兔骨髓间充质干细胞向成骨分化对血管内皮细胞形成的可能影响

背景种子细胞的成骨功能及局部血管形成是骨组织工程修复重要影响因素.目的体外研究兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)诱导培养分化为成骨细胞的功能表现及血管内皮生长因子(vascular endothelia growthfactor,VEGF)的表达.探讨MSCs向成骨分化及对血管内皮细胞形成的可能影响.设计以细胞为研究对象,单一样本研究,重复观察测量.单位一所大学组织胚胎学教研室.材料本实验于2002-03/12在广东医学院组织胚胎学教研室完成.对象为兔骨髓间充质干细胞.方法分离、培养新生兔骨髓间充质干细胞,用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养液诱导MSCs向成骨细胞分化,观察诱导细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节形成以及VEGF的表达.主要观察指标①细胞形态学观察.②培养细胞的成骨分化鉴定.③诱导培养的成骨细胞VEGF表达.结果MSCs诱导培养后,细胞ALP呈强阳性染色,形成矿化结节,且VEGF表达增强,其灰度值为132.3±4.6,与MSCs的VEGF表达灰度值(148.5±5.3)比较,差异有显著性意义(P＜0.05).结论兔MSCs经诱导可分化为成骨细胞,且VEGF表达增强,可能参与内皮细胞的形成.     

体外分离骨髓间充质干细胞在诱导条件下的成骨能力特征

背景：利用骨髓间充质干细胞的多方向分化潜能，选择合适的生物材料和适当的生长因子联合应用，可达到修复组织缺损的目的。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞的生长特点及其在诱导条件下的成骨能力。设计：单一样本实验。 单位：右江民族医学院组织胚胎学教研室、右江民族医学院附属医院。 材料：实验于2004—06在右江民族医学院组织胚胎学教研室完成。新西兰大白兔，雄性，体质量2．0-2．5kg。 方法：抽取兔骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用诱导成骨培养液（50mL／L胎牛血清的Dulbecco改良培养基含10mmol／L β-甘油磷酸钠，10nmol／L地塞米松，50mg／L维生素C）进行培养，隔日换培养液1次。通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色等方法观测骨髓间充质干细胞的成骨特性。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的成骨特性。 结果：①骨髓间充质干细胞的形态学观察：原代兔骨髓间充质干细胞七八天即可长满，并可稳定传代，传代细胞五六天即可传代。②骨髓间充质干细胞的成骨特性：碱性磷酸酶免疫组化染色可见胞浆中出现大量棕褐色颗粒，对照染色细胞胞浆未见着色；骨连接素、骨桥素免疫组织化学检测可见胞核染成淡蓝色，胞浆内出现大量的棕黄色颗粒，呈明显强阳性，对照染色中胞浆内没有出现黄色颗粒。 结论：兔骨髓间充质干细胞用地塞米松．维生素C和β-甘油磷酸钠培养液联合诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，具有成骨活性，可在短期内为体外构建组织工程化骨提供白体种子细胞。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;诱导7d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义（P〈0.05）,第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞与血管内皮生长因子基因整合的研究

目的 大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在药物诱导下定向分化为成骨细胞,对其进行血管内皮生长因子(VEGF)基因片段转染,观察其生物学特性的变化.方法 选择MSCs体外培养的第2代细胞诱导其向成骨细胞分化,实验分为对照组和地塞米松浓度1×10-8mol/L诱导组.对诱导分化后的成骨细胞进行碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定及Ⅰ型胶原的免疫组化染色、茜素红钙节结染色的鉴定.对诱导后的成骨细胞进行已构建的VEGF基因片段(ad5-h-VEGF)的人5型腺病毒载体进行转染,并进行免疫组化鉴定.结果 诱导培养第3、6、9、12天的ALP活性(A405)测定,地塞米松浓度1×10-8mol/L组测定值(A值)分别为0.1 44±0.004、0.175±0.003、0.207±0.010、0.224±0.004;对照组分别为0.101±0.003、0.124±0.016、0.133±0.005、0.139±0.005.两组在组间、不同时点以及组间和不同时点的交互作用差异均有统计学意义(P＜0.05).MSCs经地塞米松的成骨诱导剂诱导7～9天可出现碱性磷酸酶染色阳性,连续培养20天后可出现茜素红钙节结染色阳性.转染后细胞VEGF免疫组化染色阳性.结论 对骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞作ad5-h-VEGF基因转染,可使诱导的成骨细胞胞浆中VEGF阳性表达.     

