深圳地区小儿肠道病毒感染的核酸检测分析

为了解深圳地区肠道病毒 (ＥＶ)的感染流行情况和病毒分型特征 ,我们采用检测ＥＶ的套式逆转录聚合酶链反应(ＲＴ ｎＰＣＲ)方法进行ＥＶ感染检测 ,并对临床分离株 5′端非编码区 ( 5′ＵＴＲ)基因序列进行分子进化树分析。采用ＴＲＩＺＯＬ ＬＳＲｅａｇｅｎｔ试剂从疑诊ＥＶ感染儿童大便、咽拭子和脑脊液中提取ＥＶ ＲＮＡ ,根椐ＥＶ 5′ＵＴＲ保守的基因序列设计两对特异性引物 ,引物序列分别为ＥＶＰ1 60 :5′ＣＡＡＧＣＡＣＴ(ＴＡ)ＴＴ(ＣＡ)ＣＣＣＣＧＧ3′,ＥＶＰ2 50 :5′ＴＡＣＴＴＧＡ(ＧＡ)ＣＣ ＴＡＧＴＡ3′,ＥＶＰ50 0 :5′…     

TT病毒的基因变异分析与基因分型

我们对 80例非甲～非庚型肝炎患者、血清ＡＬＴ升高以及长期维持性血透患者 (部分患者有输血史 )进行检测 ,对二十余例ＴＴＶ分离株进行测序研究 ,结果如下 :提取患者血清ＤＮＡ ,巢式ＰＣＲ扩增ＴＴＶ。参照Ｏｋａｍｏｔｏ等报道的Ｎ2 2分离株ＴＴＶ基因序列设计套式引物 :Ｔ15′ -ＡＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣ - 3′(1892～ 1913) ,Ｔ2 5′-ＧＧＡＴＡＣＣＴＡＴＴＡＧＣＴＣＴＣＡＴ - 3′(2 187- 2 2 0 7) ,Ｔ3 5′ -ＧＧＣＡＡＣＡＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＧＡＣ - 3′(1914- 1935 ) ,Ｔ45′ -ＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＡ…     

汉坦病毒A9株M基因片段全长cDNA克隆及其在痘苗病…

采取反转录－聚合酶链反应，分３个片段扩增Ⅰ型汉坦病毒（野鼠型）中国毒株Ａ９株Ｍ基因片段，分别克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ载体中。选择个正向插入的ＴＡ９ＩＢ、ＴＡ９ＣＤ、ＴＡ９ＥＡ克隆，选用Ｃｌａ Ⅰ、ＥｃｏＲ Ｖ进行酶切、连接，获得了１个在ＰＧＥＭ－Ｔ载体中插入３．６ｋｂ的Ａ９株Ｍ基因片段ｃＤＮＡ克隆，酶切图谱分析证实插入片段正确。将Ａ９Ｍ片段在痘苗病毒／Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶瞬时表达系统中进行表达，用抗汉     

汉坦病毒A9株M基因片段全长cDNA克隆及其在痘苗病毒中的瞬时表达

采取反转录一聚合酶链反应（ＰＣＲ），分３个片段扩增Ｉ型汉坦病毒（野鼠型）中国毒株Ａ９株Ｍ基因片段，分别克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ载体中。选择３个正向插入的ＴＡ９ＩＢ、ＴＡｇＣＤ、ＴＡｇＥＡ克隆，选用ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ进行酶切、连接，获得了１个在ＰＧＥＭ－Ｔ载体中插入３．６ｋｂ的Ａｇ株Ｍ基因片段ｃＤＮＡ克隆，酶切图谱分析证实播入片段正确。将Ａ９Ｍ片段在痘苗病毒／Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶瞬时（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）表达系统中进行表达，用抗汉坦病毒糖蛋白单克隆抗体进行免疫荧光检测，观察到很强的特异性荧光，证明ＡｇＭ基因ｃＤＮＡ能进行表达。     

