HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

疱疹病毒I型中国株胸苷激酶基因治疗脑瘤的临床前研究

目的验证胸苷激酶（ＴＫ）基因介导的羟甲基无环鸟苷（ＧＣＶ）系统对人脑恶性神经胶质瘤基因治疗的有效性及安全性。方法从中国疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ－Ｉ）株（１７）中分离了胸苷激酶（ＴＫｃ）基因，并作了ＤＮＡ序列分析，组建了含ＴＫｃ基因的逆转录病毒重组载体（ｐＬＴＫｃＳＮ）及其含ｐＬＴＫｃＳＮ病毒的病毒生产细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）。体外有效性试验：应用ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ与大鼠脑瘤Ｃ６细胞共培养后用ＧＣＶ处理。体内有效性试验：以ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ原位注入大鼠颅内移植的Ｃ６脑瘤。安全性试验：通过小鼠、大鼠和猴植入ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ并注射ＧＣＶ观察其毒副作用。结果ＨＳＶ－ＩＴＫｃ基因与ｐＯＰＦＨＳＶ－１ＴＫ基因比较有５个核苷酸和２个氨基酸的变异。ｐＬＴＫｃＳＮ及其ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ，在体内外能有效地介导ＧＣＶ对Ｃ６产生细胞毒作用。其病毒滴度为２×１０６ＣＦＵ／ｍｌ。经过４８只小鼠、２４只大鼠和６只猴体内未见严重毒副作用和不可逆的病理改变。结论疮疹病毒胸苷激酶基因治疗脑肿瘤是有效和安全的，通过药审后可用于临床试验。     

腺病毒-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗载体的构建及鉴定

对腺病毒－单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＡＤＶ－ＨＳＶ－ＴＫ）治疗载体进行构建与鉴定。利用脂质体介导的共转染,将质粒ＰＪＭ１７与ＦＰＡ／ＴＫ－ＲＳＶ共转染入２９３细胞系,利用挑取单噬斑,获取单克隆的重组腺病毒,并在２９３细胞系中进行扩增、纯化。经ＰＣＲ、ＤＮＡ测序,酶切鉴定,用空斑实验（ｐｌａｑｕｅａｓｓａｙ）测定,分析病毒的活性。结果：重组病毒经ＰＣＲ测序证实已携带ＴＫ片段,酶切鉴定出现特异性的酶切图谱,重组病毒具高滴度的感染活性。结论：ＡＤＶ－ＴＫ基因的构建为ＨＳＶ－ＴＫ基因的临床应用提供了更为有效的手段。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

腺病毒—单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗载体的构建及鉴定

对腺病毒－单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＡＤＶ－ＨＳＶ－ＴＫ）治疗载体进行构建与鉴定。利用脂质体介导的共转染,将质粒ＰＪＭ１７与ＦＰＡ／ＴＫ－ＲＳＶ共转染入２９３细胞系,利用挑取单噬斑,获取单克隆的重组腺病毒,并在２９３细胞系中进行扩增、纯化．经ＰＣＲ、ＤＮＡ测序,酶切鉴定,用空斑实验（ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）测定,分析病毒的活性。结果：重组病毒经ＰＣＲ测序证实已携带ＴＫ片段,酶切鉴定出现特异性的酶     

自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞缺氧预处理的延迟保护作用

目的：观察缺氧预处理（ＰＣ）对于自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）缺氧复氧（Ｈ／Ｒ）损伤的延迟保护作用，并探讨其可能机制。方法：对ＶＳＭＣ于缺氧ＰＣ２４ｈ后进行Ｈ（２ｈ）／Ｒ（１ｈ），结束实验时测定其Ｈ／Ｒ后细胞存活率、乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）释放和ＡＴＰ含量，并测定其金属硫蛋白（ＭＴ）量。结果：缺氧ＰＣ明显减轻Ｈ／Ｒ造成的ＳＨＲ的ＶＳＭＣ存活率下降、ＡＴＰ耗竭和ＬＤＨ释放，并使细胞内应激蛋白ＭＴ含量升高１．３倍，上述指标与正常血压对照组ＷＫＹ大鼠ＶＳＭＣ的结果相近。结论：培养的ＳＨＲ的ＶＳＭＣ亦存在ＰＣ的延迟保护作用，其保护机制涉及ＭＴ合成增多。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因工程化细胞和更昔洛韦系统的急慢性毒性

目的：探讨单纯疱疹病毒Ｉ型胸苷激酶基因工程化细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统的动物体内急、慢性毒性。方法：将ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和（或）以β－半乳糖苷酶基因为报告基因的ＰＡ３１７细胞悬液注入小鼠、大鼠和灵长类动物体内，７ｄ后部分动物再全身应用ＧＣＶ。分批处死动物，观察ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和ＧＣＶ系统在不同种属动物的体内急、慢性毒性。采用ＰＣＲ和原位杂交方法直接检测胸苷激酶     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究：Ⅱ.HSV—tk／A …

