日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶的重组表达及其在血吸虫生活史各阶段的表达分析

目的 目的 在大肠杆菌中原核表达、 纯化日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶 （rSjFBPA）, 观察其在血吸虫生活史各阶段 的表达。方法 方法 以日本血吸虫成虫cDNA为模板扩增rSjFBPA基因, 克隆至pET28a （+） 质粒后, 再转化入E. coli BL21。 含重组质粒的菌株经IPTG诱导后, 采用SDS?PAGE和Western blotting分析鉴定重组蛋白rSjFBPA是否表达, 用层析法纯 化rSjFBPA并用SDS?PAGE鉴定其纯度。同时, 用RT?PCR方法分析SjFBPA在血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段的表 达情况。结果 结果 经PCR扩增出目的基因, 含目的基因的TA克隆质粒经双酶切和测序鉴定, 证明插入片段与预期目的基 因序列相符。Western blotting结果显示, 表达后的重组蛋白可与His?tag单克隆抗体发生特异性反应。经镍亲和层析法 制备了纯化的重组SjFBPA蛋白, 纯化重组蛋白浓度达4 mg/ml。RT?PCR结果显示, SjFBPA在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成 虫和虫卵阶段均有表达。 结论 结论 SjFBPA基因被成功克隆和表达, 其在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段均有表 达。     

日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白 基因的克隆 表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白（SjTollip）基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性。结果构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别。虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低。免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高。结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫内皮分化相关因子-1基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫内皮分化相关因子(endothelial differentiation-related factor)-1编码基因(SjEDF-1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的特异性表达情况。方法制备日本血吸虫卵、尾蚴、童虫和成虫等各发育阶段的总RNA,采用RT-PCR方法 ,以管家基因SjActin为内参,根据SjEDF-1基因全长编码序列(GenBank登录号为AY336498)的开放阅读框设计引物进行RT-PCR扩增,分析日本血吸虫各发育阶段SjEDF-1基因mRNA表达情况。将SjEDF-1基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,以纯化的重组SjEDF-1蛋白免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性及该蛋白在日本血吸虫各发育阶段的表达差异。结果 RT-PCR结果显示,除尾蚴外,在虫卵、童虫、雄虫和雌虫期均扩增出约405bp的片段。含重组质粒SjEDF-1/pET-28a的转化子细菌,经IPTG诱导,获得以不可溶的包涵体形式存在的重组蛋白,其相对分子质量(Mr)为20000,与预测的融合蛋白大小相符。Western blotting分析结果显示,纯化后的重组蛋白SjEDF-1可被日本血吸虫感染兔血清识别,在血吸虫童虫和成虫阶段检测到目的蛋白的表达。结论重组蛋白SjEDF-1具有较强的免疫原性,在血吸虫童虫和成虫期检测到该蛋白特异表达。     

日本血吸虫凝溶胶蛋白的克隆、表达及转录时相分析

目的 构建日本血吸虫凝溶胶蛋白(Sjgelsolin)的原核表达载体,获得其表达产物并分析其在不同发育阶段的转录水平.方法 根据序列AY814387设计引物,体外扩增Sjgelsolin的蛋白质编码序列,将其插入pET28a(+)质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.提取日本血吸虫虫卵,尾蚴,7-d童虫,42-d雌、雄成虫的总RNA,用半定量RT-PCR分析Sj gelsolin在每个样本中的转录水平.结果 成功构建了pET28a(+)-Sjgelsolin重组质粒,并获得高水平的表达.Sjgelsolin转录子在尾蚴和雌虫成虫中未被检测到,而在7-d童虫和42-d雄虫成虫中被检测到.结论 Sjgelsolin在体外获得表达,且其转录是受发育调控的.     

