硫代反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）C基因翻译起始区和C基因区硫代反义寡聚脱氧核苷酸（ASON）对HBV表达的序列性抑制作用。方法 以2．2．15细胞系作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区（C区）15聚硫代ASON,通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2．2．15细胞中,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)含量。结果 与HBV mRNA C基因起始区互补的硫代ASON序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡聚脱氧核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性。另外,硫代ASON对细胞生长无毒性作用。结论 硫代ASON能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达。     

反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因表达的影响

将乙肝病毒（ＨＢＶ）的反义或正义寡核苷酸，加入能复制ＨＢＶ的肝癌细胞模型ＨｅｐＧ２．２．１５中，通过检测其上清中ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的含量，初步分析了反义寡核苷酸潜在的抗ＨＢＶ能力。针对Ｃ基因区１９７４─１９５５的反义链（ＣＳＰ）在１５μｍｏｌ／Ｌ浓度下可抑制８４．８％的ＨＢｓＡｇ表达和４０．０％的ＨＢｅＡｇ表达，停药２日时抑制率仍分别为９３．５％和３９．０％。实验期间未发现反义链对上述细胞形态或细胞生长状况有明显影响。结果提示反义寡核苷酸ＣＳＰ在实验条件下具有一定的抑制细胞ＨＢＶ表达的能力。     

反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)C基因翻译起始区和C基因区反义寡聚脱氧核苷酸对HBV表达的序列性抑制作用.方法以乙型肝炎病毒基因组(HBV DNA)转染人肝癌细胞系HepG2而建立起来的转染细胞系2.2.15作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区(C区)15聚反义硫代寡聚核苷酸(ASON),通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2.2.15细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞中的HBV DNA经PCR扩增后,用Southern blotting方法对PCR产物进行半定量分析.结果与HBV mRNA C基因起始区互补的反义硫代寡核苷酸序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性.ASON作用24 h后的细胞培养上清液及细胞内HBV DNA量比对照组明显减少.另外,ASON对细胞生长无毒性作用.结论反义硫代寡核苷酸能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达.     

阳离子脂质体对反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒作用的促进

目的 :考察阳离子脂质材料 3β [N (N′,N′ 二甲基胺乙基 )胺基甲酰基 ]胆固醇 (3β [N (N′,N′ dimethylaminoethane) carbamoyl]cholesterol,DC chol)与反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,asODN)的结合能力及asODN阳离子脂质体的细胞毒性和抗病毒活性。方法 :以DC chol从水相中萃取asODN的萃取率评价不同条件下DC chol与asODN的作用力 ;通过四唑盐比色法检测含DC chol的阳离子脂质体对HepG2 2 .2 .1 5的细胞毒性 ;以酶联免疫法 (ELISA)检测细胞上清培养液中HBsAg和HBeAg的含量 ,考察不同asODN阳离子脂质体的抗病毒活性。结果 :当正负电荷比 >0 .6时 ,DC Chol能有效的从水相中萃取asODN (萃取率 80 %～ 1 0 0 % ) ;碱性条件和强离子 (Na+ /Cl-)的存在不利于DC Chol与asODN的作用 ;DC chol阳离子脂质体具有一定的细胞毒性 ,在低质量浓度时 (0 .84～ 2 6 .94mg·L-1 )脂质体的细胞毒性与DC chol浓度成正比 ;当asODN在 1 .2 5～ 5 .0 0 μmol·L-1时 ,其抗病毒活性与剂量相关 ;脂质体可提高asODN对乙肝病毒的抗病毒活性 ,其中阳离子脂质体对asODN抗病毒活性的促进作用较明显 (从 6 0 %到 95 % )。结论 :表面修饰DC Chol阳离子脂质体能有效地促进asODN的抗乙肝病毒活性。     

反义寡核苷酸对肝癌细胞生长抑制作用的研究

目的：探讨互补于HBV X基因的翻译起始区（as-Xp)、ENⅡ（as-ENⅡ）区的反义寡核苷酸抑制HepG2.2.15细胞生长及抗病毒作用。方法：合成as-Xp、as-ENⅡ，体外作用于HBV DNA转染的HepG2.2.15利用，利用ELISA法检测反义核酸作用前后细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量，以HepG2.2.15细胞接种裸鼠制备人肝癌模型，瘤内给予反义寡核苷酸100μg，连续给药5d，取瘤组织采用流式细胞仪（FCM）分析反义核酸诱导瘤细胞凋亡作用，并检测反义核酸作用裸鼠血清中病毒抗原表达情况。结果：as-Xp、as-ENⅡ作用72h的细胞凋亡峰值分别为24％和27．7％，对照为10．89％、7．92％；对荷瘤鼠体内HBsAg和HBeAg的抑制率分别为35％、34％和43％、49％，在体外分别为57％、52％和56％、56％。无关对照序列体内，外无明显的抑制瘤细胞生长和抗病毒作用。结论：as-Xp、as-ENⅡ体内应用可诱导瘤细胞凋亡，并可有效抑制体内，外HBV抗原表达。     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

