靶基因调控的脐血干／祖细胞体外长期扩增与调控

背景：脐血干细胞是基因治疗最理想的靶细胞之一，但基因转移率低下是目前面临的主要障碍。酪氨酸激酶JAK2在造血干，祖细胞自我更新中扮演着重要的作用，为了克服脐血基因转移率低下的障碍，根据基因调控表达技术原理，是否可开发一个可以靶向扩增JAK2基因修饰的脐血CD34^＋细胞体系。 目的：探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。 单位：卫生部北京医院血液科。 材料：实验于2003—06／2006—04在卫生部北京医院血液科实验室完成。脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血。脐血由北京医院妇产科提供，产妇及家属均知情同意，实验经医学伦理委员会批准。MiniMACS磁性分离仪、免疫磁珠吸附CD34单抗购自德国Miltenyi Biotec公司，流式细胞仪购自美国FACScafibur，人重组干细胞因子、Flt3配体、人白介素．6、粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为PeproTec产品，SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心。 方法：构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2，内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物（AP20187）结合的位点蛋白（2xF36v，F2）组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因，用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34^＋细胞，用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34^＋细胞。转导后的CD34^＋细胞在集落刺激因子、Flt3配体、血小板生成素、白介素-6细胞因子的联合培养条件下，以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。 主要观察指标：①应用流式细胞仪测定两组CD34^＋细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率，确定基因转移率。②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果     

靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控的实验研究

目的探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。方法构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34 细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34 细胞。转导后的CD34 细胞在SCF、FL、TPO、IL-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。定期检测CD34 细胞基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养和裸鼠致瘤试验。结果分选的CD34 细胞纯度为91%以上,基因转移率为49．3%±6．2%;实验组AP20187 SCF FL TPO IL-6(ASFTI)与对照组SCF FL TPO IL-6(SFTI)组均可获得CD34 细胞大量扩增。随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34 细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组GFP阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。在培养6周左右,实验组CD34 CD38-、CD34 CD38 细胞亚群扩增倍数分别为(228．26±32．31)、(321．48±40．52),分别与对照组相比,差异有显著性。ASFTI组转基因CD34 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落(BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix)。扩增后CD34 细胞检测染色体核型正常,裸鼠实验无致瘤特性。结论转染JAK2基因的人脐血CD34 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。     

FL与SCF、IL-3、GM-CSF及EPO协同调控脐血造血干/祖细胞的体外扩增

目的　探讨造血细胞因子的不同组合对脐血造血干 /祖细胞的扩增作用。方法　应用免疫磁珠法分离纯化脐血CD3 4+ 造血干 /祖细胞 ,在体外液体培养体系中经各种不同细胞因子组合扩增 1周 ,用流式细胞仪检测CD3 4+ 造血干 /祖细胞并进行甲基纤维素法半固体培养 2周 ,在倒置显微镜下计数集落产率。结果　在FL、SCF、IL 3、GM CSF、EPO造血细胞因子的不同组合下脐血造血干 /祖细胞得以扩增 ,以IL 3+SCF +FL +EPO组的扩增效率最高 ,其有核细胞数、CD3 4+ 细胞及CFU GM、BFU E集落分别扩增 46 2± 175、3.47± 1.6 4、2 6 4± 10 5和 12 8± 6 7倍。结论　FL对扩增CD+ 3 4细胞具有较强的协同作用 ,合理的细胞因子组合扩增的脐血造血干 /祖细胞可成为异基因造血干细胞移植的主要来源。     

Flt3和c-kit在脐血CD34+干/祖细胞中功能性表达及意义

为了解作用于早期造血的细胞因子受体Flt3和c-kit在脐血CD34~+造血干/祖细胞中的表达及功能,从蛋白和基因水平对其进行了研究。采用常规双色直接免疫荧光标记法,使用流式细胞术测定新鲜分离的和体外不同培养时间的脐血CD34~+造血干/祖细胞中Flt3和c-kit蛋白水平的表达,用RT-PCR法测定Flt3和c-kit的mRNA水平表达,并在体外对受体功能进行了探讨。研究结果显示,新鲜脐血CD34~+细胞中(68.8±15.4)％为Flt3~+,(50.6±12.7)％为c-kit~+,随着体外培养时间的延长,二者表达逐渐下降。结论:脐血CD34~+造血干/祖细胞在体外液体培养条件下Flt3和c-kit阳性表达可维持2-3周,其配体FL和SCF在培养的第1周内对细胞扩增效果最显著。     

