Hsv—tk、重组人TNF—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-TK-TNF-α表达载体，观察其在喉癌细胞Hep-2中的瞬时表达，方法：应用PCR方法对各自的进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序，利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK－rhTNF-α并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间成功构建表达载体pEGFP-TK-rhTNF-α，并在该载体转染人喉细胞Hep-2后观察融合蛋白表达情况，结果：酶切鉴定证实TK－rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK－rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamH1位点间，并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK－rhTNF-α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体便于观察转染细胞中TK－rhTNF-α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为自杀基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达

目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。     

脑缺血肺损伤大鼠肺组织TNF-α的表达变化

目的 探讨脑缺血后损伤肺组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达变化。方法 成年SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血肺损伤组(n=13),其中每组5只用于免疫组化检测TNF-α在肺的定位分布,余8只分别用于RT-PCR和Western blot检测TNF-α mRNA和蛋白水平变化。术后24 h取肺组织行RT-PCR、术后48 h取肺组织行Western blot检测肺组织TNF-α mRNA和蛋白表达水平;术后3 d取肺组织行免疫组织化学染色检测肺组织内TNF-α的定位分布。结果 肺组织TNF-α mRNA和蛋白表达在脑缺血肺组织明显增加,与假手术组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。TNF-α主要分布在气道上皮细胞和巨噬样细胞。结论 脑缺血后损伤肺组织TNF-α表达上调,提示其可能与脑缺血肺损伤炎症反应有关。     

TNF-α在鼻息肉组织中的表达和意义

目的 :探讨肿瘤坏死因子 α(tumornecrosisfactor α ,TNF α)在鼻息肉中的表达和意义。方法 :采用放射免疫分析法研究TNF α在鼻息肉组织匀浆、胎儿下鼻甲组织匀浆和鼻息肉患者的血清、正常成人血清及脐血中的表达及其意义。结果 :鼻息肉组织匀浆、鼻息肉患者的血清、正常成人血清中TNF α平均质量浓度 (μg/L)分别为 1 0 3± 0 14 ,0 79± 0 11,0 79± 0 13,鼻息肉组织匀浆中TNF α的含量高于鼻息肉患者的血清、正常成人血清中的含量 ,差异显著 (P <0 0 1)。结论 :TNF α在鼻息肉中过度表达 ,通过局部炎症微环境的调控 ,在鼻息肉的发生、发展过程中起重要作用     

鼠抗人TNF-α单域抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

ＲＴ－ＰＣＲ法获得鼠抗人肿瘤坏死因子－α单克隆抗体Ｅ６轻,重链可变区基因序列,分别构建融合表达载体ｐＧＥ６ＶＨ和ｐＧＥ６ＶＬ,利用大肠杆框图 系统表达ＶＨ和ＶＬ单域抗体蛋白。方法：将ＲＴ－ＰＣＲ法获得的Ｅ６ＶＨ和Ｅ６ＶＬ基因分别克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中,使它们受控于Ｐｔａｃ启动子,转化大肠杆菌ＤＨ５α,经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,１００ｇ／ＬＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达     

重组人肿瘤坏死因子突为体的构建和表达

运用ＰＣＲ技术，对天然人肿瘤坏死因子α（ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｔｏｒ－α，ＴＮＦ）基因进行改造，去了天然ＴＮＦＮ端的７个氨基酸，同时以Ａｒｙ％８Ｌｙｓ＾９Ａｒｇ＾１０Ｐｈｅ６５１５７分别取代了原来的ＰｒｏＳｅｒＡｓｐＬｅｕ形成 的突变体ＴＮＦＡ。交突变体克隆于表达载 ｐＢＶ２２０后，在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中得到了表达，表达产物的分子量１７ＫＤ。表达量为菌体总蛋白量的１５％。     

重组模型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST—TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽－S－转移酶（GST）的融合基因表达载体。方法：用RT－PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结: 重组模型TNF的GST融合表达及纯化优化,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

