实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因表达

目的建立检测肺癌肿瘤抑制因子1（TSLC1）基因mRNA表达的实时荧光聚合酶链反应（PCR）方法。方法设计特异性引物和TaqMan探针,以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因作为对照,建立检测TSLC1基因表达的实时荧光PCR方法,并采用细胞株和宫颈组织样本进行验证。结果该方法检测TSLC1基因mRNA的检测下限为每反应10个细胞或2拷贝cDNA,总不精密度为3.1%。TSLC1基因mRNA在子宫肌瘤、低度鳞状上皮内病变（LSIL）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）与宫颈癌患者宫颈组织中的表达率分别为100%、75%、55%和24%。宫颈癌细胞株中未检出TSLC1基因mRNA表达。所有样本中均有GAPDH基因mRNA表达。结论该实时荧光PCR方法能够有效检测TSLC1基因mRNA表达,是进一步研究TSLC1基因在宫颈癌发生中的作用及宫颈癌早期诊断的重要工具。     

实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因方法的建立和应用

目的 建立实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因的方法,提高TSLC1基因检测方法的灵敏度和精密度.方法 用Light Cycler(R) R480 PCR仪根据设计好的引物与探针,在一定的反应条件下检测宫颈组织TSLC1基因,采用罗氏Light Cycler(R) R480 PCR专用软件进行数据分析.结果 该方法最低检测量为103 copies/ml,检测范围为107～102 copies/ml,10次总的Ct值CV为1.7%.结论 所建立的实时荧光PCR检测各类宫颈组织,正常组织低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、宫颈癌组织TSLC1基因的表达率分 别为100%,72%,56%,23%,可以作为进一步研究TSLC1基因表达在肿瘤早期诊断中的价值的重要工具.     

FHIT和TSLC1基因在宫颈组织中的表达及其与HPV感染的关系

目的检测宫颈组织脆性组氨酸三联体(FHIT)基因与肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)基因表达,研究他们与宫颈癌发生及人类乳头瘤病毒(HPV)感染之间的关系。方法采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测正常宫颈组织20例、低度鳞状上皮内病变(LSIL)20例、高度鳞状上皮内病变(HSIL)45例及宫颈癌患者标本33例FHIT基因及TSLC1基因表达,同时检测这些标本中高危型HPV感染情况。结果正常宫颈组织、LSIL、HSIL和宫颈癌组织中HPV的感染率、FHIT基因表达率及TSLC1基因表达率分别为0%、30%、71%和100%,100%、80%、36%和18%以及100%、75%、33%和24%。3项指标在不同宫颈组织之间差异有统计学意义(P<0.01)。所有FHIT基因与TSLC1基因表达缺失的患者均存在高危型HPV感染。受试者工作特征(ROC)曲线分析表明检测FHIT与TSLC1基因表达缺失对宫颈癌及HSIL具有诊断价值。结论 FHIT基因与TSLC1基因在HPV感染之后、宫颈癌发生过程的早期阶段就可能发生表达缺失。对高危型HPV感染者进行FHIT与TSLC1基因表达检测,有可能成为宫颈癌早期诊断的重要参考依据。     

组氨酸三联体及肺癌抑制因子1基因表达与宫颈癌发生及人乳头瘤病毒感染的相关性

目的探讨肺癌抑制因子1(TSLC1)及组氨酸三联体(FHIT)在正常宫颈组织、宫颈鳞状上皮内病变及宫颈癌组织中的表达及其与人乳头瘤病毒(HPV)的关系。方法采用细胞免疫组化法测定35例正常子宫组织、40例低度鳞状上皮内病变(LSIL)、38例高度鳞状上皮内病变(HSIL)及35例子宫癌组织中TSLC1及FHIT的表达情况。采用HC2基因杂交捕获仪(HC-Ⅱ)检测各组HPV感染情况。结果 HSIL、宫颈癌组织中FHIT、TSLC1阳性表达率显著低于正常宫颈组织及LSIL,而HPV阳性率则高于正常宫颈组织及LSIL(P0.05)。FHIT表达与病理分级、临床分期及淋巴结转移相关(P0.05)。TSLC1表达与临床分期及淋巴结转移相关(P0.05)。在正常宫颈组织、LSIL、HSIL及宫颈癌组织中,FHIT、TSLC1表达与HPV感染呈负相关(P0.05)。结论 FHIT、TSLC1表达缺失发生在HSIL阶段,FHIT、TSLC1表达缺失与HPV感染参与宫颈鳞状上皮细胞内病变、宫颈癌发生、侵袭及转移具有密切的关系。     

