工频磁场对骨髓间充质干细胞基因表达谱的影响

目的：用基因芯片技术筛选经工频磁场刺激后骨髓间充质干细胞（MSCs）的差异表达基因，并初步探讨磁场定向分化骨髓MSCs的机制。方法体外培养SD大鼠MSCs，取第三代细胞用磁场刺激，提取暴磁组和未暴磁对照组（对照组）细胞总RNA，反转录制备杂交探针并运用大鼠Oligo基因芯片进行杂交，扫描信号并分析结果；选取感兴趣基因进行半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）验证。结果：与对照组细胞相比，在暴磁组细胞中发现表达差异显著的基因有153个，其中74个基因表达上调，79个基因表达下调，这些差异表达基因主要涉及细胞增殖分化、代谢、转录调控、应激及信号转导等多个方面。RT-PCR结果显示，与对照组相比，暴磁组的MSCsDuspl、RablmRNA表达水平上调，与芯片结果一致。结论：在50Hz、1．2mT的磁场作用下MSCs的基因表达发生了变化，这些基因主要是细胞增殖分化调控基因、转录调控基因、代谢相关基因及应激基因等，为进一步研究磁场对MSCs的分化机制奠定了基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验

背景：组织工程化软骨的构建为软骨缺损的修复开辟了全新的途径，克服了传统治疗方法的不足、目的：探讨分离骨髓间充质干细胞，在特定培养液条件下诱导其向软骨细胞表型转化的体外培养方法。设计：完全随机实验单位：广西医科大学第一附属医院创伤骨科、手外科及广西医科大学组织学与胚胎学教研率方法：实验于2002-08／2003-04在广西医科大学完成。实验动物选择新生断奶SD大鼠20只抽取大鼠四肢骨髓，Perrcoll梯度分离液离心分离结合贴擘筛选法得到间充质下细胞，在含体积分数0．15的胎牛血清的低糖DMEM培养液中，置于37℃，体积分数为0．05的CO2培养箱内培养10～14d。传代后以体积分数0.15的胎牛血清的高糖DMEM培养液（含转化生长因子β1 10μg/L．地塞米松10^-7mol/L维生素C50mg／L）对其进行诱导培养。主要观察指标：观测在体外特定培养条件下间充质干细胞的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况结果：所有20只SD大鼠全部进行分析观察，无一例脱失：①分离获取了较高纯度的骨髓间充质干细胞，保持了细胞的活性。②骨髓间充质干细胞原代培养晕均匀分布的集落样生长，呈长梭形；传代培养中形态特性无明显变化，细胞增殖周期缩短，细胞均质性明显提高。③诱导后的细胞由梭形向多角形转变，Ⅱ型胶原免疫组化阳性。④诱导培养后软骨特异性基质Ⅱ型胶原免疫组化阳性结论：①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的骨髓间充质十细胞②间充质于细胞在体外特定培养条件下能大量增殖，实现数量扩增、③间充质干细胞在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软骨特异性基质，可成为软骨组织工程理想的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨

背景:骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等分化的能力.目的:验证用组织工程方法诱导分化骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨损伤的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成.材料:20只两三月龄的健康新西兰白兔,雌雄不限.方法:①诱导分化体外培养的兔骨髓间充质干细胞.实验组加入地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C培养1周,再将转化生长因子β替换碱性成纤维细胞生长因子培养3周;以不加诱导剂细胞做对照.②取20只兔.建立膝关节软骨缺损模型,随机分为3组.实验组10只膝关节内植入经诱导的骨髓间充质干细胞;对照组植入未经诱导的骨髓间充质干细胞:空白对照组植入生理盐水.分别于术后2,4,6,8周时处死实验组处死2只,对照组和空白对照组各处死1只进行各项指标检测.主要观察指标:①细胞形态学.②碱性磷酸酶活性的测定.③大体标本观察.④X射线观察.⑤组织切片观察.结果:①经诱导的骨髓间充质干细胞,细胞形态发生明显变化,逐渐由长梭形变为多角形,类似于软骨细胞样形态.②骨髓间充质干细胞经诱导4周后,其碱性磷酸酶活性明显增强(P＜0.05).③术后8周,实验组标本修复组织表面光滑,与周围软骨间界限模糊不清:X射线表现为关节间隙变宽,软骨下骨质囊变得到改善:组织切片观察显示与正常软骨细胞基本上一致.结论:自体间充质干细胞移植可修复关节软骨损伤.     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景:半月板损伤后自行修复能力有限,组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径.骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞.取第3代的骨髓间充质干细胞,实验组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化,对照组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液.在诱导第7,14,21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果.结果与结论:①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d,第4代以后相对延长,为5～9 d.②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变.③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色,尤其细胞密集生长的区域蓝染较深,染色强度随诱导时间延长而增强.对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染.④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性,各期染色无明显差异.对照组未见Ⅱ型胶原表达,实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达.提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质,作为半月板组织工程种子细胞来源可行.     