中国甲型肝炎病毒毒龙甲株全基因序列的cDNA克隆及序列分析

甲型肝炎是我国主要传染病之一 ,经粪 -口途径传播。甲型肝炎病毒(ＨＡＶ)在组织培养中生长缓慢 ,滴度低 ,限制了甲型肝炎疫苗及诊断试剂的生产。因此有必要克隆我国自己的ＨＡＶ基因 ,为体外表达ＨＡＶ抗原打下基础。ＨＡＶ属小ＲＮＡ病毒科肝病毒属 ,为无包膜的单链ＲＮＡ病毒 ,含有长约 7 5ｋｂ的正链ＲＮＡ ,5′端有长的非编码区 ,3′端有ｐｏｌｙＡ的尾巴。基因组含有一个长的开放读码框架 ,编码 2 2 2 7个氨基酸的大蛋白。基因排列顺序为 :5′ -ＮＣＲ -ＶＰ4-ＶＰ2 -ＶＰ3-ＶＰ1- 2Ａ - 2Ｂ - 2Ｃ - 3Ａ - 3Ｂ- 3Ｃ - 3Ｄ - 3′ＮＣ…     

HBsAg中蛋白与IL-18联合核酸免疫HBsAg转基因小鼠的实验研究

对乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)转基因小鼠鼠系所进行的ＨＢＶ核酸疫苗免疫转基因小鼠的实验研究〔1,2〕 提示核酸疫苗有治疗潜力。本研究的目的是研究在白细胞介素 18(ＩＬ 18)的辅助作用下 ,ＨＢＶ表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫ＨＢｓＡｇ转基因小鼠的效果。材料与方法质粒构建 :引物设计 :上游引物 :5′ ＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣ 3′ ;下游引物 :5′ ＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧ 3′。ＰＣＲ法扩增ＨＢｓＡｇ中蛋白基因序列 ,将ＰＣＲ产物亚克隆至ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体 (Ｐｒ…     

一种N端缺失的rhGM—CSF（7～127）在大肠杆菌中的表…

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端块缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表     

TREATMENT OF FULMINANT LIVER FAILURE WISTAR RATS WITH IMPLANTED ARTIFICIAL CELLS MICROENCAPSULATED LIVING HEPATOCYTES

ＴＲＥＡＴＭＥＮＴＯＦＦＵＬＭＩＮＡＮＴＬＩＶＥＲＦＡＩＬＵＲＥＷＩＳＴＡＲＲＡＴＳＷＩＴＨＩＭＰＬＡＮＴＥＤＡＲＴＩＦＩＣＩＡＬＣＥＬＬＳＭＩＣＲＯＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤＬＩＶＩＮＧＨＥＰＡＴＯＣＹＴＥＳＳｏｎｇＪｉｃｈａｎｇ，ＬｉＴａｏ，ＸｕＪ...     

PCR-RFLP-SSCP及测序用于霍乱弧菌ctx-AB基因多态性的研究

建立ＰＣＲ ＲＦＬＰ ＳＳＣＰ及测序方法 ,用于分析霍乱弧菌肠毒素ＡＢ(ｃｔｘ ＡＢ)基因多态性。针对ｃｔｘ ＡＢ基因设计引物 ,扩增片段为 5 2 8ｂｐ ,包括ｃｔｘ Ｂ编码基因375ｂｐ ,引物序列为 5′ ＧＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧ 3′和 5′ ＧＧＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣ 3′。ＰＣＲ产物经ＲｓａⅠ酶切为317ｂｐ和 2 11ｂｐ 2个片段。对酶切产物进行单链构象多态性 (ＳＳＣＰ)分析 ,银染作者单位 :5 10 5 15广州 ,第一军医大学流行病学教研室 (芮勇宇 ,俞守义 ,王红 ) ;广东省卫生防疫站 (蔡初的 ,李建基 ,钟豪杰 )…     

新型酵母表达系统—Pichia.pastoris高效分泌型表达病毒生长因 …

目的：实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法：构建ｐＰＩＣ９Ｄ／ＶＧＦ表达载体,扩增引物分别为Ｐ１：ＴＡＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＧＴＧＧＴＡＡＣＧ,Ｐ２：ＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴ;采用Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统。结果：经酶切鉴定,证明克隆的基因是正确的;经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,证明转化基因组中确实整合有ＶＧＦ基因,其分子量为９．６ｋＤ;得到了高效分泌型ＶＧＦ     