Osf2／Cbfal对间充质干细胞的促成骨效应

目的：观察重组腺病毒介导Osf2／cbfal对间充质干细胞(MSCs)的促成骨效应。方法：分离培养兔MSCs，用重组Osf2／cbfal腺病毒感染MSCs，蛋白印迹检测目的基因表达，对硝基苯磷酸二钠法和放免法分别检测成骨细胞标志基因碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素表达。结果：感染后MSCs检测到Osf2／cbfal表达，从第4天开始。ATP活性和骨钙素含量较单纯诱导组和对照组显著增高。结论：Osf2／Cbfal可明显促进MSCs向成骨细胞定向分化。     

不同传代倍数胎儿间充质干细胞的成骨分化能力观察

目的：观察不同传代倍数胎儿骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的能力，为骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用提供部分实验参数。方法：实验于2004—03／10在安阳市人民医院检验科和安阳肿瘤医院临床实验室完成。采用全髓直接接种法分离培养13～18周胎龄水囊引产新鲜胎儿股骨骨髓（获提供者知情同意标本用于此实验）。贴壁细胞达90％以上融合时消化传代。传代细胞部分以1&;#215;10^9L^-1的细胞密度接种于含体积分数为0．1的胎牛血清的L-DMEM的培养基中继续培养，传代；部分在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松，β-甘油磷酸钠及抗坏血酸向成骨细胞诱导分化。如此连续传10代。倒置显微镜下观察细胞形态、细胞化学染色检测成熟成骨细胞的标志酶碱性磷酸酶的表达、全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶活性，鉴定不同代次培养细胞成骨分化能力。结果：①碱性磷酸酶染色阳性百分率：传代7代以内胎儿骨髓间充质干细胞成骨分化能力无显著差异，均在87．5％以上（P〉0．05）；以第3代最强达93．4％。第8代后逐渐减弱，为72．7％～51．3％。②碱性磷酸酶活性：传代7代以内无差异（P〉0．05），以第3代最高，为（2307．1&;#177;15．0）nkat／L，第8代后逐渐降低，至第10代仅为（905．2&;#177;10．0）nkat／L。结论：不同代次的骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的能力不同，8代以后明显减弱。提示脱离了体内环境后，骨髓间充质干细胞逐渐老化。做为组织工程的种子绌胞，骨髓间充质干细胞体外培养不宜超过7代。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的能力

目的：研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchvmal stem celis，MSCs)体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力，为血管组织工程在体研究提供实验依据。方法：实验于2003—10／2004—10在第三军医大学基础部解剖学教研室完成。无菌条件下采集绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓，用直接贴壁法获得小鼠MSCs，然后以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth faclor，vEGF)进行诱导分化，最后对扩增的细胞特征进行八因子(Willbrand factor，vWF)免疫荧光鉴定观察。结果：MSCs每扩增一代，细胞数量增加4～8倍，7．0&;#215;10^3个原代MSCs体外扩增3代即获得1．4&;#215;10^8个细胞。在70％～80％融合时呈现“铺路石”样形态，说明绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增条件与一般小鼠相同。添加VEGF诱导2周后，以免疫荧光法检测细胞的vWF的表达发现，诱导组的vWF呈阳性表达，对照组vWF表达呈阴性。结论：绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强，在vEGF作用下可以向内皮细胞转化。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化成骨细胞的实验研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及诱导分化成骨细胞的潜能。方法采用Perco密度梯度离心和贴壁细胞法对MSCs进行分离培养,并观察其形态学特征。在诱导剂诱导作用下,通过形态学观察,采用免疫组化法检测细胞CD44,CD54表型,钙钴法检测ALP活性,Von-Kossa法矿化结节染色,RT-PCR扩增成骨细胞中CBFA I基因表达。结果采用Perco分离的MSCs,CD44,CD54表达阳性,经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,ALP合成增多,活性增加,Von-Kossa法矿化结节染色阳性,RT-PCR扩增出165bp CBFA I基因转录片段。结论体外分离纯化培养的MSCs经成骨诱导剂诱导后能向成骨细胞方向分化增殖。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达☆

背景:有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道. 目的:观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达. 方法:取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1 d后将细胞分为两组:对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原.RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达. 结果与结论:兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异(P<0.05);诱导7 d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21 d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义(P<0.05),第7天,两者表达最强.说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞.其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用.     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用，能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨，并最终导致新骨生成；碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质于细胞的软骨与骨的分化。目的：观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响，以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计：随机对照实验。单位：解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料：培养的兔骨髓间充质干细胞。方法：实验于2004-06／12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子（100μg／L人重组骨形态发生蛋白2，100μg／L碱性成纤维生长因子，100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子）和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法，碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节Von Kossa染色观察。主要观察指标：通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果：①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化，特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖，与对照组相比，细胞增值率提高近100％；虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响，但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论：碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子，两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成，可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体（Ad-BMP-2/GFP）转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化的能力