采用细胞接种、Ｘ－ｇａｌ染色、ＴＫ基因的ＰＣＲ和病理切片观察,分别将ＰＡ３１７／ＢＡＧ,ＰＡ３１７／ＴＫ产病毒细胞注射动物体内,结果产病毒细胞在动物体内存活期均不超过１个月;产病毒细胞在体内有形成肿瘤,也没有发现严重的炎症 反应;ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统用于动物基因治疗,ＡＣＶ及其代谢物产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。说明反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＶＣ系统的在动物体内取得了安全的结果。     

神经胶质瘤基因治疗中旁观者效应的动物试验

目的：探讨单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）Ｉ型胸苷激酶（ＴＫ）基因逆转录病毒载体生长细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统杀伤大鼠脑内神经胶质瘤细胞的旁观者效应。方法：用Ｃ６，Ｃ６ＸＳＮ，Ｃ６ＴＫ及不同比例的ＴＫ（＋）和ＴＫ（－）混合细胞接种于大鼠右侧额叶脑内，５ｄ后动物腹腔内注射ＧＣＶ溶液，剂量为１５ｍｇ／ｋｇ，每日２次，共１０ｄ。细胞接种后３周，所有动物处死，测量肿瘤大小，计算各组动物的     

小鼠造血干细胞因子基因克隆及在CHO细胞中的表达

克隆造血干细胞因子并在ＣＨＯ细胞中表达。方法：采用ＰＣＲ方法从ｐＲＣ／ＣＭＶ（含ＳＣＦｃＤＮＡ）中钓取ＳＣＦｃＤＮＡ膜外段活性区，克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，转染入ＣＨＯ细胞；用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｍＲＮＡ水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。     

孕妇巨细胞病毒,弓形虫和细小病毒B19感染与异常生育关系的 …

目的：研究孕妇感染巨细胞病毒（ＣＭＶ），弓形虫（ＴＯ），细小病毒Ｂ１９与异常生育的关系，方法：应用ＰＣＲ方法检测实验组２０７例怀孕及有异常妊娠史妇女的血，宫颈分泌物，流产物和羊水中ＣＭＶ，ＴＯ和Ｂ１９ＤＮＡ，对照组２１０例正常孕妇检测宫颈分泌物中ＣＭＶ，ＴＯ才Ｂ１９ＤＮＡ。结果实验组ＣＭＶ，ＴＯ和Ｂ１９ＤＮＡ阳性率分别为１６．９１％（３５／２０７，１１．１１％（２３／２０７）和９．１８％（１９／２     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因的扩增,克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ｉ型胸苷激酶基因扩增，克隆和测序。方法：从单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ），将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序。结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区１１８２ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸，ＴＫ的第３７６个氨基酸，其中含１２个     

PCR循环测序法检测K-ras和HCV 5'非编码区基因变异

目的：建立一种简单、快速、可靠的ＤＮＡ序列分析方法，并利用此方法分析Ｋｒａｓ基因和ＨＣＶ５′非编码区基因的变异情况。方法：ＰＣＲ循环测序法是将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析相结合的一种研究方法。根据此技术原理，建立了以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶、荧光标记的２′，３′双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ）直接进行ＰＣＲ扩增产物序列分析的方法。应用该方法对人肺癌组织中的Ｋｒａｓ癌基因和丙型肝炎病毒５′非编码区（ＨＣＶ５′ＮＴＲ）进行了序列测定。结果：肺癌组织中的Ｋｒａｓ基因第１外显子第３５位碱基发生点突变（ＧＧＴ→ＧＡＴ）；属于高度保守区的ＨＣＶ５′ＮＴＲ存在基因变异。结论：ＰＣＲ循环测序法具有简单、快速、结果可靠等特点，为基因突变的检测和病原体的核酸序列分析提供了一个快速实用的方法。     

逆转录病毒载体介导的基因治疗中可复制逆病毒的检测

目的：探讨逆转录病毒载体导的基因治疗中,可复制逆转录病毒（ＲＣＲ）的检测方法,为其在应用中的安全性奠定基础。方法：构建含抗ＨＩＶ－、整合酶单链抗体基因的逆转录病毒表达载体（pＳＬＸＣＭＶ／ＩＮ－sＦv）,应用３Ｔ３放大实验继Ｓ＋／Ｌ－试验对其包装细胞（ＰＡ３１７／ＩＮ－sＦv）上清中ＲＣＲ进行了检测,并以野生型４０７０Ａ病毒为阳性对照。结果：含ＩＮsＦv的包装细胞上清中ＲＣＲ呈阴性,不同稀释度的阳性对照     