FISH检测宫颈脱落细胞中hTERC基因的意义

目的 探讨在宫颈脱落细胞中检测不同级别宫颈病变人端粒酶基因(hTERC)的扩增情况及其临床意义.方法 用荧光原位杂交技术(FISH)检测22例正常宫颈脱落细胞、38例低度鳞状上皮内病变(LSIL)、43例高度鳞状上皮内病变(HSIL)及36例宫颈鳞状细胞癌脱落细胞中hTERC的表达情况.结果 hTERC基因在正常宫颈脱落细胞、LSIL、HSIL及宫颈癌中的阳性表达率分别为4.55%、23.68%、86.05%和91.67%.各组hTERC基因阳性率与正常对照组相比均差异显著(P＜0.05);高度鳞状上皮内病变及宫颈癌组与低度鳞状上皮内病变组相比差异极显著(P＜0.01).结论 hTERC基因高表达在宫颈癌发生、发展中可能起重要作用,经细胞学检测hTERC基因有望作为宫颈癌筛查及宫颈病变预后预测的辅助指标.     

乳癌组织TSLC1基因mRNA表达及启动子甲基化状态

目的探讨乳癌组织中非小细胞肺癌抑制因子（TSLC1）基因mRNA表达及其启动子甲基化状态。方法应用实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR,分别检测39例人乳癌组织及对应癌旁组织中TSLC1基因mRNA表达及其启动子甲基化状态,并探讨二者之间的关系。结果乳癌组织中TSLC1mRNA的表达量是癌旁组织的0.44倍。乳癌组织及癌旁组织中TSLC1基因甲基化率分别为56.4%、10.3%,乳癌组织中TSLC1基因甲基化率明显高于相应癌旁组织（χ2=16.673,P〈0.01）。甲基化的癌组织中TSLC1mRNA的表达量是非甲基化者的0.60倍,表达TSLC1mRNA的癌组织的甲基化率为50%,不表达者为100%,两者之间差异有显著性（P=0.046）。结论 TSLC1基因异常甲基化是其在乳癌组织中表达缺失或下调的原因之一,在乳癌的发生发展中起一定作用,可能成为乳癌的早期诊断及治疗靶点基因之一。     

P16INK4A和人乳头瘤病毒检测在液基细胞学筛查宫颈病变中的应用

目的:探讨P16INK4A和高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)在宫颈癌早期及癌前病变中的表达及液基细胞学标本在P16INK4A检测中的应用.方法:选取8993名宫颈炎患者进行液基薄层细胞学检查,其中有64例呈不良反应,应用免疫组织化学S-P方法检测其p16INK4A表达,同时采用实时定量PCR法检测HPV表达.结果:P16INK4A在低度鳞状上皮内病变(LSIL)中的阳性率为28.6%,高度鳞状上皮内病变(HSIL)中的阳性率为81.8%.鳞状细胞癌(SCC)中的阳性率为100.0%.随着宫颈病变级别的上升,P16INK4A及HR-HPV阳性率均相应增高.结论:P16INK4A的表达与宫颈癌的发生、发展相关,并与宫颈病变分级及HPV感染高度相关,是筛查液基细胞学组织标本宫颈病变的一个有用指标.     