反义寡核苷酸靶向肝细胞体外抗乙型肝炎病毒的实验研究

作者在对２．２．１５细胞中乙型肝炎病毒基因测序的基础上，设计合成了１段针对Ｕ５样序列区的１６－聚硫代磷酸反义寡核苷酸，并将其与直导向性载体－半乳糖化白蛋白和半乳糖化多聚赖氨酸连接，在２．２．１５细胞中观察了它们的抗病毒作用。     

反义硫代寡核苷酸抗乙肝病毒作用机理的探讨

为了探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＮ）进行抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因治疗的可行性及ＡＳＯＮ抗ＨＢＶ作用机理,设计合成了针对ＨＢＶ不同基因位点的ＡＳＯＮ〔ＰｒｅＳ２翻译起始位点、ＨＢＶ调节成份顺向重复序列（ＤＲ２）和增强子Ⅱ〕。以ＨｅｐＧ２·２·１５细胞为细胞模型,动态观察了这三种ＡＳＯＮ不同浓度不同时间的抗ＨＢＶ作用。结果表明：这三种ＡＳＯＮ对ＨＢｅＡｇ的抑制率分别为９１．１％、４４９％和５６４％,对ＨＢｓＡｇ的抑制率分别为６５７％、６０１％和５１５％,无关序列无明显抑制作用。应用反义寡核苷酸技术,为研制新一代抗ＨＢＶ基因治疗药物奠定了基础,探讨了特异性阻断ＨＢＶ基因表达的可能途径。ＡＳＯＮ抑制作用机理可能是ＡＳＯＮ作用于病毒逆转录和翻译水平甚至复制水平上     

反义寡核苷酸抑制端粒酶活性对鼻咽癌细胞癌基因表达的影响

目的：检测针对端粒酶的反义寡核苷酸（AS-ODN）对鼻咽癌HNE-1细胞株bcl-2及c-myc基因表达的影响。方法：用PCR-ELISA法检测细胞内端粒酶活性。用免疫细胞化学法检测bcl-2和c-myc基因的表达。结果：鼻咽癌细胞株HNE-1与20μmol/L反义寡核苷酸共同孵育1天，对其端粒酶活性抑制率为61.6%。而同浓度正义寡核苷酸（S-ODN）对细胞端粒酶活性无抑制作用。20μmol/L反义寡核酸作用2天后鼻咽癌细胞c-myc基因表达HSCORE评分由3.65下降为1.98，而bcl-2基因表达HSCORE评分无明显变化。结论：该反义寡核苷酸可抑制鼻咽癌细胞端粒酶活性。此作用有序列特异性。该反义寡核苷酸抑制了鼻咽癌细胞c-myc基因的表达，而对bcl-2基因表达无明显影响。     

抗乙酰胆碱酯酶基因表达的反义寡核苷酸的研究进展

反义核酸技术是近年来迅速发展的选择性抑制特定基因表达的一种生物技术,乙酰胆碱酯酶抑制剂可用于治疗早老性痴呆和重症肌无力等疾病,本文综述了利用反义寡核苷酸抑制乙酰胆碱酯酶的表达研制新型胆碱酯酶抑制剂的研究进展.     

反义寡核苷酸体外抑制丙型肝炎病毒的研究

研究反义寡核苷酸体外抑制丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的方法。方法以重组丙型肝炎病毒（ｐＣＤ－ＨＣＶ）转染的Ｈ９细胞为对象，通过半定量逆转录聚合酶链反应和ｄｏｔＥＬＩＳＡ检测ＨＣＶｍＲＮＡ和抗原表达的变化，观察与ＨＣＶ结构区（包括ＡＵＧ）互补和同源以及随机的硫代磷酸化寡核苷酸（ＰＳ－ＡＳＯＮ、ＰＳ－ＯＤＮ、ｒＰＳ－ＯＤＮ）对ＨＣＶ的抑制作用。结果ＰＳ－ＡＳＯＮ和ＰＳ－ＯＤＮ可有效地进入靶细胞并在体外与靶基因杂交结合，终浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ的ＰＳ－ＯＤＮ、ｒＰＳ－ＯＤＮ对ＨＣＶ均无抑制作用，但ＰＳ－ＡＳＯＮ可明显降低ＨＣＶｍＲＮＡ和抗原表达水平，具有药物浓度和时间依赖效应，脂质体修饰可增强ＰＳ－ＡＳＯＮ的反义抑制作用，磷酸钙修饰却无此作用。结论与ＨＣＶ互补的ＰＳ－ＡＳＯＮ是ＨＣＶ的反义寡核苷酸，在翻译水平上具有反义抑制作用。     