微囊微环境体外扩增人脐血造血干/祖细胞

背景:由于单份脐血所含的造血细胞数量有限,目前只能用于儿童或低体质量成人血液病和急性辐射损伤等疾病患者,有效扩增脐血造血干,祖细胞已成为研究热点.目的:观察微囊微环境对脐血造血干,祖细胞扩增的影响,以及此过程中可否使造血干,祖细胞在扩增的同时仍维持其未分化状态.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-09在中国科学院大连化学物理研究所完成.材料:正常足月产新生儿脐带血由大连市妇产医院提供,提供者知情同意.方法:Ficoll法梯度分离人脐血单个核细胞,采用静电液滴法在生理条件下进行微囊化包封和体外培养.以同条件平面培养的脐血单个核细胞作为对照.主要观察指标:观察微囊化脐血细胞的生长特点及脐血细胞总数的变化;流式细胞仪检测培养过程中CD34+细胞扩增情况:应用甲基纤维素半固体培养法观察扩增细胞的集落形成能力.结果:脐血细胞在微胶囊内持续增殖,并以聚集成团的三维方式生长,两种培养方式对脐血细胞总数均无明显影响(P>0.05).对比CD34+细胞扩增和细胞集落的生成发现,微囊化培养脐血细胞的CD34+细胞数量和集落密度均在培养第6天达到高峰,明显高于平面培养3 d时所达到的峰值:之后逐渐下降,至12 d后平面培养细胞的CD34+细胞和集落形成能力几乎检测不到,而此时微囊化培养的CD34+细胞数量和集落密度仍与平面培养的扩增高峰相近.结论:微囊化培养能有效扩增人脐血造血干/祖细胞,并显著减缓造血干/祖细胞的分化进程,维持其多分化潜能,提示微囊为造血干/祖细胞维持未分化状态的扩增提供了特殊的微环境.     

人胸腺和脐血造血干/祖细胞联合移植对裸鼠T细胞免疫功能影响

目的:建立人胸腺和脐血造血干/祖细胞联合移植裸鼠动物模型,探讨胸腺对造血干细胞发育分化的机制.方法:实验组为人胸腺与脐血CD34+细胞联合移植.对照组只给予人脐血CD34+细胞移植,通过观察裸鼠移植胸腺CD3、HLA-DR的表达、人源CD3+细胞在小鼠脾脏的表达、裸鼠血液CD3+、CD4+、CD8+和CD4+ CD25+细胞的百分比,以及联合移植裸鼠对移植肿瘤的排斥能力,判断联合移植对裸鼠免疫功能的影响.结果:移植胸腺在裸鼠肾被膜下存活,表达CD3和HLA-DR分子;裸鼠脾脏中检测到人源CD3+T细胞呈点块状分布;裸鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+细胞均增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);联合移植组能抵抗肿瘤细胞的生长,单独脐血造血干/祖细胞移植组不能抑制肿瘤生长.结论:裸鼠移植人胸腺能促进人脐血造血干/祖细胞向T细胞分化、促进免疫功能重建.     

转白血病抑制因子基因人胚肺成纤维细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景:单份脐血的造血细胞数量有限,难以满足成人的需要,如何有效地扩增脐血造血干/祖细胞是目前研究的热点.目的:构建人白血病抑制因子基因修饰的人胚肺成纤维细胞,观察转基因细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞体外扩增的影响.方法:建立转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞,用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验检测自发迁移率和基质细胞衍生因子1诱导迁移试验以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力.结果与结论:成功建立转基因饲养层细胞,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,与人白血病抑制因子转基因饲养层细胞共培养7 d后CD34+造血干/祖细胞可大量扩增,同时表面黏附分子的表达量仍较高.体外迁移实验显示与转基因饲养层细胞共培养的造血细胞的诱导迁移率明显高于对照组,可以较好地保持其归巢能力.因此转人白血病抑制因子基因的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力.     

