Hoechst 33342标记恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化

 [目的]探讨皮肤干细胞诱导分化为结膜上皮细胞,为组织工程结膜探索一种新型的种子细胞,为严重眼表疾病的治疗奠定基础。[方法]在体外培养纯化鉴定恒河猴皮肤干细胞,并用Hoechst 33342标记,标记后的皮肤干细胞与结膜上皮细胞进行Transwell非接触共培养10d,然后对诱导后的细胞用细胞免疫化学以及流式细胞术检测结膜上皮细胞的特异性表面标志,包括角蛋白4和粘蛋白4,同时检测细胞的Hoechst 33342表达情况。[结果]纯化后的皮肤干细胞比例接近90%。Hoechst 33342标记后的皮肤干细胞胞核显示蓝色荧光。在与结膜上皮细胞共培养10d后,皮肤干细胞显示结膜上皮细胞的标志粘蛋白4和角蛋白4阳性,流式细胞术检测阳性细胞比例分别为49.9%和95.6%,同时细胞还显示胞核的Hoechst 33342表达。[结论]灵长类动物恒河猴的皮肤干细胞,在体外的适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

体外诱导恒河猴皮肤干细胞分化为结膜上皮细胞的实验研究

目的诱导体外培养、纯化的恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化,探索皮肤干细胞的可塑性。方法体外培养恒河猴皮肤干细胞,用Ⅳ型胶原纯化,纯化前后用流式细胞仪检测β1整合素和角蛋白15阳性细胞比例,纯化后的皮肤干细胞用细胞免疫荧光和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术鉴定β1整合素和角蛋白15。皮肤干细胞转染绿色荧光蛋白基因,24h后挑选出有荧光的细胞,与人结膜上皮细胞共培养10d,再进行结膜上皮细胞的特异性抗原黏蛋白4和角蛋白4的鉴定,检测方法包括细胞免疫荧光和RT—PCR。结果体外培养的皮肤干细胞纯化后比例接近90％。细胞免疫荧光和RT—PCR检测β1整合素和角蛋白15阳性。转染绿色荧光蛋白基因24h后,细胞呈现绿色荧光,与结膜上皮细胞共培养10d后,细胞免疫荧光和RT—PCR检查黏蛋白4和角蛋白4阳性。结论在体外培养纯化的灵长类动物恒河猴皮肤干细胞,在适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

体外培养鉴定恒河猴结膜上皮细胞的研究

[目的]通过在体外培养鉴定恒河猴结膜上皮细胞,探讨结膜上皮细胞的正常的生长环境,为深入研究眼表疾病的发病机理奠定基础.[方法]取健康恒河猴结膜上皮在体外进行分离培养,通过组织块培养法进行原代培养,传代培养后进行鉴定.分别采用倒置显微镜观察,细胞免疫化学,以及RT-PCR技术进行鉴定.[结果]恒河猴结膜上皮细胞在24 h内从组织块爬出,上皮细胞成层状向周边铺展,平均7 d左右细胞可以融合成单层.原代培养生长的细胞以结膜上皮细胞为主,混杂有少许的成纤维细胞.传至第3代细胞,基本纯化为上皮细胞,无成纤维细胞混杂.原代和第1、2、3代的结膜上皮细胞,皆呈现细胞胞浆粘蛋白4和角蛋白4阳性.但是,原代的部分细胞呈现MUC5AC和角蛋白7染色阳性,第1代少数细胞染色阳性,而第3代细胞基本上未见阳性细胞.原代培养的细胞进行RT-PCR检测,显示421 bp和632 bP明亮的特异性条带.[结论]对恒河猴结膜上皮体外取材培养,可以获取纯度较高的结膜上皮细胞,其生理特征与体内相同,可以在体外模拟类似的眼表环境.     

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

[目的]探索体外定向诱导胚胎干细胞(ES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将小鼠胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜共培养4～5 d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化.[结果]与人羊膜共培养4～5 d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞;流式细胞仪检测结果显示实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为81.4%和8.4%,两者比较差异显著,Z检验P<0.01.[结论]人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞.     