VIRTUAL IMPLANTATION IN COMPUTER ASSISTED KNEE SURGERY

ＶＩＲＴＵＡＬＩＭＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮＩＮＣＯＭＰＵＴＥＲＡＳＳＩＳＴＥＤＫＮＥＥＳＵＲＧＥＲＹＶＩＲＴＵＡＬＩＭＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮＩＮＣＯＭＰＵＴＥＲＡＳＳＩＳＴＥＤＫＮＥＥＳＵＲＧＥＲＹＴ．ＷＡＮＧ，Ｇ．ＺＯＮＧ（ＲｏｂｏｔｉｃｓＲｅｓｅａｒｃ...     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的制备

ＣＦＰ10和ＥＳＡＴ6都是结核分枝杆菌(Ｍ .ｔｂ)特有的、有良好抗原性的分泌性蛋白 ,将其编码基因 1ｈｐ和ｅｓａｔ6用ＧｅｎｅＳＯＥｉｎｇ法通过Ｌｉｎｋｅｒ (Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3构建成融合基因 ,并克隆入ｐＱＥ30质粒 ,表达、纯化、鉴定ｒＣＦＰ10 ＥＳＡＴ6 ,为其应用于Ｍ .ｔｂ感染的诊断和预防奠定基础。1 1ｈｐ ｅｓａｔ6基因的构建 :以已构建的ｐＱＥ30 ＣＦＰ10质粒为模板 ,用引物(Ｐ1) 5′ ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ 3′和 (Ｐ2 ) 5′ ＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣ…     

多重半套式聚合酶链反应检测脑脊液中细菌16S rRNA基因

根据细菌 16Ｓ核糖体ＲＮＡ(ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ ,ｒＲＮＡ)基因兼有保守性和变异性 ,以及对于本应无菌的体液标本 (如血液、脑脊液 ) ,只要确定有细菌存在即可断定为感染之特点 ,建立了多重半套式聚合酶链扩增 (ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｓｅｍｉ ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ)的方法 ,对脑脊液标本中细菌的感染进行检测。在ＧＥＮＥＢＡＮＫ中查得常见细菌 16ＳｒＲＮＡ基因序列 ,用ＤＮＡｓｔａｒ软件进行分析 ,在保守区Ｕ3 和Ｕ8各寻找一段序列作为细菌的通用引物 (上游引物Ｐｕ3:5′ＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡ3′ ,下游…     

丙型肝炎血症水平与慢性丙型肝炎患者的关系

为了研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）血症水平与慢性丙型肝炎患者临床特征的关系,我们对２４例慢性丙肝患者血清ＨＣＶＲＮＡ水平进行了定量检测。２４例慢性丙型肝炎患者,男１６例,女８例,平均年龄４０－５±５－８岁,诊断符合１９９５年５月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议讨论修订的病毒性肝炎防治方案。血清标本来自患者应用抗病毒药物前的空腹静脉血。逆转录引物选自ＨＣＶＲＮＡ的５′非编码区,为５′ＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡ３′,非对称ＰＣＲ扩增引物来自延长逆转录引物的ｃＤＮＡ产物内的非对称扩增…     

一种N端缺失的rhGM-CSF(7～127)在大肠杆菌中的表达与调控

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端均缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明三种载体表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的水平分别为２１％，１８．８％和２５％。经过用ＰＣｇｅｎｅ软件和Ｚｕｌｃｅｒ算法分析ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）－３′ＵＴＲｍＲＮＡ的二级结构，表明３′ＵＴＲ在终止密码ＴＧＡ附近形成两个茎－环结构，它可能与ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ载体高表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）有关。表达产物ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）经弱阴离子ＤＥＡＥ交换层析纯化后，纯度达到９２％，比活性为８×１０７Ｕ／ｍｇ。     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定

非结构蛋白ＮＳ5Ａ是丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)编码的一种蛋白分子。我们利用重组的ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ5Ａ为包被抗原 ,从噬菌体抗体库中筛选出了结合活性较强的ＨＣＶＮＳ5Ａ人源单链噬菌体抗体 ,并对其进行了ＤＮＡ序列测定。本研究所用的ＨＣＶＮＳ5Ａ抗原为大肠杆菌表达的重组纯化抗原蛋白 ,以聚丙烯酰胺凝胶电泳 (ＰＡＧＥ)证实纯度在95 %以上。人噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3 连接的半合成抗体文库。Ｍ13Ｋ0 7购于Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ,ＤＮＡ质粒提取纯化试剂盒购于Ｗｉｚａｒｄ公司。其…     

