Edaravone-induced differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro

目的 采用密度梯度离心和差速贴壁法体外分离、培养、纯化及鉴定成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和依达拉奉联合诱导MSCs定向分化为神经元样细胞. 方法 选用1月龄健康雄性Wistar大鼠,采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓中的MSCs,通过差速贴壁法反复传代培养、纯化,取第3代细胞采用流式细胞术、免疫细胞化学等方法检测MSCs的纯度,利用bFGF联合依达拉奉诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过扫描电镜、免疫细胞化学等对诱导后的细胞进行鉴定. 结果 第3代MSCs经免疫细胞化学及流式细胞仪等检测,间充质干细胞特异性的标记物CD44表达阳性,不表达造血干细胞及白细胞的特异性标记物CD34、CD45,MSCs纯度高达95.5％.诱导分化后扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫细胞化学检测发现,细胞表达神经元特异性烯醇化酶( NSE),不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP),Nestin的表达随着细胞成熟而减弱. 结论 密度梯度离心和差速贴壁法可获得高纯度的MSCs;依达拉奉能高效地定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.     

天然脑活素定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的： 探讨天然脑活素（NC）诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法: 取6-8周龄SD大鼠,无菌获取胫骨和股骨骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离培养并纯化大鼠MSCs,应用天然脑活素诱导MSCs向神经元分化。倒置相差显微镜追踪比较观察分化过程中细胞形态的变化,免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测神经元特异性标志物：巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。免疫细胞化学检测细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果：经全骨髓贴壁筛选法获得了纯度较高（90%以上）的大鼠MSCs,天然脑活素含药血清诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,分别从mRNA和蛋白水平上证实诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和nestin,不表达神经胶质细胞标记物GFAP。诱导分化后细胞MAP-2的表达明显。结论：天然脑活素可诱导MSCs向神经元样细胞的定向分化。     

隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的： 体外培养猴骨髓间质干细胞（MSCs）并定向诱导分化为神经元样细胞。 方法： 体外分离培养猴MSCs，流式细胞仪检测其表面标志，用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果： 体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166，并且具有正常的二倍体核型，不随传代而发生改变。bFGF预诱导24 h 后，隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞，免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性，阳性率分别为68.3％±3.5％、70.3％±1.5％，而GFAP表达阴性。 结论： 隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

毛囊培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化的研究

目的探讨毛囊培养上清液诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向毛囊干细胞横向分化的潜能。方法采用完全贴壁法分离培养大鼠MSCs,取第3代MSCs,用免疫细胞化学染色技术鉴定CD44和CD29。用毛囊培养上清液为条件培养液诱导MSCs,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,对诱导后的细胞进行角蛋白15的免疫细胞化学染色和免疫荧光细胞化学染色,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步鉴定诱导后细胞角蛋白15的表达。结果体外培养的MSCs,CD44、CD29表达阳性。经毛囊上清液诱导后,免疫细胞化学、免疫荧光细胞化学染色鉴定,部分细胞角蛋白15表达阳性;同时RT-PCR也检测到keratin 15 mRNA的表达。结论体外培养的骨髓间充质干细胞经毛囊培养上清液诱导可以分化为毛囊干细胞样的细胞。     

丹参素联合生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞分化为神经细胞的研究

人脐血间充质干细胞(MSCs)是从脐带血中分离和培养的一种多潜能成体干细胞。本实验通过密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,贴壁法筛选出脐血MSCs,体外扩增,免疫荧光方法检测表面抗原。传3代的脐血MSCs经20ng/mlbFGF预诱导24h、3μg/μl丹参素诱导6h、20ng/mlEGF和20ng/mlbFGF诱导分化5d后出现类似神经元样细胞的形态改变,伸出长突起。免疫组织化学和免疫荧光方法鉴定显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元特异性标志NeuN和β-TubulinⅢ,而星形胶质细胞特异性标志GFAP阳性细胞较少。上述结果表明,丹参素联合生长因子EGF和bFGF在体外可定向诱导人脐血MSCs分化为神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞分化神经元后多巴胺D2受体的表达