背景：利用骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的多向分化性，选择合适的生物材料和适当的生长因子联合应用，可达到修复组织缺损的目的，MSCs细胞具有取材方便，对身体健康损害小，来源于自体干细胞诱导构建的组织不存在MHC限制等优点，所以日益受到人们的重视。目的：探讨人骨髓间充质干细胞向成骨和成软骨细胞诱导分化的能力。设计：单一样本研究。单位：苏州大学附属儿童医院骨科，苏州大学生命科学院生物技术研究所。材料：RPMI1640完全培养基，地塞米松，β-甘油磷酸钠，抗坏血酸，鼠抗人一抗，羊抗鼠二抗，链球菌亲和素(三抗)，DAB(1：50)，100mL／L胎牛血清，维生素C，转化生长因子-β1(TGF-B1)等。方法：选用不同代次的MSCs细胞，分别使用成骨和成软骨条件培养基培养，观察细胞的形态学变化，同时采用细胞化学和免疫组化的方法检测碱性磷酸酶，钙盐沉积，糖胺多糖分泌和I，Ⅱ胶原的表达。主要观察指标：骨髓基质干细胞向成骨细胞分化；骨髓基质干细胞向成软骨细胞分化。结果：MSCs细胞在地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的作用下，15d后可见细胞变为多边形，ALP和Ⅰ型胶原染色阳性，形成钙结节，表现成骨细胞分化特点；而在维生素C和TGF-β1的作用下，7d可见细胞多为圆形，糖胺多糖和Ⅱ型胶原染色阳性，表现成软骨细胞分化特点。但细胞分化特征的表达随细胞增殖有减弱趋势。结论：在一定培养条件下成功诱导人MSCs细胞向成骨和成软骨细胞分化，为进一步研究打下基础。     

骨髓间充质干细胞定向诱导条件下向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的关系

目的：观察骨髓间充质干细胞在定向诱导分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化的特征及相互关系。方法：实验于2004-10／2005-04在泸州医学院心肌电细胞实验室完成。日本大耳兔10只，经兔髂嵴无菌抽取骨髓，采用Percoll液进行梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对兔骨髓间充质干细胞进行分离、纯化，将获得的原代和传代培养的骨髓间充质干细胞，分别用含成脂诱导剂和含成骨诱导剂的改良的伊格尔培养基进行实验组（向脂肪细胞和成骨细胞的定向诱导培养，对诱导培养后的细胞进行生长形态学特征观察），对照组（采用不加成脂、成骨诱导剂的伊格尔培养基），两组进行成脂及成骨诱导后的苏丹脂肪染色、碱性磷酸酶活性检测、胞外矿化基质测定，并进行细胞成脂和成骨率比较。结果：从10只实验动物中均成功提取到骨髓间充质干细胞，其中有2只动物的骨髓间充质干细胞在原代培养时出现污染，8只获得成功进入结果分析。①在经过2ld成脂诱导培养后实验组的许多细胞胞浆内均出现较多的高折光性的脂滴，苏丹脂肪染色呈橘红色，同时Kossa法也检测出少许成骨分化，其比例为70％（28／40）干细胞可转化为含有脂滴的脂肪细胞；10％（4／40）干细胞转化为含有钙结节的成骨细胞。②经过21d向成骨诱导培养后实验组出现一些细胞基质逐渐堆积、并出现基质矿盐沉积，Von Kossa法测定形成的钙结节，同时苏丹脂肪染色也检测出少许向脂肪细胞分化，其比例为40％（16／40）干细胞可转化为成骨细胞，20％（8／40）骨髓间充质干细胞可转化为脂肪细胞。③对照组用苏丹脂肪染色后显示5％（2／40）骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞，用Von Kossa法测定矿化结节形成比例和碱性磷酸酶活性测定结果成骨率10％（4／40）。结论：在适当诱导条件下骨髓间充质干细胞可一部分转化为脂肪细胞，另一部分转化为成骨细胞，两者分化存在一定关系：分化的脂肪细胞多，则成骨细胞少；分化的成骨细胞多，则脂肪细胞少。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景：自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞，如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-Ⅰ是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。 目的：观察胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 设计：开放性实验。 单位：中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。 材料：实验于2003-03／11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。 方法：采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞，体外扩增，用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44，CD71，CD34, CD45表达；在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg／L胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液，采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。 主要观察指标：通过检测细胞CD34，CD44，CD45的表达，进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。 结果：①倒置显微镜观察结果：体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定：流式细胞仪结果显示细胞均一性较好，第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45，说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点：③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化：加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-Ⅰ共培养，在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆，15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形．突起短，呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72．5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内，呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液共培养组培养15d后，细胞内蛋白多糖含量为[8．92&;#177;0．91）μg／L，高于单纯骨髓间充质干细胞培养组Ⅰ（2．56&;#177;0．26）μg／L，P〈0．05]，但低于软骨细胞组[（13．69&;#177;1．51）μg／L，P〈0．05]。 结论：胰岛素样生长因子-Ⅰ和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨特征