反转录—聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用

为呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染的临床诊断寻求敏感，特异的检测方法，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增毒培养液和急性呼吸道感染患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因，并应用地高辛标记ｃＤＮＡ探针对扩增产物进行鉴定。结果成功地提取了ＲＳＶｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经扩增得到４７１ｂｐ左右ｃＤＮＡ区带。流感病毒Ｂ，副流感病毒２型，腺病毒７对照无扩增带，ＲＳＶ培养液１０倍连续稀释至１：１０００，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增仍可见４     

孕妇巨细胞病毒、弓形虫和细小病毒B_(19)感染与异常生育关系的研究

目的：研究孕妇感染巨细胞病毒（ＣＭＶ）、弓形虫（ＴＯ）、细小病毒Ｂ１９与异常生育的关系。方法：应用ＰＣＲ方法检测实验组２０７例怀孕及有异常妊娠史妇女的血、宫颈分泌物，流产物和羊水中ＣＭＶ、ＴＯ和Ｂ１９ＤＮＡ；对照组２１０例正常孕妇检测宫颈分泌物中ＣＭＶ、ＴＯ和Ｂ１９ＤＮＡ。结果：实验组ＣＭＶ、ＴＯ和Ｂ１９ＤＮＡ阳性率分别为１６．９１％（３５／２０７），１１．１１％（２３／２０７），和９．１８％（１９／２０７）。对照组ＣＭＶ、ＴＯ和Ｂ１９ＤＮＡ阳性率分别为５．２４％（１１／２１０）、３．３３％（７／２１０）和１．９０％（４／２１０）。两组之间有十分显著差异（Ｐ＜０．０１）。结论：孕妇感染ＣＭＶ、ＴＯ和Ｂ１９与异常生育关系极为密切。     

一种检测异基因骨移植后供体植活的巢式PCR方法

目的 利用ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ－２Ｋ＾ｄ）和Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２Ｋ＾ｂ）小鼠Ｈ－２Ｋ等位基因不同,建立一种检测异基因骨髓移植后供体植活的方法。方法 分别以供鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）和受鼠（Ｃ５７ＢＬ／６）及ａｌｌｏ－ＢＭＴ后小鼠骨髓和脾细胞ＤＮＡ为模板进行巢式ＰＣＲ,并用琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ扩增产物。结果 以供鼠和移植后小鼠骨髓和脾细胞ＤＮＡ行巢式ＰＣＲ可扩增了约４２１ｂｐ的特异性片段,而未经移植的Ｃ     

野生型P53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的；观察野生型Ｐ５３对胃癌细胞系的生长抑制作用，方法，以逆转录病毒为载体将野生型Ｐ５３基因导入胃癌细胞系ＭＫＮ２８和ＢＧＣ８２３，检测Ｐ５６３对肿瘤细胞的影响。结果：Ｐ５３在转染细胞中表达水平提高，外源性Ｐ５３的导入使肿瘤细胞增殖细胞抗原（ＰＣＮＡ）水平明显降低；Ｇ０／Ｇ１期细胞数增加，Ｓ期降低。转染Ｐ５３基因的ＭＫＮ２８细胞裸鼠体内成瘤能力明显下降。结论野生型Ｐ５３基因在与调节ＤＮＡ复制及细胞     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ⅰ型胸苷激酶基因扩增、克隆和测序．方法：从单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ＋株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ）．将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序．结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区为１１２８ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸．ＴＫ的第２４９和２５０位氨基酸残基分别为Ｌｅｕ和Ｇｌｎ，其相应密码子为ＣＴＧ，ＧＡＧ，构成１个ＰｓｔＩ位点，第３１３和３１４氨基酸残基分别为Ａｓｐ和Ｖａｌ，其相应密码子为ＧＡＣ和ＧＴＣ，构成另一个ＰｓｔＩ位点．结论：本研究扩增出了ＨＳＶ－１ＴＫ基因的全部编码区序列     

一株抗独特型人单抗轻链可变区基因的克隆及序列测定

目的：探索抗独特型抗体模拟抗原的分子机理。方法：利用反转录－ＰＣＲ方法，从分泌肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）内影像型抗独特型人单抗的杂交瘤细胞系（Ｃ８），成功地克隆了抗ＨＦＲＳＶ Ｉｄ人单抗轻链可变区基因，并将此基因重组入Ｍ１３噬菌体ＤＮＡ中，测定了此轻链可变区基因全序列。结果：经计算机分析，基因全长共３２４ｂｐ，编码１０８个氨基酸，氨基酸序比较性分析发现所得的该单抗ＣＤＲ２区与ＨＦＲＳＶＧ２蛋