人皮肤干细胞体外诱导分化构建人工结膜的实验

 【目的】观察皮肤干细胞在结膜去细胞基质上的生长和分化情况，探讨利用皮肤干细胞及结膜去细胞基质构建人工结膜的可能性。【方法】将体外分离培养的1～2代人皮肤干细胞接种于人结膜去细胞基质上，在体外观察细胞的分化情况。标本分别行HE染色、人上皮细胞角蛋白CKl9单克隆抗体、结膜上皮细胞特异性标记蛋白CK8抗体、CK13抗体、MUC5A／C抗体免疫组化鉴定。【结果】皮肤干细胞在结膜去细胞基质等模拟的体外微环境下可形成类似结膜上皮细胞的复层增生，并有类结膜上皮细胞特异性标记蛋白表达，呈CK8抗体、CK13抗体、MUC5A／C抗体表达阳性。【结论】利用皮肤干细胞可在体外模拟的微环境下分化构建人工结膜，用于结膜移植眼表重建。     

人皮肤干细胞体外诱导分化构建人工结膜的实验

【目的】观察皮肤干细胞在结膜去细胞基质上的生长和分化情况，探讨利用皮肤干细胞及结膜去细胞基质构建人工结膜的可能性。【方法】将体外分离培养的1～2代人皮肤干细胞接种于人结膜去细胞基质上，在体外观察细胞的分化情况。标本分别行HE染色、人上皮细胞角蛋白CKl9单克隆抗体、结膜上皮细胞特异性标记蛋白CK8抗体、CK13抗体、MUC5A／C抗体免疫组化鉴定。【结果】皮肤干细胞在结膜去细胞基质等模拟的体外微环境下可形成类似结膜上皮细胞的复层增生，并有类结膜上皮细胞特异性标记蛋白表达，呈CK8抗体、CK13抗体、MUC5A／C抗体表达阳性。【结论】利用皮肤干细胞可在体外模拟的微环境下分化构建人工结膜，用于结膜移植眼表重建。     

表皮干细胞分化结膜上皮细胞基因检测的实验研究。

目的通过实时RT～PCR方法检测经定向诱导分化的表皮干细胞分子生物学特性,探讨干细胞疗法用于眼表重建的可行性。方法实验组细胞以结膜上皮细胞为饲养细胞进行共培养,并设立空白对照组细胞培养相同时间,分别于第1、3、5、7天取各组细胞提取RNA进行实时RT—PCR定量检测β2-微球蛋白、角蛋白K13基因的表达水平。结果实验组细胞共同培养3d后出现β2-微球蛋白、角蛋白K13基因的表达,第5、7天的表达量显著提高（P〈0．01）。结论经本实验方法定向诱导分化后表皮干细胞可表达与正常结膜上皮细胞相类似的分子生物学特征。     

兔脂肪间充质干细胞诱导成膀胱移行上皮细胞的研究

目的 探讨体外诱导兔脂肪间充质干细胞(rabbit adipose tissue-derived stromal cells,rASCs)向膀胱移行上皮细胞分化的可行性.方法 实验分混合共培养组、条件培养液组和空白对照组.混合共培养组是将兔脂肪间充质干细胞rASCs(GFP标记)与兔膀胱移行上皮细胞按1∶1比例混合培养；条件培养液组是将兔膀胱移行上皮细胞上清液与rASCs一起培养;空白对照组是rASCs与普通培养基常规培养.2周后,用免疫荧光法检测诱导分化的脂肪间充质干细胞中膀胱移行上皮细胞特异性蛋白尿斑素Ib、尿斑素Ⅱ、尿斑素Ⅲ和上皮细胞角蛋白CK18的表达.结果 2周后,免疫荧光检测显示,在混合共培养组中,诱导分化的脂肪间充质干细胞表达膀胱移行上皮细胞特异性蛋白尿斑素Ib和上皮细胞角蛋白18、尿斑素Ⅱ、尿斑素Ⅲ没有检测到.而在条件培养液组和空白对照组,上述膀胱移行上皮细胞特异性标记都没有检测到.结论 rASCs与兔膀胱移行上皮细胞混合培养可以诱导rASCs向膀胱移行上皮细胞分化.     

