DSS诱导肠炎中MBL与MASP的表达明显高于正常组。用糖皮质激素治疗后MBL的水平明显下降,但MASP的水平变化无统计学意义。结论在5％DSS溶液诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎模型中,MBL与MASP相关信号通路的活化可能参与了UC的发病与进展。糖皮质激素抑制了MBL的产生,可能与其对UC的治疗有关,而与MASP无关。     

成人急性白血病血清MBL、MASP1和MASP2检测及其临床价值

目的 ：检测成人急性白血病血清甘露糖结合凝集素（Mannose-binding Lectin,MBL）、甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-1(mannose-bindinglectinassociatedserineprotease-1,MASP1)和甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(mannose-bindinglectinassociatedserineprotease-2,MASP2)水平并研究其临床价值。方法 ：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测成人急性白血病患者及正常健康人血清MBL、MASP1和MASP2水平,采用ROC曲线分析血清MBL、MASP1和MASP2在诊断成人急性白血病时的灵敏度、特异度、准确度。结果 ：白血病组和对照组研究对象在MBL方面的差异无统计学意义,白血病组患者血清MASP1水平显著低于对照组健康人,而血清MASP2显著高于对照组健康人。复发白血病患者血清MBL水平显著低于初发白血病患者,MASP2显著高于初发白血病患者,而两组间血清MASP1差异无统计学意义。Logistics回归分析表明血清MBL、MASP1、MASP2水平和成人白血病均有...     

甘露聚糖结合凝集素阻遏人巨细胞病毒感染MD-DC细胞的研究

目的 探讨不同来源、不同浓度的甘露聚糖结合凝集素( MBL)阻遏人巨细胞病毒(HCMV)感染人外周血单个核细胞衍生出的DC细胞(MD-DC)的作用.方法 通过载体构建得到重组MBL(rMBL),通过血浆分离得到天然MBL(hMBL),先以不同浓度的hMBL/rMBL预处理MD-DC 0.5h,再以HCMV感染MD-DC...     

大株红景天化学成分的研究

目的:对四川产大株红景天的化学成分进行分离鉴定。方法:采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和HPLC制备色谱等方法分离纯化得到单体化合物,采用有机波谱方法鉴定化合物结构。结果:从大株红景天萃取物中分离得到10个化合物,分别鉴定为lotaustralin (1)、仲丁基葡萄糖苷 (2)、没食子酸 (3)、3-甲氧基没食子酸 (4)、没食子酸甲酯 (5)、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸 (6)、苯甲醇 (7)、阿魏酸 (8)、对羟基肉桂酸 (9)、棉黄素-7-O-(3^?-O-β-D-葡萄糖基)-α-L-鼠李糖苷 (10)。结论:化合物2、6为首次从该属植物中分离得到,化合物1、5、8、9、10为首次从该种植物中分离得到。     

兔乳酸脱氢酶C4的分离纯化及动力学研究

建立兔乳酸脱氢酶Ｃ４（ＬＤＨ－Ｃ４）分离纯化的新方法，研究该酶的动力学特性。采用Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｅｒａｎ和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ交联制成Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ－Ｓｅｐｈａｑｒｏｓｅ ４Ｂ染料配体亲和层析柱，结合ＱＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ４５０离子交换层析分离兔ＬＤＨ－Ｃ４，以作图法测定该酶动力学数据。     

一种新的多糖——链霉菌多糖的分离与结构确证

目的 从链霉菌发酵液中分离纯化出一种新的多糖——链霉菌多糖(streptomyces polysaccharide,SMP),并进行结构确证。方法 采用乙醇沉淀多糖类大分子物质、Sevage法去蛋白、DEAE-纤维素离子交换层析法及Sephadex G-25凝胶过滤法纯化多糖。其结构经HPLC、UV、IR、1H-NMR以及高碘酸氧化、Smith降解等方法进行测定。结果 分离纯化出的多糖属于中性多糖,相对分子质量约为4855 道尔顿;单糖组成以葡萄糖为主,含有少量果糖,二者的摩尔比约为22:1(10.96:0.48);糖苷键的链接方式为(1→6)—α—D—吡喃型;命名为SMP。结论 从链霉菌发酵液中分离纯化出的多糖SMP是以1→6位键合的α—D—吡喃型多糖。     

Immunogenicity and tumor-inhibiting effects of HSP-antigen peptide complex in melanoma B16 cells in mice

目的 :黑色素瘤 B1 6细胞热休克蛋白 -抗原肽复合物 (HACs)及其粗提物 (HAC- CEs)的制备 ,以及它们的免疫原性和抑瘤效应的研究。方法 :应用 Sephacryl S- 2 0 0凝胶过滤制备HAC- CEs,应用亲和层析纯化 HACs,并测其免疫功能和抑瘤效应。结果 :应用凝胶过滤制备的HAC- CE3、HAC- CE4、HAC- CE5和应用亲和层析纯化的 HAC60 ,HAC75和 HAC97均不同程度地降低肿瘤发生率、延迟肿瘤发生时间和减少移植黑色素瘤 C57BL/6J小鼠死亡率 ;同时 ,伴有小鼠脾细胞 IFN-γ和 IL- 2分泌活性及 CTL杀伤率的增加。结论 :分子量为 60 0 0 0～ 970 0 0的 HACs具有免疫原性和抑瘤效应 ,本研究为制备肿瘤疫苗提供重要的实验依据。     

