大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

[目的]建立分离纯化、培养、扩增骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)鉴定的方法.[方法]采用密度梯度离心及贴壁培养相结合的方法分离、培养、扩增MSCs,并用流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD44、CD105. [结果]培养48 h后即可见呈集落生长的细胞,72 h后可见少量贴壁MSCs细胞,7 d后贴壁细胞明显增多,梭形栅栏样分布,融合度达70%以上.第3代原代培养细胞表面标志CD44+、CD105+在95%左右,CD34的表达率甚低.[结论]联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法,可以获得纯度较高的骨髓MSCs     

C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养、分化及两种不同品牌血清对其增殖的影响

目的 研究C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)体外分离培养、分化及比较含两种不同品牌血清培养基对其生长的影响,探索体外培养C57BL/6小鼠BMSCs更优方法。方法 差速贴壁法体外分离提取BMSCs,分别用含10%Yeasen胎牛血清和10%Gbico胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养,分别在2 d、4 d、6 d(后)通过倒置显微镜观察两组BMSCs的细胞形态;CCK-8法检测其生长趋势;免疫荧光染色鉴定表型;不同诱导培养基诱导其成骨、成脂分化。结果 成功分离BMSCs,原代培养细胞呈长角形涡状排列生长,第二代BMSCs免疫表型鉴定结果显示CD44、CD90、CD106为阳性表达,CD34为阴性表达;成骨、成脂诱导分化后,细胞茜素红、油红染色均呈阳性;CCK-8检测显示含Gbico血清培养基所培养的BMSCs更容易形成细胞集落且数量更多,生长上升趋势更为明显。结论 两种血清都能促进BMSCs的体外增殖,Yeasen血清有着更高的性价比,Gbico血清则在促进增殖方面表现更加良好。     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的优化

目的探索脐血来源的间充质干细胞体外分离培养的更优方法。方法无菌条件下抽取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。50份脐血分为对照组和改良组,每组25份,分别以1.5×10^7/ml的细胞密度接种于25 cm^2培养瓶中。对照组贴壁3 d后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液;改良组贴壁0.5 h后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液。结果对照组杂细胞较多,最终成功培养出8份脐血间充质干细胞;改良组杂细胞较少,最终成功培养出18份脐血间充质干细胞。经流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,所培养出的脐血间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论采取脐血单个核细胞贴壁0.5 h弃上清更换新鲜培养液可以明显提高脐血间充质干细胞的培养成功率,其结果优于脐血单个核细胞贴壁3 d弃上清更换新鲜培养液。     

交联与非交联猪源生物补片对绵羊肌源性干细胞生长影响的研究

目的探讨交联与非交联猪源生物补片(P型和S型)对绵羊肌源性干细胞(muscle derived stem cell,MDSC)生长的影响。方法利用二次沉淀法在体外将绵羊MDSC种植于各型猪源生物补片表面,并利用CCK-8法检测绵羊MDSC在异种生物补片表面生长情况。结果 CCK-8法检测表明绵羊MDSC在猪源生物补片表面生长良好,且在非交联猪源生物补片表面生长状况优于交联生物补片。结论二次沉淀法可有效的将绵羊MDSC接种于猪源生物补片(P型和S型)上,且非交联猪源生物补片更适于MDSC生长。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养与生物学特性的实验研究

目的建立可行的人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells,h MSCs)的培养方法,并对其生物学特性进行初步研究。方法于2013年1月—2014年6月采用密度梯度离心法和贴壁法分离培养h MSCs,用免疫组织化学(免疫组化)法鉴定表面标志并分析其核型,光镜观察其生长和形态变化。结果本实验分离的h MSCs纯度高、贴壁好,以长梭形为主,至少在传代培养6代内增殖快,性状稳定。免疫组化染色显示h MSCs表达CD29和CD44,不表达CD45及CD34,核型正常。结论密度梯度离心法可获得增殖活跃且纯度较高的h MSCs,有特征性表型,适合体外较长期的培养h MSCs。     

胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定

目的 探讨胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定的方法,为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础. 方法 Sprague-Dawley大鼠孕18 d时剖宫取出胎鼠,手术显微镜下取胎鼠四肢骨骼肌肌肉,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离胎鼠骨骼肌卫星细胞,差速贴壁法进行纯化.原代培养的生长培养基为(DMEM/F12+ 20％ FBS+ 10％ HS+5 ng/ml bFGF).分化培养基为(DMEM/F12+ 2％ HS).CCK-8法绘制胎鼠骨骼肌卫星细胞生长曲线图,细胞免疫组化染色鉴定纯化后细胞的肌源性标志蛋白Desmin,观察分化培养基条件下骨骼肌卫星细胞的成肌分化特性. 结果 胎鼠原代骨骼肌卫星细胞在培养的第3天进入对数生长期,5～6d达增殖平台期;纯化后的细胞90％以上表达结蛋白(Desmin).在分化培养基的诱导下细胞之间相互融合形成具有自发节律性收缩特性的多核肌管. 结论 采用消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞,能够获得高活性和高纯度的具有成肌分化能力的骨骼肌卫星细胞.     

人肺腺癌肿瘤细胞免疫表型CD133、CD34、CD44的实验研究

目的 拟验证CD133、CD34、CD44作为人肺腺癌肿瘤干细胞表面标记物的合理性.方法 采集新鲜肺腺癌组织标本,利用两种体外培养方法扩增出贴壁细胞和悬浮细胞球两种肿瘤细胞,采用免疫荧光检测比较CD133、CD34和CD44在两种培养细胞中表达的差异.结果 悬浮球肿瘤细胞培养较贴壁肿瘤细胞生长速度慢、维持时间长且成功率高(72.5% vs 47.5%,P＜0.05).CD133、CD34和CD44在悬浮细胞球中表达率和表达量明显高于贴壁肿瘤细胞(68.97%,82.76%,93.10% vs 5.26%,15.79%,5.26%,P＜0.01).结论 CD133、CD34和CD44可能作为分离人肺腺癌肿瘤干细胞的表面蛋白表标记组合.

Abstract：

Objective To validate the possibility of CD133 CD34 CD44 be served as biomarkers in cancer stem cell of human lung adenocarcinoma. Methods Two kinds of culturing methods were performed to generate adhesive tumor cells and floating aggregates, and the differences of expression of CD133 CD34 CD44 between 2 kinds of cultured cells were observed by immunofluorescence. Results Floating aggregates grew more slowly, kept activity for longer period than adhesive cells (72.5% vs 47.5%,P＜0.05). Floating aggregates expressed higher level of CD133, CD34 and CD44 than adhesive cells (68.97%,82.76%,93.10% vs 5.26%,15.79%,5.26%,P＜0.01). Conclusions The combination of CD133, CD34 and CD44 probably can be used as surface markers of cancer stem cells for human lung adenocarcinoma.     

新生大鼠心肌细胞原代培养

目的探讨酶法分离新生大鼠心肌细胞过程中的各种影响因素,对Simpson经典方法进行改进,提高原代心肌细胞存活率及搏动率。方法采用低浓度的胰酶消化3～4次后,再用低浓度的Ⅱ型胶原酶消化一次,用短时间的2次差速贴壁法分离培养心肌细胞。结果在分离培养新生鼠心肌细胞过程中,胰酶和胶原酶合用,并改变差速贴壁时间,得到高存活率和高纯度的心肌细胞,细胞搏动率高,持续时间久。结论分离培养大鼠心肌细胞时,低浓度的胰酶和胶原酶合用,并用2次差速贴壁,可提高原代心肌培养的存活率和纯度,使细胞搏动良好。     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

大鼠脂肪源性干细胞分离培养的实验研究

目的研究分离、培养、鉴定大鼠脂肪源性干细胞的实验方法。方法提取大鼠双侧腹股沟处脂肪组织,进行原代培养及流式细胞检测仪的鉴定。用MTT法检测不同原代细胞接种密度的细胞分裂增殖率的变化,并观察第1^第13代细胞分裂增殖的特点。结果大鼠脂肪源性干细胞的生长呈大量细胞集落,表面标记物CD44、CD105、CD49d表达阳性,CD106表达阴性。不同的原代细胞接种密度会影响细胞分裂增殖,以1×106/ml细胞密度接种时细胞的增殖速率高于其它对照组。该细胞株经多次传代后仍能保持较强的分裂增殖能力。结论大鼠脂肪源性干细胞分离培养方法简便,不同的原代细胞接种密度会影响细胞分裂增殖,细胞经多次传代后仍能保持较强的分裂增殖能力。