hGPR 87基因表达与宫颈癌发生及浸润转移的关系

目的:通过检测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)患者宫颈组织hGPR 87基因表达水平来分析基因表达与宫颈癌发生及浸润转移的关系.方法:采用SYBR Green I实时定量PCR方法分别检测30例宫颈癌、30例重度宫颈上皮内肿瘤(HCIN)、30例轻度宫颈上皮内肿瘤(LCIN)患者和15例正常对照(子宫肌瘤)新鲜宫颈组织的hGPR 87基因表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式(2-△(α)×100%)计算hGPR 87基因相对表达量.结果:宫颈癌患者组的表达量最高,HCIN组次之,正常对照组的表达量最低,四组比较差异有统计学意义(P=0.02).宫颈癌患者中有淋巴结转移的比无淋巴结转移的宫颈组织中hGPR 87的mRNA含量要高(P=0.002).结论:本研究揭示了不同宫颈疾病发展阶段hGPR 87基因表达的变化特点,hGPR 87基因表达水平在宫颈癌及伴淋巴结转移患者以升高为主,可能与宫颈癌发生及浸润转移有一定关系.     

cornulin在宫颈病变中的表达及其差异

目的了解宫颈炎、宫颈癌前病变及宫颈癌组织中cornulin的表达情况,初步评价cornulin与宫颈癌变的相关性。方法收集各个级别的宫颈癌前病变及可疑宫颈癌患者行诊断性或治疗性经宫颈环形电切割术(LEEP)后的石蜡包埋组织标本131例,其中宫颈低级别鳞状上皮内病变(LSIL)39例、宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)49例、宫颈浸润癌(ICC)43例,以38例宫颈炎患者作为对照组。所有标本经兔抗人cornulin多克隆抗体免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法显示并评分。在行宫颈LEEP术之前取其宫颈脱落细胞,宫颈炎患者经阴道镜下活检病理诊断为慢性宫颈炎后取其宫颈脱落细胞,采用聚合酶链反应(PCR)测定cornulin基因的mRNA表达。结果免疫组化结果显示,除宫颈炎组与宫颈LSIL组之间无差异(P=0.148)外,其余各组间cornulin蛋白表达差异均有统计学意义(P均=0.000);随着宫颈病变级别的逐渐升高,cornulin蛋白表达逐渐下降,至ICC时表达明显降低;cornulin mRNA的表达与其蛋白表达一致。以cornulin弱阳性(+)或阴性(-)作为筛查阳性指标,检出宫颈HSIL以上病变的敏感性为70.7%,特异性为85.7%;检出宫颈LSIL以上病变的敏感性为56.5%,特异性为94.7%。结论 cornulin有望成为检测宫颈病变程度的标记物之一。     

人乳头瘤病毒基因分型200例检测结果分析

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)基因分型诊断在宫颈癌筛查中的应用价值,为宫颈癌的防治提供依据。方法运用膜杂交多重检测技术对宫颈可疑标本进行HPV基因分型诊断,并与组织病理学诊断进行相关分析。结果 580例宫颈可疑标本经HPV基因分型诊断筛查出200例阳性,HPV感染率为34.48%,经组织病理学确诊106例为不同程度宫颈病变,病变率达18.28%。106例不同程度病变宫颈中感染HPV 106例,其中47例低度鳞状上皮内病变(LSIL)感染HPV,52例高度鳞状上皮内病变(HSIL)感染HPV,7例宫颈癌感染HPV。结论 HPV感染与宫颈病变密切相关,HPV基因分型诊断在宫颈癌筛查中具有重要意义。     