背景：骨碎补能在促进骨生长且取得了良好的临床疗效,其主要成分柚皮甙能否诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化？目的：用柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。并观察柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。方法：用贴壁筛选法对兔骨髓间充质干细胞进行分离培养。对生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分别用50μg／L的柚皮甙和经典成骨诱导剂向成骨方向进行诱导,分别进行成骨鉴定。结果与结论：经典成骨诱导液、柚皮甙诱导液都能使骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,基质分泌增多,形成钙结节。用酶联免疫检测仪检测柚皮甙诱导组和经典成骨诱导组细胞吸光度值未见明显的差异。同时检测柚皮甙诱导液和L—DMEN细胞培养液的吸光度值发现两者差异无显著性意义（P〉0．05）。证实柚皮甙可成功诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,无明显毒性作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多表明细胞功能活跃。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

人骨髓间充质干细胞的优化培养

目的：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)培养大多集中在动物，探讨人MSCs的优化培养方法，为组织工程临床应用奠定基础。方法：手术切取患者骨松质3mm&;#215;3mm&;#215;3mm，在含血清培养基内用剪刀将其剪为1mm&;#215;1mm&;#215;1mm大小，然后用注射器冲洗；抽取患者骨髓5mL。分别用贴壁法和密度梯度离心法原代培养。比较不同培养方法MSCs的生长情况。对各组传代细胞用化学药物进行成骨诱导培养，并检测成骨细胞表型。结果：手术切取患者骨松质和抽取患者骨髓均能培养出骨髓间充质干细胞，切取骨松质获取的细胞数量大，5mL骨髓培养细胞数平均可达2．43&;#215;10^8，3mm&;#215;3mm&;#215;3mm骨松质可以获取MSCs的平均细胞数可达9．57&;#215;10^8；全骨髓法细胞贴壁时间早两三天，密度梯度离心法细胞均一性好，利于纯化。结论：临床组织工程中可以根据情况和需要采用不同方法获取MSCs。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,且可大量体外扩增培养,是重要的组织工程种子细胞。但尚无统一的体外培养及定向诱导方法。目的：探讨体外定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的可行性。方法：应用密度梯度离心法从兔四肢骨中分离纯化间充质干细胞,应用密度为1．073g／mL的Percoll分离液,3000r／minx30min离心,区别于相关报道的Ficoll分离液,2000—2500r／min×（20—30）min离心以及全骨髓培养法体外扩增至第3代,分别在普通培养基（对照组）和成骨诱导培养基（实验组）中培养。结果与结论：成功获得大量高纯度骨髓间充质干细胞。经成骨诱导后,实验组骨钙素含量明显高于对照组（P〈0．05）。实验组碱性磷酸酶和钙结节染色阳性,对照组均阴性。结果表明使用密度梯度离心法可成功建立兔骨髓间充质干细胞的分离培养体系,骨髓间充质干细胞可定向诱导为成骨细胞。     

BMP-2,BGP mRNA表达量及ALP活性的变化对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨细胞的影响

目的建立骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养体系，探讨BMSCs诱导条件下骨向分化能力和骨形成蛋白-2（BMP-2）、骨钙素（BGP）mRNA表达量及ALP活性的变化对成骨细胞增殖分化的影响。方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离大鼠BMSCs，观察细胞形态学特征；应用成骨诱导体系诱导BMSCs向成骨细胞进行分化；通过细胞形态学观察、组织化学染色鉴定，酶联免疫分析仪和RT—PCR分别定量检测7d和14dALP活性及BMP-2，BGP mRNA表达。结果用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得高纯度的BMSCs；经骨向诱导7d和14d后，ALP和矿化结节染色阳性；骨向诱导组：14dALP活性82&#177;1．0U／L，mRNA表达BMP-2为6．04&#177;0．02，BGP为3．21&#177;0．02，分别较7d（33&#177;2．0U／L，1．40&#177;0．01，1．1&#177;0．01）显著增高（P〈0．01）。未诱导组：ALP活性低（12&#177;1．0U／L），BMP-2，BGP mRNA未表达，无矿化结节形成。结果显示：随培养时间延长，BMP-2增高的同时ALP活性及BGP表达量也明显增高，细胞形态发生改变并向成骨方向分化，表明与形成成骨细胞有关。结论将BMSCs成功诱导分化为成骨细胞，并建立了体外分离培养体系。提示BMP-2，BGP mRNA表达量的增加及ALP活性增高，与细胞骨向分化具有较高的相关性。