目的:检测骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为神经元后多巴胺D2受体(dopamine receptor D2,DRD2)的表达,探讨体外分化神经元的基本功能。方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养的方法分离纯化MSCs,流式细胞仪检测MSCs表面标志,DMSO/BHA/FSK作为诱导剂来诱导分化;硝酸银染色法检测神经纤维丝,RT-PCR和免疫细胞化学法检测NSE、DRD2 mRNA及蛋白的表达情况。结果:分离纯化的MSCs经流式细胞仪检测显示CD34、CD45表达阴性;间充质干细胞相对特异性标志CD44强阳性表达;加入诱导剂后,MSCs形成多极神经元的形态。银染色法显示神经纤维丝阳性表达,RT-PCR显示诱导后细胞表达NSE、DRD2 mRNA,免疫组化显示NSE、DRD2蛋白表达阳性。结论:MSCs分化为神经元后可以表达神经受体DRD2。     

卵泡抑素诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

本实验观察了卵泡抑素(follistatin)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。利用Percoll密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养和扩增成人的BMSCs,通过流式细胞术分析鉴定BMSCs的纯度,用follistatin诱导第三代生长良好的MSCs向神经元转化,观察分化过程中细胞形态的变化,利用RT-PCR方法检测诱导前后BMSCs的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)的表达情况。结果显示:流式分析获得了纯度较高的BMSCs,细胞表达CD29、CD44、CD106和CD166,不表达CD34和CD45。诱导10d后,细胞呈现双极、多极和锥体形的典型神经元细胞形态,并且在mRNA水平证明诱导分化后的细胞与对照组比较NSE和Nestin的表达增加(P<0.05)。上述结果表明follistatin可以在体外诱导人的BMSCs分化为神经样细胞。     

人脐血间充质干细胞体外终末分化为神经元样细胞

目的:探讨人脐血间充质干细胞体外培养过程中的终末分化方向.方法:采用密度梯度离心法从人脐血中分离培养间充质干细胞,流式细胞术(FCM)检测细胞表面抗原标记CD29、CD44、CD105、CD34、CD106和HLA-DR;观察人脐血间充质干细胞在体外培养过程中的增殖情况和形态变化,应用RT-PCR和免疫细胞化学方法对P2和P10代人脐血间充质干细胞进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)的表达情况进行检测.结果:RT-PCR分析证实P10代人脐血间充质干细胞有NSE、NF的mRNA表达,免疫细胞化学检测显示P10代细胞能表达NSE和NF,而P2代人脐血间充质干细胞经RT-PCR和免疫细胞化学检测均无NSE、NF表达.结论:人脐血间充质干细胞在体外培养过程中能终末分化为神经元样细胞.     

大鼠乳鼠肌源性干细胞体外诱导分化为神经样细胞

目的:探讨神经生长因子(NGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠乳鼠肌源性干细胞(MDSCs)分化为神经样细胞的可行性.方法:取SD大鼠乳鼠骨骼肌,差速贴壁至第5代时培养液中加入诱导培养基培养,行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析.结果:分化后细胞NSE染色阳性,RT-PCR结果显示,诱导后MDSCs样品中检测到NSE、GFAP特异性条带.结论:在一定条件下NGF和bFGF联合诱导法可以诱导MDSCs分化为神经样细胞.     

碱性成纤维细胞生长因子和5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞分化潜能和细胞增殖的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和5-氮杂胞苷(5-aza)对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)细胞增殖与分化潜能的影响。方法:大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,在倒置相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞周期改变;MTT法检测bFGF和5-aga对MSCs生长的影响;免疫细胞化学方法检测actin、desmin、myoglobin、NSE、GFAP的表达。结果:有心肌样细胞和神经元样细胞的形态变化;MSCs经5-aza以及5-aza加bFGF联合诱导actin、desmin、myoglobin、NSE和GFAP的表达均较对照组显著增高;而经bFGF诱导后,前4种蛋白表达无明显变化,仅GFAP蛋白表达显著增高。结论:5-aza对MSCs细胞生长有抑制作用,而bFGF有明显促增殖作用。MSCs被5-aza诱导分化成心肌样细胞和神经元样细胞,bFGF可使MSCs分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞。     

EGF和bFGF诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后对Tau和神经元特异性烯醇化酶表达的影响