2型重组腺相关病毒对人脐血CD34+造血干/祖细胞的转导效率研究

为探讨 2型重组腺相关病毒 (rAAV 2 )载体能否有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,采用rAAV 2 /GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干 /祖细胞 ,在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果显示 ,转导 19小时后感染复数 (MOI)为 2× 10 5时 ,CD34+细胞GFP基因的表达率为 4 3%。结论 :rAAV 2能有效地转导脐血CD34+造血干 /祖细胞。     

人胎盘组织源造血干/祖细胞的初步研究

为了探讨足月胎盘组织源单个核细胞(human mature placenta tissue-derived mononuclear cells,hPTMNC)中CD34+细胞的体外增殖、分化能力,寻找新的造血干/祖细胞来源供临床应用,分别采用流式细胞术检测、造血干/祖细胞集落培养和体外无细胞因子长期培养的方法,测定胎盘组织源和脐血中的CD34+细胞及其亚群和集落形成单位的数量。结果表明:胎盘组织源CD34+细胞(2.74±0.61%)及其亚群CD34+/CD38-细胞(2.46±0.42%)、造血干/祖细胞集落CFU-GM(186.90±24.52)和BFU-E(101.40±13.35)水平都较脐血CD34+细胞(1.73±0·32%)、CD34+/CD38-细胞(0.80±0.25%)、CFU-GM(136.90±25.15)、BFU-E(49.20±8.13)高;前者在体外无细胞因子培养条件下存活时间长,且细胞数量增加约2倍。结论:胎盘是胎儿期的造血器官,胎盘细胞成分更幼稚,是一种造血干/祖细胞移植的新的种子细胞。     

人骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的探讨人骨髓基质细胞(hBMSC)协同以干细胞因子和FL为主的细胞因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用.方法采用免疫磁珠法分选脐血CD34+细胞,以SCF+IL-3+IL-6+FL+EPO组合高效扩增CD34+细胞[1],并结合该细胞因子组合接种到预先照射(20Gy)的hBMSC上,d10结束培养,收获细胞分别作细胞计数、集落培养和流式细胞术检测CD34+细胞数.结果本法获得的脐血CD34+细胞纯度较高(92±0.04)%,在hBMSC组培养的d2,造血细胞几乎都粘附到hBMSC上,随着培养时间的延长,CD34+细胞比例不断下降.hBMSC组与无hBMSC组相比,除细胞总数扩增倍数外,CFU-GM、BFU-E、CD34+细胞扩增倍数差异有显著性意义(P<0.05).结论①脐血来源的CD34+细胞粘附于滋养层上形成造血灶,且10d后造血细胞仍具有体外集落形成能力,表明骨髓基质细胞可支持并维系体外造血;②hBMSC协同外源性细胞因子可能是扩增造血干/祖细胞的较理想方案.     

JAK2转基因骨髓造血干/祖细胞体外长期扩增调控及定向分化的研究

目的　探讨酪氨酸激酶JAK2转基因骨髓造血干 祖细胞体外长期扩增调控和定向分化潜能的可行性。方法　克隆了一个MSCV based逆转录病毒载体称作MGI F2Jak2 ,它编码一个绿色荧光蛋白 (GFP)和两个改进的FK5 0 6结合蛋白 (F36v)与JAK2组成的融合蛋白 ,F36v是二聚化化学诱导物AP2 0 187的结合位点。应用该载体转染GpE 86包装细胞株 ,将C5 7BL 6小鼠的骨髓细胞与照射过15 0 0cGy的GpE 86产毒细胞株共同培养实现基因转导。转导后的细胞在X VIVO 15培养体系中扩增 ,分为①空白对照组 ;②AP2 0 187组 ;③干细胞因子 (SCF)组 ;④AP2 0 187 SCF组。扩增的细胞用直接法标记藻红蛋白荧光素 (PE)结合的抗Sca1、c kit、CD34 、Gr1、CD1 1b、TER 119、CD4 1 、B2 2 0和CD3单克隆抗体以流式细胞仪检测 ,并进行定向分化、祖细胞集落培养和脾细胞集落形成单位 (CFU S)的研究。结果　只有AP2 0 187 SCF组可以持续地使转基因的骨髓造血干 祖细胞大量增殖 ,扩增 80d后细胞可达10 1 4倍 ,细胞倍增时间约 30h ,扩增细胞的表型为CD34 、c kit和Sca1等干细胞表面标志强阳性 ,其它细胞表面标志如Gr1、CD1 1b、TER119、CD4 1 、B2 2 0、CD3接近阴性。所扩增的细胞在不同的细胞因子组合下 ,可定向分化为粒细胞、巨噬细胞、红细胞、     