ES细胞源性表皮干细胞分化潜能的研究

目的探讨人羊膜诱导的ES细胞源性表皮干细胞在肾被囊内的分化,研究其在不同微环境中的分化潜能和稳定性,为组织工程皮肤寻找新的种子细胞奠定基础。方法Hoechst33342标记129小鼠E14胚胎干细胞,与人羊膜共培养4d,定向诱导其分化为的表皮干细胞克隆,诱导后的细胞移植入129小鼠肾被囊内,术后4,6和8周取材。对移植后细胞的分化进行形态学和免疫荧光双标CK19及CK18检测。结果ES细胞源性表皮干细胞在小鼠肾被囊内4周,分化为由单层或复层上皮样细胞构成的管状和泡状结构,种植6周和8周,除上述结构外,可见角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样等结构。管泡状结构免疫荧光双标染色呈CK19及CK18阳性。结论ES细胞源性表皮干细胞在肾被囊内,仍具有分化为角化复层上皮、汗腺样、皮脂腺样及毛囊样结构的潜能。     

人脐血间充质干细胞鉴定及用5-氮胞苷诱导后的生物学特性研究

目的探讨脐血间充质干细胞经体外扩增纯化表面CD标志的鉴定及在体外定向分化成心肌样细胞的诱导剂5一氮胞苷（5-aza）作用后的生物学特性。方珐健康妊娠产妇分娩的胎儿脐带血,分离单个核细胞进行培养、传代,取第3代以后细胞用流式细胞仪直接标记分析CD34、CD44、CD90细胞表面标志。10μmmol／L5-aza诱导4周后,进行透视电镜观察,并检测细胞肌球蛋白重链基因的表达。结果体外纯化扩增后的脐血间充质干细胞含有与骨髓来源的间充质干细胞相同的细胞表面标志,第3代以后细胞纯度较高,经5-aza体外诱导培养可形成心肌样细胞。结论脐血间充质干细胞经体外纯化扩增,第3代以后的细胞纯度较高,在体外经5-aza诱导定向分化为心肌样细胞后,其基本的生物学特性未发生改变。     

人脂肪间充质干细胞与软骨细胞接触式共培养的实验研究

目的探讨接触式细胞共培养条件下,人软骨细胞对脂肪间充质干细胞的诱导分化效应。方法用4,6-联脒-2-苯基吲哚(PKH26)荧光标记脂肪间充质干细胞,与软骨细胞进行接触式细胞共培养,细胞比例为1:1,单独培养的脂肪间充质干细胞为对照组。共培养2周后,应用流式细胞仪分选荧光标记阳性的脂肪间充质干细胞,提取细胞总RNA,采用Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的相对表达改变。结果成功分离提取脂肪间充质干细胞;Real-timePCR检测结果显示,共培养组脂肪间充质干细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因相对表达较对照组显著增加(P0.05),蛋白多糖上调307倍,Ⅱ型胶原上调584倍。结论与软骨细胞接触式共培养后,人脂肪间充质干细胞能够被诱导分化为软骨细胞。     

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

目的 探索体外定向诱导胚胎干细胞（ES细胞）分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法 将小鼠胚胎干细胞单独（对照组）或与人羊膜共培养4－5d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。结果 与人羊膜共培养4－5d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞,流式细胞仪检测结果显示：实验组和对照组β1整合素细胞分别为81．4％和8．4％,两者比较差异显著,Z检验P＜0．01。结论 人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞。     

利用皮肤干细胞的横向分化重建角膜上皮的初步研究

目的 观察皮肤干细胞在角膜基质上的分化发育情况,探讨皮肤干细胞重建角膜上皮的可能性。方法 将体外分离培养的1～4代人和兔皮肤干细胞种植在兔角膜基质上,在体外和体内观察皮肤干细胞的分化发育情况。实验标本作HE染色及用人上皮细胞角蛋白K19单克隆抗体和角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12抗体AE5进行免疫组织化学鉴定。结果 皮肤干细胞在角膜基质的调控下可以横向分化发育成表达角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12的细胞,呈现AE5抗体阳性;并可形成类似角膜上皮外观透明的多层细胞结构。结论 利用皮肤干细胞有可能重建角膜上皮,进行自体生物角膜的构建。     