重组膜型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST-TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合基因表达载体。方法：用RT-PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700 bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：建立了重组膜型TNF的GST融合表达及纯化优势,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

hTNFα寡聚组氨酸融合蛋白的表达

目的　利用大肠杆菌表达系统对人肿瘤坏死因子(hTNFα)的寡聚组氨酸(6×His)融合蛋白进行表达和纯化研究。方法　采用大肠杆菌表达系统的表达载体pET-28a(+)和pET-22b(+)表达了hTNFα的6×His融合蛋白,其6×His分别位于融合蛋白的N和C端,并利用寡聚组氨酸与过渡态金属离子的高亲和力性质,经Ni2+-IDASepharose6B亲和柱对表达产物进行了纯化。结果　其表达量分别为菌体总蛋白的45%和8%。前者在胞内以不溶性包涵体存在,未对表达产物作进一步纯化;后者在胞质空间以可溶性存在,经亲和纯化的hTNFα-6×His纯度可达90%以上,得率为0.4mg/100ml,并对L929细胞具有杀伤的功能,其活力为5.42×104U/mg。结论　表达产物经纯化后具有细胞毒的活性。     

TNFR1BP/IgGFc融合蛋白载体的构建、表达及其生物学活性研究

目的 构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性.方法 将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和Western blot法检测转染细胞的培养上清中TNFR1BP/IgGFc融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验、细胞毒抑制实验检测融合蛋白对TNFR1的封闭作用.结果 经PCR和核苷酸序列测定证实TNFR1BP基因正确插入质粒pIG/3C.ELISA检测证实,在转染细胞培养上清中有融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验和细胞毒抑制实验证实融合蛋白能结合L929细胞表面的TNFR1,并能抑制分泌型肿瘤坏死因子α(sTNF-α)介导的细胞毒作用.结论 成功构建并实现TNFR1BP/IgGFc融合蛋白真核表达;体外实验证实此融合蛋白可通过与细胞表面TNFR1结合,从而拮抗sTNF-α介导的生物学效应.     

NF-κB活化和TNF-α表达在大鼠心肌梗死后心力衰竭中的作用

目的　探讨心肌梗死后 (MI)大鼠心肌核因子 κB (NF κB)活化、肿瘤坏死因子 α(TNF α)表达在心室重塑和心力衰竭 (心衰 )进展中的作用。方法　结扎大鼠冠状动脉前降支复制MI模型 ,同时设假手术组 (SH组 ) ,4、8、12周后检测血流动力学指标 ,称取心脏组织湿重。对左室非梗死区心肌组织采用Western blot法检测TNF α蛋白表达 ,电泳动度迁徙率法 (EMSA)检测NF κB活性。结果　各时相MI组与同期SH组相比 :①MI组左室舒张末压 (LVEDP)显著增加 (P <0 0 5 ) ,平均动脉压 (MAP)、左心室内压最大上升和下降速率 (±dp dtmax)均显著降低 (P <0 0 1) ;另外 ,除MI1 2w 组左室相对重量 (LVRW )外 ,其余组LVRW、右室相对重量 (RVRW )均明显增加 (P <0 .0 5 )。②MI组心肌TNF α蛋白表达均显著增加 ,呈时间依赖性 ,与心功能呈负相关 ;③MI组心肌NF κB活性均明显增加。结论　MI后衰竭心肌NF κB持续激活和炎性细胞因子TNF α表达增加可能是心室重塑、心衰进行性发展的重要机制之一。     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库。方法利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。由L inker-prim erm ix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体。再用RS prim erm ix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因。以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库。结果成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库。经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011pfu。结论rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础。     

内毒素、TNF-α、IL-6在慢性肝炎中的作用研究

目的研究内毒素血症与慢性肝炎的关系,探讨内毒素在慢性肝炎中的作用机理.方法收集如下血标本正常健康献血员30例,慢性乙型肝炎患者30例,慢性深度黄疸乙型肝炎患者60例.采血当日送检功能.分别用鲎实验改良基质法进行内毒素定量测定,放射免疫方法(RIA)测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6).结果内素素、TNF-α、IL-6和总胆红素(TBIL)水平在三组患者中依次升高,各组两两比较,其差异有显著性意义(P＜0.01);四项指标进行直线相关性分析,各指标之间呈正相关关系(P＜0.01).结论内素素血症与肝脏损害的严重程度有关;内毒素可能主要是通过引起以下TNF-α为主的细胞因子水平的升高发挥肝脏损害作用的.     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库.方法 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体.再用RS primer mix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因.以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库.结果 成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库.经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011 pfu.结论 rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础.     