Gene transfer into fetal baboon hematopoietic progenitor cells

We studied hematopoietic progenitors from fetal baboon blood, marrow, and liver at four time points (125, 140, 160, and 175 days) during the third trimester (gestation approximately 180 days) to determine if fetal baboons might be an appropriate model for in utero gene therapy of hematopoietic stem cells (HSCs). Cells were studied for expression of CD34, CD33, CD38, and HLA-DR, for progenitor content in colony-forming cell assays, and for susceptibility of CD34+ progenitors to retrovirus-mediated gene transfer. Throughout the third trimester, the frequency of CD34+ progenitors in blood and marrow appears to remain unchanged at approximately 0.6 and 5.0%, respectively. In liver, progenitors progressively decrease to undetectable levels by day 175. The proportion of fetal baboon bone marrow and liver CD34+ cells expressing CD38 and HLA-DR appears to increase with increasing fetal age, similar to changes reported for human cord blood CD34+ cells. In fetal baboon blood the proportion of CD34+ cells expressing CD33 appears to decrease with increasing gestational age, also similar to changes reported for human cord blood cells. Progenitors from human cord blood and baboon fetal tissues were similarly susceptible to transduction by the gibbon ape leukemia pseudotyped retroviral vector LAPSN(PG13) containing the genes for human placental alkaline phosphatase (AP) and the bacterial neomycin phosphotransferase (neo). Fetal baboon and human hematopoietic progenitor cells undergo similar phenotypic changes during the third trimester of fetal development and are similarly susceptible to retrovirus-mediated gene transfer. The fetal baboon may be a model in which approaches to mobilization and gene transfer into fetal HSCs can be studied.     

Tpo、IL-11基因修饰的基质细胞对CD34+CD38-早期造血祖细胞扩增的影响

目的　观察经Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞对脐血CD3 4 + CD3 8-细胞体外扩增的影响。方法　用载有Tpo、IL 11基因的重组逆转录病毒感染成纤维样基质细胞HFCL ,通过Northernblot法检测基因修饰的HFCL细胞Tpo、IL 11基因的表达。以未经基因修饰的HFCL细胞作为对照 ,将脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞在这种基因修饰的HFCL细胞支持下 ,进行 7d体外扩增后 ,用锥虫蓝拒染法计数活细胞总数 ,并用流式细胞仪分析扩增细胞中CD3 4 + 细胞以及CD3 4 + CD3 8-细胞的比例。结果　在Tpo基因修饰的HFCL细胞、IL 11基因修饰的HFCL细胞和Tpo +IL 11基因共同修饰的HFCL细胞的支持下 ,扩增后CD3 4 + CD3 8-早期造血祖细胞的比例分别为 (1.8± 0 .2 4 ) %、(1.6 2± 0 .2 3) %、(2 .4 5±0 2 8) % ,细胞扩增倍数为 4 .2倍、3.6倍、6 .9倍 ,高于对照组的 (0 .80± 0 .2 3) %和 1.5倍 ,同时扩增细胞总数和CD3 4 + 细胞比例亦高于未经基因修饰的HFCL细胞所支持的扩增体系。结论　Tpo、IL 11基因修饰的基质细胞可有效促进脐血CD3 4 + 造血干 /祖细胞体外扩增 ,同时能有效维持扩增体系中的CD3 4 + CD3 8-细胞以及促进其扩增。     

利用基因芯片分析碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血干细胞CD34~+与CD133~+细胞基因表达的差异