目的：观察表皮细胞生长因子（BGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经细胞后,神经元微管相关蛋白Tau和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。方法：取P4代MSCs分为EGF、bFGF和EGF＋bFGF及对照组;免疫细胞化学法检测Tau蛋白和NSE表达,ELISA法分析各组细胞Tau蛋白含量。结果：免疫细胞化学检测显示EGF＋bFGF811Tau蛋白和神经元特异性烯醇化酶NSE阳性细胞率最高,bFGF组、EGF组和对照组依序递减;各组Tau蛋白含量结果与Tau蛋白阳性细胞率一致。结论：EGF和bFGF均可促进MSCs向神经细胞分化,并表达Tau蛋白和NSE,二者具有协同作用。     

碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA体外定向培养骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化***

背景：采用中药作为诱导剂对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化是否会有效果呢？ 目的：验证碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入中药丹参酮ⅡA体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的效应。 方法：采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞,取第3代细胞利用碱性成纤维细胞生长因子联合丹参酮ⅡA诱导其向神经元样细胞分化,全反式维甲酸无血清培养基诱导液及不进行诱导的细胞做为对照。 结果与结论：①骨髓间充质干细胞能稳定表达间质细胞特异性的标记物CD44,表达阳性率为(91.00±1.58)%,但不表达CD34、CD45,流式细胞学检测其纯度高达95.5%。②诱导分化后经扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫组织化学检测细胞表达神经元特导性烯醇化酶,神经元特导性烯醇化酶阳性率为(75.60±2.31)%,Nestin呈一过性表达增加后随着诱导时间延长逐渐减低至阴性,不表达神经胶质纤维酸性蛋白。说明经碱性成纤维细胞生长因子预诱导后加入丹参酮ⅡA能高效地定向诱导神经元样细胞的分化。     

人脐带间充质干细胞的分离培养及生物学特性

目的建立一种稳定、高效的分离培养人脐带间充质干细胞(MSCs)的方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法分别采用组织块贴壁法和双酶消化法分离培养人脐带MSCs,对比其培养成功率;流式细胞术检测脐带MSCs表面抗原及细胞周期;采用丹参联合生长因子的方法诱导其向神经细胞分化,观察脐带MSCs向神经元分化潜能。结果组织块贴壁法获得脐带MSCs成功率高;细胞表达CD29、CD44和CD90,不表达造血干细胞表型CD34。细胞倍增时间为30h,G0-GI期和S+G2+M期所占比例分别为78.47%和21.53%。脐带MSCs在体外经诱导分化出现神经元样细胞改变,且表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论成功建立了高效稳定的脐带MSCs分离培养方法,脐带MSCs具备较强的分化潜能和增殖能力,为临床移植治疗提供了理想的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞

背景:文献报道体外诱导骨髓间充质细胞定向分化为神经元样细胞多应用神经生长因子类多肽制剂,选择纯化学诱导剂尚不多见。目的:建立人骨髓间充质干细胞分离培养体系,体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合分离纯化人骨髓间充质干细胞并鉴定,采用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态,通过尼氏染色、NSE和NF-200免疫细胞化学染色对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。结果与结论:分离得到的骨髓间充质干细胞为成纤维样细胞,可见多个核仁,β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导后,间充质干细胞分化为神经元样细胞,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支,诱导后的神经元样细胞胞质中存在着深蓝色颗粒状的尼氏小体,NSE、NF-200免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,阳性率分别为(85.6±6.7)%和(73.2±5.6)%。结果证实采用密度梯度离心、贴壁培养法和消化时间控制相结合能够成功分离和培养人骨髓间充质干细胞,人骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和二甲基亚砜的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养及向血管内皮样细胞分化的研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外分离培养方法及在特定微环境下分化为血管内皮样细胞的潜能,可能为银屑病研究提供实验基础.方法:密度梯度离心法结合贴壁法分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外扩增培养并进行鉴定.加入血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导hMSCs向血管内皮细胞分化,流式细胞仪进行细胞表型鉴定,Dil-ac-LDL摄取实验鉴定血管内皮细胞功能.结果:经流式细胞仪测定分离培养的hMSCs CD71、CD44阳性表达,CD54、CDl06、CD45弱阳性表达,CD34、CD31、VWF、KDR、HLA-DR阴性表达;经bFGF、VEGF诱导后的hMSCs可见类似内皮细胞样改变,经流式细胞术检测,与对照组相比内皮细胞特异表面标志CD34、CD31、VWF、KDR表达转为阳性(P＜0.01),而HLA-DR、CD54、CDl06、CD45表达明显上调(P＜0.01);诱导分化后的内皮样细胞具有摄取Dil-ac-LDL的能力.结论:密度梯度离心法结合贴壁法可获得较纯的MSCs;在bFGF、VEGF诱导作用下,hMSCs具有向内皮细胞分化潜能,产生功能性内皮细胞.     