日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF功能区片段的克隆及表达分析

目的 克隆表达日本血吸虫凋亡诱导因子(SjAIF)功能区片段,并对其生物学特性进行初步分析。方法 应用PCR技术扩增日本血吸虫凋亡诱导因子的功能区片段,构建原核重组表达质粒并诱导其表达,实时定量PCR分析其在不同发育时期童虫和成虫的转录水平,通过Western-blot和间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性和免疫原性,应用免疫组化分析该蛋白在虫体内的分布情况。结果 克隆了SjAIF功能区片段,大小为831 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET-28a(+)-SjAIF,并在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白分子量35 kD。实时定量PCR分析表明SjAIF基因在童虫和成虫的各个发育阶段均有转录,其中7 d~21 d虫体表达量较低,42 d和28 d虫体表达量较高,雌虫表达量高于雄虫。重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性,免疫小鼠后诱导产生了较高水平的特异性IgG抗体。该蛋白主要存在于日本血吸虫体被,少部分分布于实质组织中。结论 成功表达了SjAIF基因的功能区片段,对其生物学特性进行了初步分析,为进一步研究该基因生物学功能和作用提供了基础。     

几种日本血吸虫新基因的表达特性分析

目的　对从日本血吸虫尾蚴cDNA文库中筛选出的 3种新基因 ,腺苷酸激酶 (AK)、蛋白酶体激活因子PA2 8β亚单位 (PA2 8)、8kDa钙结合蛋白 (CBP)基因进行表达特性研究。方法　分别提取雌雄成虫、尾蚴、断尾童虫的总RNA ,利用RT-PCR酶混合物试剂盒 ,一步法对总RNA进行反转录及PCR扩增。结果　AK及PA2 8蛋白基因可以在雌雄成虫、尾蚴、断尾童虫体内表达 ,CBP只在尾蚴及断尾童虫中表达。结论　所筛到的AK、PA2 8、CBP基因均是日本血吸虫特异基因 ,AK及PA2 8基因可以在雌雄成虫、尾蚴、断尾童虫体内表达 ,CBP可能是日本血吸虫尾蚴、童虫的期特异性基因     

日本血吸虫消减雌性成虫cDNA文库的建立及其特异表达基因的筛选

目的 筛选雌性日本血吸虫特异表达基因。方法 感染日本血吸虫6周的家兔,用静脉灌注法收集成虫,经核糖核酸固定液固定,分别提取雌、雄成虫总RNA,纯化后获得mRNA,并反转录为cDNA。用抑制性消减杂交技术(SSH)构建雌、雄成虫正向消减(雌虫消减雄虫)及反向消减(雄虫消减雌虫)cDNA文库。用斑点杂交法筛选差异表达基因,挑选目标基因片段(与正向消减探针杂交的信号明显高于与反向消减探针杂交信号的克隆)进行测序、同源性搜索及基因功能预测分析。以日本血吸虫肌动蛋白(actin)基因作内参照,用半定量PCR(semi-quantitative PCR)鉴定目标基因在雌、雄虫体内的表达。结果 得到正向消减及反向消减cDNA文库,斑点杂交筛选出50个雌虫特异性表达的克隆,经测序得到42个表达序列标签(EST),其中,有17个基因(占40.5%)与已知日本血吸虫卵壳蛋白基因高度同源;17个基因(占40.5%)与日本血吸虫未知基因高度同源、且有一小片段与卵壳蛋白基因高度同源;有8个基因(占19.0%)与日本血吸虫其他未知基因高度同源。半定量PCR结果,6个基因在雌虫体内的表达水平明显高于雄虫,分别与GenBank的血吸虫卵壳蛋白基因AY222885、AY222895、AB017097、AF519182、M32281及血吸虫其他基因AY813556高度同源。结论 构建了雌、雄成虫正向消减及反向消减cDNA文库。用SSH可筛选日本血吸虫雌性特异性表达基因。     

日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆、表达及虫期表达差异分析

目的克隆和表达日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因1(SjAPRT1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的转录和蛋白表达情况。方法根据SjAPRT1基因序列(GenBank登录号为AAW24796)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,分析其在日本血吸虫各发育阶段转录本差异。将目的基因亚克隆至载体pET28a(+),转化至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化结果。纯化的蛋白SjAPRT1免疫新西兰白兔制备免疫兔血清,蛋白质印迹(West-ern blotting)分析其免疫反应性及其在日本血吸虫不同发育阶段表达的差异。结果在虫卵、尾蚴、童虫和成虫期均检测到SjAPRT1转录本(561 bp),获得了重组SjAPRT1蛋白。Western blotting分析表明,纯化的重组蛋白SjAPRT1可被日本血吸虫感染兔血清识别,虫卵、童虫和成虫粗抗原可被SjAPRT1免疫兔血清识别,在Mr 25 000处有特异性条带。结论日本血吸虫SjAPRT1蛋白在虫卵、童虫和成虫各期均有表达...     