骨髓间充质干细胞的研究

骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓中的非造血细胞,构成造血微环境,支持造血,具有向成骨细胞、软骨细胞、成肌/心肌细胞、脂肪细胞、神经元等分化的潜能,表达多种表面标记物,但不具特异性.骨髓、外周血的MSCs是一循环的整体,具有其自身代谢、更新的循环,终末分化可能跨越胚层界限.MSCs应用前景广阔.     

丹参诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及相关基因的表达

背景：骨髓间充质干细胞在适当的诱导条件下，可在体内外分化为神经细胞与神经前体细胞，但多数研究多以含血清及细胞因子的培养基为诱导剂。目的：以丹参作为诱导剂，观察骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达，拟寻找新的诱导方法。设计：以细胞为观察对象的重复观察测量，对照性体外实验。单位：四川大学基础与法医学院人体解剖教研室。材料：实验于2004-10／2005-12在四川大学基础与法医学院人体解剖教研室完成。为四川省重点实验室。SD大鼠，体质量150～200g，由本校动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。丹参注射液由安徽天洋药业有限公司提供，批号20050411。方法：采用密度梯度离心和细胞贴壁法培养骨髓间充质干细胞，取第5代细胞进行诱导。用丹参注射液诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化，对照组以不含丹参注射液的无血清培养液进行培养。采用RT-PCR检测诱导前后细胞ngn-1，mash—1的表达，免疫组织化学检测诱导前后的骨髓间充质干细胞NSE和GFAP的表达。主要观察指标：①RT-PCR检测细胞诱导前后ngn-1，mash-1的表达。②免疫组织化学检测诱导前后的骨髓间充质干细胞NSE和GFAP的表达。结果：①骨髓间充质干细胞贴壁生长情况良好，大部分细胞贴壁呈长梭形。加入诱导剂后，细胞体积缩小，部分细胞有突起，形状类似神经元。②RT-PCR反应检测显示，未经诱导的骨髓间充质干细胞ngn-1，mash-1，mRNA为阴性，诱导后呈阳性表达。③细胞免疫组织化学检测显示，诱导后的细胞NSE和GFAP呈阳性反应，对照组为阴性。结论：丹参注射液能够诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

骨髓间充质干细胞与关节软骨修复的研究进展

关节软骨缺乏血运,创伤、退变等导致的软骨缺损难以自我修复.近年随着组织工程学的发展,利用组织工程的方法修复关节软骨已成为研究的热点.最初人们试图通过体外扩增软骨细胞来修复关节软骨缺损,但软骨细胞为分化终末细胞,体外培养传代过程中易使细胞发生"去分化"即向成纤维细胞转化,表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原,丧失分泌软骨基质的能力,并且组织来源有限.相比之下,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)具有以下优点:(1)取材方便,可抽取少量骨髓获得,而不必通过手术,避免对患者造成不必要的二次创伤.(2)表型稳定,在体外培养过程中,BMSCs可以保持未分化表型不断增殖.(3)具有强大的体外扩增能力和很好的多向分化潜能.因而BMSCs已成为软骨组织工程再生修复应用的重点种子细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌HCN2及HCN4基因的表达

背景:研究表明在多种心脏疾病后的心室肌中HCN2和HCN4表达异常,且与室性心律失常密切相关.骨髓间充质干细胞移植可修复受损心肌,但对梗死后心室离子通道重构的影响仍不清楚.目的:检测大鼠骨髓间充质干细胞移植入梗死心肌后左心室HCN2和HCN4的表达变化.方法:取3周龄SD大鼠5只,Percoll法分离培养骨髓间充质干细胞.成年健康雄性SD大鼠30只,随机分为4组:DMEM组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎,正常对照组不进行任何干预.造模后4周,DMEM组在梗死边缘区和中心区分5点注入DMEM培养液,细胞移植组同法注入第3代骨髓间充质干细胞悬液200 μL,细胞数5×10~6个.采用RT-PCR及Western-blot法检测左心室HCN2,HCN4在mRNA及蛋白水平的表达.结果与结论:正常心肌区:各组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达基本相似(P > 0.05).梗死边缘区:DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显多于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于DMEM组(P < 0.05).梗死中心区:DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达与DMEM组基本相似(P > 0.05).提示急性心肌梗死后梗死边缘区HCN2,HCN4基因在mRNA和蛋白水平的表达升高,骨髓间充质干细胞移植可能通过下调梗死边缘区HCN2,HCN4的表达来降低心律失常.     