反义硫代寡核苷酸对786-O细胞survivin基因的表达及生长抑制作用

目的研究survivin反义寡核苷酸对肾透明细胞癌786O细胞表达survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向survivin的反义寡核苷酸(ASODN)。肾透明细胞癌细胞株786O分为6组:空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、200、400和600nmol/LASODN转染组。作用24h后收获各组细胞。倒置显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况和流式细胞术检测各组细胞周期变化和凋亡指数,MTT法检测survivin反义寡核苷酸对各组细胞的生长抑制率。结果电镜下可以见到典型凋亡样改变,而各对照组细胞生长良好;各ASODN转染组细胞survivin表达有不同程度减弱;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P<0.05),以600nmol/LASODN转染组最为明显(P<0.05),而各对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论不同浓度survivinASODN转染后能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786O细胞凋亡,抑制786O细胞增殖。     

硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒细胞的影响

目的探讨硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸对乙型肝炎病毒细胞的影响。方法设计合成HBV5个硫代反义寡聚核苷酸(S-as ODN)靶序列。应用ELISA方法、MTT比色法、观察S-as ODN对HBsAg、HBeAg抗原表达及Hep G22215细胞毒性的影响。结果不同靶位点的S-as ODN对HBsAg、HBeAg表达都有显著的抑制作用,在浓度为20μmol／L时,对细胞无明显杀伤作用。结论S-as ODN对Hep G22215的HBsAg、HBeAg的抑制作用为抗HBV治疗提供了新的途径。     

HBVPreS2反义寡核苷酸对HepG 2.2.15细胞系HLA-I类抗原表达及生物活性的影响

目的 :观察针对乙型肝炎病毒 (HBV)PreS2 基因特异性反义寡核苷酸 (asON)对转基因细胞HepG2 .2 .15表面的人类白细胞I类抗原 (HLA I)基因表达的影响。方法 :设计合成互补于HBVPreS2 翻译起始区的反义寡核苷酸即序列I ,并设非互补序列作对照即序列II ,免疫细胞化学染色观察asON对HepG2 .2 .15表面表达的HLA I类抗原的影响 ,用ELISA法动态检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化 ,放射免疫测定法检测asON对宿主细胞自身分泌蛋白 血清铁蛋白的影响。结果 :HepG2 .2 .15细胞表面HLA I类抗原表达降低 ,用药组和对照组相比有统计学意义 (P <0 .0 5 )。asON能够抑制HBV表达HBsAg和HBeAg ,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为 6 6 %和 91% ,而序列II对HBsAg和HBeAg的抑制率均为 11%。asON对宿主细胞自身分泌蛋白无影响 ,即对宿主细胞无毒性作用。结论 :asON以序列特异性方式抑制HBV基因表达而对宿主细胞无毒性作用 ,HLA I类抗原表达降低 ,这对减轻过度炎症反应 ,阻止慢性肝炎至重症肝炎的发生具有重要意义     

preS2反义寡核苷酸降低肝癌细胞HepG2.2.15的致瘤性

目的 :观察反义寡核苷酸 (as preS2 )对HepG2 .2 .15细胞致瘤的抑制作用。方法 :合成针对preS2翻译起始区反义寡核苷酸 ,以 10 μmol L的终浓度作用于HepG2 .2 .15细胞 ,用FACSCAN流式细胞仪检测细胞凋亡率 ,TRAP银染测定细胞端粒酶活性 ,用ABC免疫化学染色P2 1ras、P6 2 c myc蛋白 ;同时收集上清以RIA法检测血清铁蛋白浓度 ,ELISA法测定HBsAg、HBeAg浓度。体内抑瘤实验以HepG2 .2 .15细胞荷瘤裸鼠进行。结果 :as preS2可显著抑制HBsAg、HBeAg表达 ,抑制率分别为 6 6 %和 91%。as preS2作用 3d后抑制P2 1ras、P6 2 c myc蛋白表达 ,并降低肝癌细胞端粒酶活性 ,同时明显诱导细胞凋亡 (6 .13%vs 1.16 % ,P <0 .0 5 )。as preS2不影响宿主细胞自身血清铁蛋白的分泌。体外在荷HepG2 .2 .15细胞裸鼠中注射as preS2可抑制成瘤率。结论 :as preS2在体内外均能有效抑制HepG2 .2 .15细胞增殖 ,as preS2不仅抑制HBV抗原表达 ,而且明显降低肝癌细胞端粒酶活性 ,诱导肝癌细胞凋亡。     

ODC反义寡核苷酸对HL60细胞的生长抑制作用

目的：确定鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞的抗增殖作用；探索该核苷酸是否有可能作为一种治疗癌症的潜化制剂。方法：采用自行设计人工合成的ＯＤＣ反义寡核苷酸，用ＭＴＴ法观察了其对ＨＬ６０细胞生长的影响，并以３Ｈ参入试验检测其ＲＮＡ及蛋白生物合成。结果：ＯＤＣ反义寡核苷酸可抑制ＨＬ６０细胞的增殖及ＲＮＡ、蛋白质的生物合成，并增强该细胞对抗肿瘤药物阿糖胞苷的敏感性。结论：应用反义技术控制ＯＤＣ表达将是抑制恶性细胞生长及增强肿瘤对化疗敏感性的１种可能途径。