日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究

目的了解日本血吸虫促凋亡基因Sj BAD的生物学、免疫学和转录表达特征,评估Sj BAD重组蛋白作为日本血吸虫病疫苗候选分子的潜力。方法根据Sj BAD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增Sj BAD基因,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD。采用实时定量PCR检测Sj BAD基因在日本血吸虫不同发育期及42 d雌、雄虫体内的转录水平;应用Western blotting和间接ELISA法分析Sj BAD重组蛋白的抗原性和免疫原性。用重组抗原Sj BAD免疫BALB/c小鼠,通过计算减虫率及肝脏减卵率,评估重组抗原作为血吸虫病候选疫苗分子的潜力。结果成功克隆了日本血吸虫Sj BAD基因,构建了重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD,并在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子量约为22 k Da。Western blotting表明Sj BAD具有较好的抗原性和免疫原性,间接ELISA法检测表明重组蛋白免疫小鼠产生了高水平的特异性抗体Ig G。实时定量PCR检测发现Sj BAD基因在日本血吸虫的各个发育阶段均有转录,以14 d表达量最高,且在雄虫体内的表达量高于雌虫。两次动物免疫试验表明,重组蛋白Sj BAD在BALB/c小鼠体内诱导了30.82%和27.87%的减虫率,及42.52%和45.84%的肝脏虫卵减少率,均显著高于PBS对照组(P均0.05)。结论成功克隆、表达了日本血吸虫促凋亡相关基因Sj BAD,该基因在日本血吸虫不同发育期虫体内均有表达。纯化的重组Sj BAD蛋白在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区cDNA核酸疫苗的研究

目的　为研究血吸虫性别特异性表达基因的核酸免疫特性。方法　本研究将所克隆的编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因保守区cDNA片段克隆到真核表达载体 pcDNA3中 ,得到的重组质粒直接免疫昆明系小鼠 ,感染血吸虫尾蚴 ,7周后剖杀小鼠冲虫 ,进行成虫和虫卵计数。结果　其减虫率为 32 4 % ,肝脏减卵率为 4 6 9% ,与对照组比较差异显著。结论　初步显示血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗具有一定的核酸免疫保护功能     

日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白基因的克隆 表达与功能分析

目的 目的 克隆、 表达日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白 （SjHMGB1）, 并研究其功能特性。方法 方法 利用逆转录PCR （RT?PCR） 技术从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增出编码SjHMGB1的完整开放阅读框DNA片段, 然后将其亚克隆至 原核表达载体质粒pET28a （+） 中, 构建重组表达质粒SjHMGB1?pET28a。将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21 （DE3）, 含 重组质粒的转化子细菌经异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导以表达重组SjHMGB1蛋白。通过镍螯合琼脂糖亲和胶亲和层 析法制备纯化的重组SjHMGB1蛋白。通过DNA迟滞实验和动物免疫鉴定重组SjHMGB1的DNA结合和免疫学特性。通 过免疫印迹试验 （Western blotting） 和RT?PCR确定SjHMGB1分子在日本血吸虫不同发育阶段的表达情况。以重组SjH? MGB1为抗原免疫小鼠, 3次免疫后每只小鼠感染45±2条血吸虫尾蚴, 42 d后剖杀, 计算减虫率与减卵率, 观察其诱导抗血 吸虫感染的免疫保护性作用。 结果 结果 采用RT?PCR法从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增到长度约为530 bp的特异性 DNA条带, 序列分析证实为编码SjHMGB1蛋白的开放阅读框序列。将此片段亚克隆至表达质粒pET28a （+） 中, 成功构建 了重组表达质粒SjHMGB1?pET28a。含重组表达质粒SjHMGB1?pET28a的转化子细菌经IPTG诱导能表达分子量约28 kDa 的可溶性SjHMGB1蛋白。采用镍螯合亲和层法制备了纯化的重组SjHMGB1蛋白。DNA迟滞试验显示纯化的Sj HMGB1 蛋白可同超螺旋及线性DNA结合, 重组SjHMGB1免疫小鼠能产生高效价的抗体IgG, Western blotting分析证实重组SjH? MGB1蛋白能被重感染小鼠血清所识别, 表明重组表达的SjHMGB1分子具有天然蛋白的功能活性与免疫学特性。RT?PCR 和Western blotting分析显示SjHMGB1分子在血吸虫成虫和虫卵期大量表达, 而在尾蚴阶段表达量极低。免疫保护性试验 结果表明, 重组SjHMGB1分子免疫不能诱导有效的抗血吸虫感染免疫保护性作用。结论 结论 获得了编码SjHMGB1基因和 纯化的具有天然功能活性的重组SjHMGB1蛋白; 重组SjHMGB1蛋白具有强烈的免疫原性, 但不能诱导有效的抗血吸虫感 染免疫保护性作用。     