两种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

背景:骨髓间充质干细胞可被定向诱导分化为神经样细胞,理论上骨髓间充质干细胞可作为种子细胞应用于周围神经组织工程。目的:用2种细胞因子联合诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,进一步探讨其在周围神经损伤方面的应用。方法:从Wistar大鼠胫骨和股骨提取骨髓间充质干细胞,采用差速贴壁法进行培养和纯化,联合应用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对细胞进行诱导,观察细胞形态变化,并用免疫组织化学方法检测骨髓间充质干细胞中神经元特异性标志物的表达;并研究终止诱导后骨髓间充质干细胞的形态及免疫组织化学方面的变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞经诱导后呈典型神经细胞样改变,有两个或多个突起,突起之间相互连接成网状,可见细胞核及核仁,免疫组化检测神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白及突触素蛋白表达阳性。撤除诱导条件后大部分细胞逐渐恢复原来的成纤维细胞样形态,上述3种蛋白的表达量明显下降。表明应用神经营养因子可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,但其形态及组织学变化仅能维持一段较短的时间。     

人脐带间充质干细胞的富集及向神经细胞的诱导分化

目的:寻找一种稳定、高效的分离人脐带间充质干细胞(MSCs)的方法,并探讨脐带MSCs向神经细胞方向分化的可能性。方法:分别采用组织块贴壁法和双酶消化法分离人脐带MSCs,对比其培养成功率;BrdU掺入实验检测脐带MSCs的增殖能力;流式细胞仪检测脐带MSCs表面分子标志;采用丹参联合生长因子的方法诱导其向神经细胞分化,免疫荧光方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:组织块贴壁法获得脐带MSCs成功率高;BrdU阳性标记率达90%以上;流式细胞仪检测显示细胞表达CD29、CD44和CD90,不表达CD34;脐带MSCs经诱导分化,伸出长突起,呈神经元样细胞改变,且表达神经元标志性蛋白NSE、MAP2。神经胶质细胞标志性蛋白GFAP表达较少。结论:成功建立了高效、稳定的脐带MSCs分离培养方法。脐带MSCs经诱导可向神经细胞方向分化,为临床移植治疗神经系统疾病提供了理想的细胞来源。     

三七总皂甙和维甲酸联合诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞

目的： 体外探讨三七总皂甙、维甲酸对大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的影响。 方法： 以三七总皂甙和维甲酸为诱导条件诱导大鼠MSCs分化，免疫细胞化学检测分化细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、γ-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。 结果： 免疫细胞化学显示MSCs诱导后具有神经细胞的形态， NSE、AchE、GABA、TH有阳性表达，GFAP表达为阴性。 结论： 三七总皂甙和维甲酸联合应用对大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞及在提高其分化率中起着重要作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的实验研究

目的：建立一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs)的方法，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。方法：用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，筛选合适培养基及适应血清含量，传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。结果：MSCs属骨髓中的单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs在含10％小牛血清L-DMEM培养液中生长性状相对稳定，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，增殖速度快，群体倍增时间约为34小时，贴壁存活率高，适应性强，传代后12小时贴壁率达89％。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN)、I型胶原（Collagen I)。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L－DMEM培养液中，细胞稳定扩增。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离和培养方法,并用黄芪体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞样细胞。方法利用梯度离心从大鼠骨髓中分离单核细胞进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化,对其生长特性进行分析。采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经细胞样细胞,观察细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果用含10%胎牛血清(FCS)的培养基培养,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆团形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,有较强的增殖能力。经黄芪诱导后,骨髓间充质干细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,在一定条件下向神经样细胞分化。