胰岛素受体的分离纯化及其酪氨酸蛋白激酶特性的研究

本文利用差速离心,2%Triton X-100增溶,伴刀豆球蛋白A-琼脂糖,胰岛素-亲和胶及麦胚凝集素-亲和胶亲和层析分离纯化了人胎盘的胰岛素受体。纯化的受体经圆盘电泳及HPLC凝胶过滤得单一峰。SDS-电泳显示分子量分别为135000及90000的两条带。纯受体有自身磷酸化作用,且对外源性底物呈现酪氨酸蛋白激酶活性。有意义地是纯化的受体的磷酸化可受促癌剂促癌因子抑制。     

Bre1与Rad6形成的复合物的表达、纯化和结晶

目的：建立Bre1及Rad6的表达和纯化方法,构建Bre1-Rad6的复合物,寻找复合物的结晶条件,为使用X射线晶体学的方法解析复合物的结构奠定基础。方法：使用大肠杆菌表达系统表达蛋白质;使用共纯化的方法组装复合物;使用气象扩散的方法结晶复合物。结果：建立了来源于Lodderomyces elongisporus的Bre1(LeBre1)氮端与Rad6相互作用的结构域（RBD）和Rad6(LeRad6)在大肠杆菌中大量表达的方法;通过使用共纯化的方法,成功组装了LeBre1 RBD-Rad6复合物,并进一步通过两步凝胶过滤层析纯化的方法精细纯化,获得了纯度超过95%的蛋白复合物;使用气象扩散的方法结晶复合物,在18℃通过对1 000多个结晶条件的筛选,确定了复合物的两种结晶条件,进一步对该条件优化,获得了质量相对较好的晶体。结论：成功的构建了LeBre1 RBD-Rad6复合物的表达、纯化和结晶的方法,为使用X射线晶体学方法解析复合物的结构奠定了基础。     

亲和层析法从红芸豆中纯化红血球凝集素的研究

目的制备一种亲和树脂快速分离红血球凝集素。方法通过甲状腺球蛋白和树脂的耦联来从红芸豆粗提液中快速分离红血球凝集素。结果从红芸豆粗提液中快速地提取出了较纯的红血球凝集素,经SDS-PAGE上显示亚基分子量为32kD.并通过质谱确认为红血球凝集素,提取得到的凝集素使人红细胞50%凝集的蛋白质最低浓度为4μg/ml左右。结论成功制备亲和树脂并用于快速分离红血球凝集素。     

小鼠黑色素瘤凝集的分离纯化

目的：制备并纯化小鼠黑色素凝集素（MMA）。方法：利用亲合层析及凝胶过滤层桥从小鼠B16黑色素瘤中分高纯化小鼠黑色素瘤凝集素（MMA）。结果：利用亲和层材制备的凝集素,经SDS-PAGE显示出一条分子量12．4kD的主要蛋白带和两个分子量为35kD和67kD的痕迹蛋白带;经凝胶过滤层析则出现分子量为26kD主峰及分子量为35kD和67kD的两个小峰。26kD的蛋白成分经SDS－PAGE和等电聚焦电泳显示出一条均一的蛋白带。26kD的蛋白成分特异性识别会多聚乙酰氢基乳精的糖链,活性依赖于巯基而非钙离子。结论：26kD的成分为MMA,利用经亲和层析和凝胶过滤层析等可得到成分均一的MMA,MMA为S型凝集素。     

绿脓杆菌凝集素的研究——Ⅱ半乳糖专一性绿脓杆菌凝集素的提纯

本文应用交联剂环氧氯丙烷将半乳糖交联于淀粉,制备了半乳糖—淀粉凝胶(Gal—starch gel),并利用Gal-starch gel亲和层析法成功地提纯了半乳糖专一的绿脓杆菌凝集素(PA-Lectin)。同时,根据产率、纯化倍数、PA-Lectin的分子量和氨基酸组成,作者将Gal-starch gel法与Gilboa-Garber等报道的Sepharose 4B亲和层析法进行了比较研究。此外,文中还对Gal-starch gel法提纯的最适条件进行了观察。     

妊娠特异性β1糖蛋白的分离纯化及特异抗血清的制备

本文采用硫酸铵盐析、DE-52离子交换层析、Sephadex G-200凝胶过滤及抗SP_1免疫亲和柱层析等方法从胎盘后血分离妊娠特异性β_1民糖蛋白(SP_1)所得SP_1纯化约207倍.纯化的SP_1与德国Behringwerke AG的SP_1抗血清在双向免疫扩散时有沉淀反应;免疫电泳时纯化SP_1移动的位置与β蛋白相当.聚丙烯酰胺凝胶电泳时纯化的SP_1呈现一条主带其分子量为90,000左右.免疫家免所得的抗血清经血浆蛋白吸收后得特异SP_1抗血清在双向免疫扩散时与正常男子或非孕妇女血清均无沉淀反应;与孕血反应形成的沉淀线与德国Behring werke AG的SP_1抗血清所形成的沉淀线相连;交义免疫电泳时呈现一个峰.此抗血清已成功地用于建立酶联免疫法测定SP_1含量