日本血吸虫肌钙蛋白T(SjTnT)基因克隆 表达及免疫保护效果评估

目的 目的 克隆、 表达日本血吸虫肌钙蛋白T （SjTnT） 编码cDNA, 评估重组抗原抗血吸虫感染的免疫保护效果。方 方 法 法 利用PCR技术扩增SjTnT基因, 构建重组表达质粒pET28a （+） ?SjTnT并诱导表达, 用重组蛋白rSjTnT免疫BALB/c小 鼠制备免疫血清。利用免疫印迹试验 （Western blotting） 和酶联免疫吸附试验 （ELISA） 检测rSjTnT诱导的免疫反应。采 用rSjTnT免疫小鼠, 评估其诱导的免疫保护效果。结果 结果 成功克隆、 表达了日本血吸虫SjTnT基因。Western blotting显 示rSjTnT能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别, 具有良好的免疫原性。rSjTnT能诱导小鼠产生高水平的特异性IgG抗体。 动物免疫保护试验表明, rSjTnT能诱导小鼠产生33.89%的减虫率以及43.94%的肝脏减卵率。结论 结论 制备的rSjTnT在小 鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果, 为评估SjTnT的生物学功能奠定了基础。     

SV40LT基因重组腺病毒载体的包装、鉴定及用于转染日本血吸虫童虫细胞的研究

目的构建携带SV40LT基因的重组腺病毒表达载体,制备具有感染力的重组腺病毒,观察其转染日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）童虫细胞后的表达情况。方法采用体外连接法构建好的携带SV40LT基因的重组腺病毒质粒（AdHu5-SV40LT）转化Stbl2感受态菌,获得重组腺病毒质粒后,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,获得出重组腺病毒（AdHu5-SV40LT）。将重组腺病毒感染Sj童虫细胞,采用RT-PCR和免疫组织化学检测SV40LT基因的表达情况。结果重组腺病毒载体质粒可转染293A细胞并可在293A细胞内进行有效的复制;提取病毒DNA进行PCR检测证实含有SV40LT目的基因。以重组腺病毒能感染Sj童虫细胞,经RT-PCR和免疫组化检测有SV40LT基因在细胞中的表达。结论成功包装了具有感染能力的含SV40LT基因的重组腺病毒,感染Sj童虫细胞后目的基因有表达,为进一步探索日本血吸虫细胞永生化提供了实验依据。     

3种青蒿素衍生物对日本血吸虫吡喹酮抗性株童虫的体内作用效果观察

目的观察3种青蒿素衍生物双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚对日本血吸虫吡喹酮抗性株童虫的体内作用效果。方法以经11轮亚治疗剂量吡喹酮筛选的日本血吸虫为吡喹酮抗性株,以未暴露于吡喹酮的日本血吸虫作为吡喹酮敏感株,收集2虫株尾蚴感染小鼠,以300mg/kg双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚对感染后7~8 d童虫分别进行2次灌服用药(总剂量600 mg/kg),所有小鼠于感染后45 d解剖,收集小鼠体内成虫并计数,计算减虫率和减雌率。结果 300 mg/kg双氢青蒿素、蒿甲醚和青蒿琥酯2日疗法(总剂量600 mg/kg)对日本血吸虫吡喹酮敏感株7~8 d童虫的减虫率为69.8%~71.0%,减雌率为75.4%~79.8%;对日本血吸虫吡喹酮抗性株7~8 d童虫的减虫率为64.6%~66.1%,减雌率为69.3%~71.1%,差异均无统计学意义(均p0.05)。结论 日本血吸虫吡喹酮抗性株对青蒿素类衍生物双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚依然敏感,青蒿素衍生物与吡喹酮在日本血吸虫中不存在交叉抗药性。     