吸毒人群中HGV和HBV的同步检测

ＨＢＶ、ＨＣＶ和ＨＧＶ有共同的感染途径,ＨＢＶ为ＤＮＡ病毒,ＨＧＶ为ＲＮＡ病毒。我们建立了ＨＧＶＨＢＶＰＣＲ同步检测法,并用该方法和ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＨＧＶＲＮＡ、ＨＢＶＤＮＡ、ＨＢｓＡｇ和抗ＨＣＶＩｇＧ以及谷丙转氨酶(ＡＬＴ)水平,调查武汉市第一戒毒所106名吸毒者ＨＧＶ与ＨＢＶ、ＨＣＶ感染情况。通过改变ＲＮＡ提取液的ｐＨ值,可同时提取ＨＧＶＲＮＡ和ＨＢＶＤＮＡ,基金项目:湖北省教委资助项目作者单位:湖北医科大学病毒研究所(郑义,伍欣星,赵,赵文先);湖北省嘉鱼县血防站(高胜君)通信作者:郑义,430022武汉市第…     

HLA基因分型三种操作系统的效果比较

在器官和造血干细胞移植中准确的ＨＬＡ配型是影响ＧＶＨＤ、ＧＶＬ、存活率及存活时间的重要因素 ,2 0 0 0年美国联邦政府立法 ,器官移植前必须进行ＨＬＡ配型。ＰＣＲ 序列特异性寡核苷酸 (ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅ ｃｉｆｉｃｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ,ＰＣＲ ＳＳＯ)探针方法是 1994年报道的ＨＬＡ分子生物学分型方法〔1〕,本文报道在半量扩增体积基础上ｒｅｖｅｒｓｅ ＳＳＯ技术。材料和方法标本收集 :1999～ 2 0 0 1年广东地区肾脏及骨髓移植 4 75例和脐血 160例 ,ＡＣＤ Ｂ抗凝血。模板ＤＮＡ提取 :提取ＤＮＡ使用ＱＩＡａｍ…     

bcl-2在鸡马立克氏病肿瘤中的表达

目的 :从ｍＲＮＡ水平测定ｂｃｌ- 2在鸡马立克氏病ＭＤ肿瘤中的表达 ,阐明ｂｃｌ- 2与ＭＤ淋巴瘤形成的关系。方法 :用来克亨ＳＰＦ鸡复制ＭＤ肿瘤模型 ,取肿瘤和相应正常组织 ,液氮保存 ,用ＡＧＰＣ(ＡｃｉｄＧｕａｎｉｄｉｎｉｕｎＴｈｉｏｃｙａｎａｔｅ -Ｐｈｅｎｏｌ-Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ,一步法 )法提取组织总ＲＮＡ(ＴＲＮＡ) ,紫外测定其浓度 ,甲醛变性胶电泳观测其纯度。一个含鸡ｂｃｌ- 2 1 .2ｋｂ片段的质粒 (ｐＴＴＣＢ1 ) ,经转化扩增 ,提取质粒ＤＮＡ ,并用限制性内切酶 (ＲＥ)消化 ,回收纯化ｂｃｌ- 2片段 ,放射性 [α - …     

大鼠β-防御素rBD-1基因在皮肤和肾脏固有表达

设计大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ序列一对特异引物：Ｒ１５′→３′ＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＣＧ;Ｒ２５′→３′ＣＣＣＴＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＣＣ。根据大鼠β－ａｃｔｉｎｃＤＮＡ序列设计一对阳性对照特异引物：Ｂ１５′→３′ＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧ;Ｂ２５′→３′ＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧ。引物由Ｇｉｂｃｏ公司合成。从Ｗｉｓｔａｒ大鼠皮肤、肾脏、气管、子宫颈、膀胱、小肠、脾脏、骨骼肌、骨髓及腮腺组织中提取总ＲＮＡ,行ＲＴ－ＰＣＲ扩增…