实时荧光定量PCR检测DHX32 mRNA方法的建立及初步应用

目的建立实时荧光定量PCR(FQ-RT-PCR)检测DHX32 mRNA的方法并研究其在结直肠癌中的表达。方法用Taq-Man探针建立检测DHX32 mRNA的FQ-RT-PCR方法,评价其特异性、重复性及扩增效率,并用该法检测DHX32 mRNA在结直肠癌中的表达水平。结果批内变异系数1.1%～1.9%,批间变异系数1.2%～2.5%;扩增效率为0.85,相关系数为0.9990。癌组织DHX32 mRNA表达水平中位数为1.90×10-3(四分位间距5.47×10-3),明显高于癌旁组织0.09×10-3(四分位间距1.41×10-3),两者差异有统计学意义(P<0.05)。DHX32 mRNA表达水平与结直肠癌癌栓形成、淋巴结转移、组织学分级以及Dukes分期关系密切(P<0.05)。肿瘤的恶性程度越高,DHX32 mRNA表达水平越高。结论FQ-RT-PCR检测DHX32 mRNA的方法特异性好,重复性高,操作简单,无污染。DHX32 mRNA表达上调可能在结直肠癌发生、发展中起重要作用,其表达水平可作为结直肠癌恶性程度的评价指标。     

建立实时荧光LAMPA法检测肺炎支原体

目的:建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法:在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果:实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达

目的 建立实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中FPGS mRNA表达的方法,研究MTX对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药细胞株中FPGS的基因表达差异,并用于观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGS mRNA表达水平的变化.方法 用SYBR Green Ⅰ为荧光染料,以β-actin作参照,建立检测FPGS mRNA的实时荧光定量PCR方法.根据Ct值、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价.并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的14例白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达.结果 建立的标准曲线Ct值与模板浓度有良好的线性关系,FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0.996 8和0.998 7,斜率分别为-3.595和-3.740,批内CV为1.27%～2.95%,批间CV为3.82%;熔解曲线均呈单个特异峰,扩增效率相似(斜率为0.021 7);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞中FPGS mRNA相对含量分别为(3.51±0.66)和(0.16±0.01),A549亲本细胞(S)中FPGS mRNA相对含量为(1.00±0.31),差异有统计学意义(F=64.45,P＜0.01);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞间FPGS mRNA相对含量差异有统计学意义(q=9.29,P＜0.01).白血病患者应用MTX治疗耐药后,FPGS mRNA表达水平为(0.35±0.04),用药前为(1.00±0.44),差异有统计学意义(t=8.83,P＜0.01).结论 建立的实时荧光定量PCR检测FPGS mRNA的方法重复性好、特异度高,可用于FPGSmRNA含量分析.MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA表达发生了变化,MTX 2种对映体形式在细胞耐药机制中可能发挥了不同的作用.     

实时荧光定量PCR检测脂多糖对NR8383细胞TNF-α mRNA的影响

目的实时荧光定量PCR检测脂多糖(LPS)诱导NR8383肺泡巨噬细胞前后TNF-αmRNA的表达情况。方法体外培养的肺泡巨噬细胞系NR8383分成LPS刺激组和PBS(磷酸盐缓冲液)对照组,LPS终浓度为1μg.mL-1,共培养2 h后,TRIzol法提取细胞总RNA,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测细胞TNF-αmR-N     

一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

产AmpC酶的大肠埃希菌中PBP4的检测及分析

目的检测产AmpCβ-内酰胺酶(简称AmpC酶)的大肠埃希菌中编码非必需青霉素结合蛋白4(PBP4)的基因dacB mRNA表达水平,探讨PBP4在产AmpC酶的革兰阴性菌耐药机制中的作用。方法收集上海市第六人民医院2003至2010年间部分产AmpC酶的大肠埃希菌34株,聚合酶链反应(PCR)扩增dacB基因和ampC基因,实时定量PCR检测dacB mRNA表达水平,并分为dacB mRNA表达上调组与dacB mRNA表达下调组,实时定量PCR方法检测ampC mRNA表达水平。微量肉汤稀释法药敏试验检测抗菌药物的敏感性。结果 34株大肠埃希菌中,26株(76.47%)dacB mRNA表达水平上调,dacB mRNA表达水平上调组ampC mRNA表达水平高于下调组,P<0.05。结论推测大肠埃希菌临床菌株中PBP4高表达有助于产生AmpC酶的高表达,从而引起细菌耐药性的增加。