充血性心力衰竭患者血清TNF-α水平变化

目的探讨充血性心力衰竭患者血清TNF-α水平与心衰发生、发展的关系.方法用放射免疫法测定46例心衰患者和51例对照组血清TNF-α水平,心衰患者按心功能级别分组,进行对比分析.结果心衰患者各组较对照组均有显著性差异(p＜0.01),且Ⅳ级最高,Ⅲ级次之,Ⅱ级最低,心功能分级逐渐加重,TNF-α水平增高越明显,同时比较两组病因不同心衰患者血清TNF-α水平无变化(p＞0.05).结论TNF-α不仅参与心衰的发生,而且加速了心衰的发展,血清TNF-α水平增高反映了心衰的严重性.     

妊娠期高血压疾病患者血清IL-6、TNF-α检测

目的:探讨血清IL-6、肿瘤坏死因子α(TNFα)在妊娠期高血压疾病发病中的作用。方法:应用放射免疫法分别测定26例重度子痫前期患者、27例轻度子痫前期患者及30例正常妊娠妇女血清中IL-6、TNF-α的含量。结果:子痫前期患者血清IL-6((220.08±31.82)ng·L-1)、TNFα((1.79±0.25)μg·L-1)水平均高于正常妊娠组((114.63±14.63)ng·L-1、(1.16±0.13)μg·L-1)(P<0.05)。重度子痫前期患者血清IL6((246.27±22.76)ng·L-1)、TNFα((1.99±0.17)μg·L-1)水平均高于轻度子痫前期者((199.13±20.79)ng·L-1、(1.60±0.14)μg·L-1)(P<0.05);轻度子痫前期患者血清中IL-6、TNF-α的表达高于正常妊娠组(P<0.05);血清中IL6、TNFα的表达与子痫前期的病情程度密切相关。结论:IL-6、TNF-α在妊娠期高血压疾病的发生、发展中起重要作用。     

慢性捆绑应激对大鼠学习记忆能力及海马TNF-α表达的影响

目的探讨学习记忆能力与海马细胞因子TNF -α的关系。方法把大鼠分为应激组和正常组 ,应激组大鼠每天捆绑 6h ,持续 2 1d ,第 2 2d用Y迷宫测试两组大鼠学习记忆能力 ,用原位杂交细胞化学显示两组大鼠海马TNF -αmRNA阳性细胞。结果应激组大鼠学习记忆成绩明显下降 (P <0 .0 5 ) ,其海马TNF -αmRNA阳性细胞数明显高于正常组。结论应激组大鼠学习记忆下降与其海马相关细胞因子TNF -α有联系     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

抗人TNF-α单克隆抗体对银屑病患者血清TNF-α的中和研究

目的:研究抗人TNF-α单克隆抗体对寻常型银屑病患者血清TNF-α的中和效应。方法:应用双抗体夹心ELISA方法检测正常人及患者血清应用单克隆抗体中和前后TNF-α的浓度改变。应用L929细胞检测正常人和患者血清抗体中和前后的生物学活性变化情况。结果:正常人与银屑病患者血清TNF-α的浓度分别为:(3.146±6.184)pg/ml及(62.723±38.379)pg/ml;其生物学活性分别为:(6.817±5.086)%及(57.498±9.125)%。抗体中和后患者血清TNF-α的浓度为:(0.503±1.178)pg/ml;中和后的生物学活性为:(25.378±14.863)%。结论:寻常型银屑病患者血清中TNF-α的浓度及生物学活性均高于正常对照,而抗人TNF-α单克隆抗体在体外可以很好地中和患者血清中TNFα的浓度及其生物学活性。