大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验

背景组织工程化软骨的构建为软骨缺损的修复开辟了全新的途径,克服了传统治疗方法的不足.目的探讨分离骨髓间充质干细胞,在特定培养液条件下诱导其向软骨细胞表型转化的体外培养方法.设计完全随机实验.单位广西医科大学第一附属医院创伤骨科、手外科及广西医科大学组织学与胚胎学教研室.方法实验于2002-08/2003-04在广西医科大学完成.实验动物选择新生断奶SD大鼠20只.抽取大鼠四肢骨髓,Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法得到间充质干细胞,在含体积分数0.15的胎牛血清的低糖DMEM培养液中,置于37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱内培养10～14 d.传代后以体积分数0.15的胎牛血清的高糖DMEM培养液(含转化生长因子β110μg/L,地塞米松10-7mol/L,维生素C 50 mg/L)对其进行诱导培养.主要观察指标观测在体外特定培养条件下间充质干细胞的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况.结果所有20只SD大鼠全部进行分析观察,无一例脱失.①分离获取了较高纯度的骨髓间充质干细胞,保持了细胞的活性.②骨髓间充质干细胞原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈长梭形;传代培养中形态特性无明显变化,细胞增殖周期缩短,细胞均质性明显提高.③诱导后的细胞由梭形向多角形转变,Ⅱ型胶原免疫组化阳性.④诱导培养后软骨特异性基质Ⅱ型胶原免疫组化阳性.结论①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的骨髓间充质干细胞.②间充质干细胞在体外特定培养条件下能大量增殖,实现数量扩增.③间充质干细胞在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化,并能分泌软骨特异性基质,可成为软骨组织工程理想的种子细胞.     

骨髓腔输注异基因间充质干细胞对移植后大鼠骨髓间充质干细胞重建的作用

为了研究骨髓腔内注射（IBM）异基因间充质干细胞（MSC）对造血干细胞移植后大鼠骨髓MSC重建的作用，研究供体MSC植入状态以探讨MSCs的作用机制，将雌性F344胎鼠及新生鼠外周血（FNPB）及雄性F344大鼠BrdU标记骨髓MSC共移植入经致死量^60Coγ射线预处理的雌性Wistar大鼠，其中FNPB均由IBM输注，MSC则通过IBM或尾静脉注射。观察受鼠存活状况、供体HSC植入水平及骨髓MSC恢复情况，并以PCR检测Y染色体和免疫荧光法检测受鼠骨髓MSC的来源。结果显示：两个FNPB＋MSCs共移植组大鼠移植后60天均100％存活，两组比较生存率和供体HSC植入水平无统计学差异，但明显优于单纯FNPB移植组；移植后30天时各移植组受鼠骨髓MSC的增殖能力均未达正常水平，但MSC骨髓腔共移植组集落数（66．0±10．6）明显优于MSC骨髓腔和静脉共移植组及单纯FNPB移植组（P〈0．01）；移植后60天时，免疫荧光法检测供体BrdU标记的MSC显示仅在少部分受体发现供、受体源性MSCs嵌合，但两个共移植组存活受鼠均检测到供体MSC来源Y染色体。结论：异基因MSC输注可促进造血干细胞移植受者骨髓MSC恢复，尤以IBM输注为佳。     

骨髓间充质干细胞向软骨的诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞在体外不同环境及生物因子的作用下, 可以转化为软骨细胞,是目前软骨组织工程领域研究的重点.目的:对近年来细胞因子、应力刺激、三维空间结构在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的作用作一综述.方法:应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中2001-01/2010-06关于骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的文章,在标题和摘要中以"骨髓间充质干细胞,软骨细胞,诱导分化"或"bone marrow mesenchymal stem cells,chondrocyte,differentiation"为检索词进行检索.选择文章内容与骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章.初检得到109篇文献,根据纳入标准选择关于骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的26篇文章进行综述.结果与结论:细胞因子、应力刺激、三维空间结构等因素影响骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,优化这些因素的条件,可以更容易分化出软骨细胞表型.随着骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的深入研究,这些因素的应用必将更为广泛.     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。目的:体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法:密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导(含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子110μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110μg/L、转铁蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、维生素C0.05mmol/L),倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。结果与结论:培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达C...     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导（含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子110μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110μg/L、转铁蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、维生素C0.05mmol/L）,倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。     

人骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

目的:探讨应用壳聚糖支架三维立体培养人骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),体外诱导其分化成为软骨细胞的可行性。方法:实验于2004-02/11在中山大学附属第三医院中心实验室完成。相分离法制备三维多孔壳聚糖支架,检测支架的孔隙率、孔径。抽取人骨髓,密度梯度离心法分离纯化,体外培养扩增。将第3代MSCs复合于支架中培养,应用无血清诱导液诱导细胞向软骨细胞分化,通过组织学染色及扫描电镜观察细胞的形态、增殖及功能的改变。结果:通过相分离法可制备出高孔隙率的三维壳聚糖支架,孔隙率达86.5%,孔隙分布均匀且相互连通,平均孔径182μm。诱导分化的MSCs在支架中贴附良好,呈现典型的软骨细胞形态,并有细胞外基质分泌。结论:人MSCs在三维立体培养环境下可诱导分化为软骨细胞,作为种子细胞在组织工程软骨的构建及软骨损伤的修复中有良好的应用价值。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果.目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果.设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成.对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取.方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9.分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM.②转染窄载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体.③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体.④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体.⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合.主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达.结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<0.01).反转录-聚合酶链反应和Westem blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多:软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多.结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9.     

RNA干扰抑制骨髓间充质干细胞中caspase-3基因的表达

背景:研究发现,骨髓间充质干细胞移植入心肌梗死区域后易发生凋亡导致移植细胞存活率较低。目的:构建caspase-3基因的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs,siRNAs)表达质粒,探讨其在体外对骨髓间充质干细胞中caspase-3基因表达的抑制作用。方法:根据siRNA设计原则,针对caspase-3基因设计并合成siRNAs,构建caspase-3siRNA表达载体并利用脂质体介导方法瞬时转染骨髓间充质干细胞。实验分为正常对照组,阴性序列对照组(si-ncg)和3个干扰组(si-caspase-3-1、si-caspase-3-2和si-caspase-3-3)。结果与结论:成功构建了caspase-3siRNA表达载体并转染骨髓间充质干细胞。Westernblot和RT-PCR检测转染后的骨髓间充质干细胞中caspase-3蛋白和mRNA的表达下降,以转染si-caspase-3-3的骨髓间充质干细胞下降最明显。结果提示构建的caspase-3siRNA表达质粒在体外能抑制骨髓间充质干细胞中caspase-3基因的表达。     

乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡机制

背景：有研究表明乙醇可诱导骨髓间充质干细胞凋亡并引起成骨细胞和破骨细胞数量减少,但乙醇对骨髓间充质干细胞凋亡的影响以及作用机制目前尚不十分清楚。目的：观察乙醇对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡、线粒体功能的影响及bcl-2、Caspase-3表达的变化。方法：应用全骨髓培养法分离培养SD大鼠骨髓间质干细胞,置于0,100,200,300,400,500,600,700,800,900mmol/L乙醇中作用24h,MTT法进行细胞毒性药物实验;置于0,100,200,300,400,500mmol/L乙醇中作用6,12,24h,AnnexinV/PI双标记法流式细胞仪检测细胞凋亡和线粒体膜电位变化情况;置于0,427mmol/L乙醇中作用24h,RT-PCR法检测与凋亡有关的基因bcl-2和Caspase-3mRNA表达水平。结果与结论：MTT检测结果显示427mmol/L是乙醇对大鼠骨髓间充质干细胞生长的半数抑制浓度;AnnexinV/PI检测结果表明,与0mmol/L组比较,随作用时间的延长与乙醇浓度的增加,骨髓间充质干细胞凋亡率及线粒体跨膜电位的破坏水平明显升高（P〈0.05）。与0mmol/L组比较,乙醇作用24h后427mmol/L组bcl-2mRNA表达水平下降,Caspase-3mRNA表达水平增加（P〈0.05）。说明乙醇能诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡,凋亡的发生可能与线粒体膜电位破坏、线粒体功能障碍、bcl-2和Caspase-3激活有关。