背景:迄今为止,人们利用基因芯片对碱性成纤维细胞生长因子诱导CD34~+和CD133~+干细胞分化后细胞生物学性状、功能调控、基因变化及其表达差异等方面的认识尚不足,有待深入研究.目的:利用基因芯片比较脐血CD34~+和CD133~+细胞基因表达的差异,并探讨碱性成纤维细胞生长因子体外诱导脐血CD34~+和CD133~+造血干/祖细胞分化的基因表达变化,及其对碱性成纤维细胞生长因子反应性差异.方法:利用MiniMACS免疫磁珠法从脐静脉血单个核细胞中分离出CD34~+和CD133~+干/祖细胞,经含碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12细胞营养液培养10～15 d,提取培养前后细胞总RNA,利用Oligo GEArray(r)芯片和GEArray表达分析软件进行芯片数据分析.流式细胞仪检测CD34~+和CD133~+造血干细胞回收率.碱性成纤维细胞生长因子诱导前后CD34~+、CD133~+细胞形态变化.变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA浓度和纯度.基因芯片检测结果.结果与结论:①对20份脐血分别进行CD34~+和CD133~+细胞分选,分选CD34~+细胞纯度为(77.52±5.06)%,回收率为(2.74±1.59)%;CD133~+细胞纯度为(79.16±3.37)%,回收率为(1.12±0.94)%.②新分选出的CD34~+细胞呈球形,经碱性成纤维细胞生长因子培养15 d后,多数细胞形态未发现显著变化,部分细胞出现贴壁生长,可见突起和梭形细胞.CD133~+细胞呈球形,经碱性成纤维细胞生长因子培养15 d后,细胞明显扩增,由圆球形变为不规则形,部分细胞出现贴壁生长.③CD34~+干细胞培养前后总RNA提取质量分别为2 236 ng和1 796 ng;CD133~+干细胞培养前后总RNA提取质量分别为2 518 ng和2 191 ng.④在所检测的263个干细胞相关基因中,脐血CD133~+细胞与CD34~+细胞基因表达差异2倍以上的基因有10种,其中5种基因表达前者高于后者,5种基因表达前者低于后者;碱性成纤维细胞生长因子诱导培养后,CD133~+细胞有32种基因表达显著高于CD34~+细胞,在检测的263个基因中,未见低于CD34~+细胞的基因.证实脐血中新分离的CD133~+细胞和CD34~+细胞基因表达仅有少数基因存在差异;CD133~+细胞对碱性成纤维细胞生长因子的反应性显著强于CD34~+细胞,表现为细胞周期调节、信号转导和分化等基因表达增强.     

骨髓基质细胞对人造血CD_34~+细胞体外扩增及基因转导的作用

目的：探讨造血基质细胞对人外周血干细胞体外培养扩增及基因转导的促进作用。方法：应用基质细胞支持培养扩增体系进行人造血干细胞体外培养扩增及基因转导。结果：骨髓基质细胞和造血生长因子共同支持组的造血ＣＤ＋３４细胞在体外培养３周后,其造血祖克隆形成能力较单纯造血生长因子支持组高３０．７％（Ｐ＜０．０５）。在有基质细胞支持时,逆转录病毒载体上清转导人造血ＣＤ＋３４细胞后,其造血细胞克隆中Ｎｅｏ基因阳性克隆是无基质支持对照组的２倍。结论：基质细胞的支持有维持造血干细胞原始造血活性及促进基因转导的双重好处。     

脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化

同源盒基因家族成员HOXIM反映原始造血干／祖细胞（PHSC／PHPC）的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT—PCR的方法在mRNA水平上检测HOXIM基因的表达，以观察体外扩增脐血CD34^＋细胞自我更新的水平。结果显示：随着体外培养时间的延长，虽然CD34^＋细胞数增加，但HOXB4表达下降；周后，HOXB4几乎检测不到，与成熟外周血淋巴细胞表达HOXIM的水平相同；CD34^＋细胞与骨髓间充质干细胞（BM—MSC）共培养可以减缓CD34^＋细胞HOXIM表达的下降。结论：脐血CD34^＋细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34^＋与BM—MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34^＋细胞自我更新能力的丧失。     

骨髓间充质干细胞分化的成骨细胞支持脐血造血干祖细胞的研究

本研究利用骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞构建二维培养体系,探讨其体外支持脐血干/祖细胞生存的作用.体外进行人骨髓间充质干细胞（MSC）原代培养后诱导为成骨细胞,构建二维培养体系.将免疫磁珠分选的CD34^＋脐血干/祖细胞接种于其中,在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,进行CFU,HPP-CFU和LTC-IC测定并将其分别与MSC、成骨细胞,MSC/成骨细胞（1：2）作为饲养细胞的二维培养体系实验结果相比较.结果发现：在所构建的造血干/祖细胞（HSPC）二维培养体系中,骨髓MSC诱导成骨细胞对于脐血造血干/祖细胞培养的支持作用显著优于其他各组培养体系,尤其对长期造血干细胞（long term-HSC）体外生存有更为明显地支持作用.结论：骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞构建的二维体系对于脐血干/祖细胞体外培养具有支持作用,进一步证实成骨细胞对造血干细胞生存与增殖具有重要调控作用.