日本血吸虫核糖体蛋白SjRPS4基因及蛋白联合免疫保护性价值的研究

摘要：目的研究日本血吸虫核糖体蛋白（SjRPS4）基因和蛋白联合免疫对小鼠的保护效果。方法将SjRPS4 DNA疫苗和重组蛋白疫苗间隔2w 3次分别或联合免疫昆明鼠,2w后,每鼠感染尾蚴20条,45d后剖杀小鼠,计数成虫,肝、肠、粪及每雌子宫虫卵数。结果联合免疫组与生理盐水组相比较,获得了49.7%的减虫率、62.6%的粪减卵率、46.0%的每雌子宫减卵率、49.0%的肝减卵率、54.3%的肠减卵率（P均<0.01）,均显著高于单独的SjRPS4 DNA疫苗组36.2%的减虫率、48.7%的粪减卵率、35.2%的每雌子宫减卵率、41.8%的肝减卵率、40.5%的肠减卵率（P均<0.05）,及单独蛋白免疫组38.2%的减虫率、50.1%的粪减卵率、38.9%的每雌子宫减卵率、42.4%的肠减卵率（P均<0.05）。结论SjRPS4 DNA疫苗及重组蛋白疫苗均可诱导小鼠产生一定的免疫保护作用,且联合免疫方案保护效果优于单一疫苗。     

花生四烯酸对小鼠日本血吸虫病治疗效果观察

目的 观察花生四烯酸对小鼠体内日本血吸虫的杀虫效果。方法 小鼠感染日本血吸虫尾蚴后,被随机分为给药组、溶剂组和未处理组。给药组小鼠在不同给药时间点,以300 mg/kg的剂量连续2 d或连续7 d灌服花生四烯酸溶液,溶剂组小鼠在相应时间点灌服玉米油,各组小鼠于感染后42 d解剖,收集小鼠体内成虫、肝内虫卵并计数,计算减虫率和减卵率。结果 300 mg/kg花生四烯酸对小鼠体内日本血吸虫成虫(28~35 d)有杀虫效果,减虫率超过40%,肝内减卵率超过70%,与溶剂组的差异均有统计学意义(P<0.05)。300 mg/kg花生四烯酸对小鼠体内童虫期(1~28 d)日本血吸虫没有明显的杀虫效果。结论 花生四烯酸对日本血吸虫成虫有杀虫作用,具有被用于日本血吸虫病药物治疗的潜力。     

日本血吸虫带电多泡体蛋白5的生物学特性研究

目的 克隆、表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S. japonicum)带电多泡体蛋白5(CHMP5),并对其生物学特性进行研究。方法 利用PCR扩增S. japonicum CHMP5基因目的片段,构建重组质粒pET28a(+)-CHMP5,并对该基因进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR检测CHMP5在不同时期虫体中的转录水平。对体外表达的重组CHMP5蛋白进行纯化与质谱鉴定,并通过Western blotting检测其反应原性。利用免疫组化实验分析CHMP5在虫体中的分布。以小鼠为动物模型,评估重组CHMP5蛋白抗日本血吸虫病的免疫保护效果。结果 S. japonicum CHMP5的开放阅读框为675 bp,编码224个氨基酸,具有6个B细胞抗原表位;主要定位于S. japonicum虫体的体被上。CHMP5基因在35 d和42 d虫体中的转录水平高于其它检测时期,且42 d 雌虫中的转录水平约是42 d雄虫的3倍。克隆表达的重组CHMP5蛋白其理论分子量约为29 kDa,具有较好的反应原性;用其免疫小鼠24 d,即可使小鼠产生较高水平的IgG抗体,并最终诱导产生18.96%的减虫率和42.98%的肝脏减卵率。结论 成功克隆、表达了S. japonicum体被蛋白CHMP5,其在不同发育时期虫体中均有表达,获得的重组CHMP5蛋白可诱导小鼠产生部分的免疫保护效果,为深入探讨S. japonicum CHMP5的生物学功能提供了基础。