侧群细胞及其在肿瘤干细胞研究中的进展

肿瘤干细胞研究已成为国内外研究热点.肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在一小部分具有自我更新及多向分化潜能的细胞,在肿瘤耐药和复发中起着关键的作用,这一部分细胞被称为肿瘤干细胞.目前肿瘤干细胞的分离、富集方法主要有:侧群细胞分选技术、细胞表面特异性分子标记筛选技术、肿瘤微球培养技术、细胞滞留标记技术、ALDEFLUOR分析技术等.侧群细胞是一小群能够将核酸染料Hoechst 33342排出,经过流式细胞检测呈Hoechst 33342低染的细胞.侧群细胞中富含肿瘤干细胞,其分选技术已作为简单有效的富集肿瘤干细胞的方法应用在肿瘤干细胞研究中.     

体外定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的研究

[目的]探索体外定向诱导人胚胎干细胞(hES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其定向分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。[方法]将人胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜上皮面向上全铺或半铺布半孔底共培养4~5 d,观察其形态变化并分别用β1整合素,CK15及CK19免疫组化检测人胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。[结果]人胚胎干细胞与人羊膜共培养4～5 d后,在人羊膜上皮面形成表皮样干细胞集落,表达高水平的表皮干细胞特异标记物β1整合素、CK15和CK19。在无羊膜覆盖处,细胞贴壁生长,形成单层表皮样细胞,细胞呈多边形,排列紧密,大部分细胞表达β1整合素。对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞。[结论]在体外人羊膜可定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞,并提示在羊膜上皮面的细胞克隆可能是表皮样干细胞,而贴壁生长的细胞可能大部分是表皮样瞬间放大细胞。     

体外培养大鼠骨髓间质干细胞的超微结构

[目的]研究体外培养大鼠骨髓间质干细胞的超微结构。[方法]采用常规技术对SD鼠骨髓间质干细胞进行体外培养传代、鉴定、诱导分化和透射电镜分析。[结果]流式细胞仪检测,细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;经5-氮杂胞苷和两性霉素B诱导分化后结蛋白和肌球蛋白染色阳性。透射电镜观察有巨噬样、内皮样和成纤维样三类基本细胞,巨噬样细胞表面有胞质突起,胞浆含电子密度高的结晶样包涵体;内皮样细胞靠胞膜边有吞饮小泡,胞浆中有电子密度高的内皮特殊小体;成纤维样细胞呈梭形,较幼稚,细胞器简单,有丰富的糖原和核糖体;经诱导分化的肌样细胞胞浆靠胞膜缘可见无细胞器的条状肌丝区带;细胞间存在胞膜局部紧密连接和胞质突起接合。[结论]传代贴壁生长的为骨髓间质干细胞;超微结构分析显示早期幼稚细胞发育的特征,但各有特点;在不同培养条件诱导下,细胞具备向肌肉和脂肪组织分化的潜能。本研究为进一步了解和掌握骨髓间质干细胞的生物学特性和临床应用打下基础。     

人孕中期胎儿结膜上皮干细胞定位特征的免疫组化研究

目的研究孕中期不同胎龄胎儿结膜上皮细胞中,角蛋白7、14、19p63和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及分布情况,探讨人胎儿结膜上皮干细胞的定位特征。方法取正常引产6h内的孕中期不同胎龄胎儿眼球前部组织,采用HE、免疫组化染色法,观察角蛋白p63和PCNA的表达及分布情况。结果PCNA及p63表达情况一致,主要表达在睑缘皮肤黏膜交界处及角膜缘上皮深层细胞。角蛋白19主要表达在穹窿部及球结膜上皮细胞。角蛋白14表达在睑缘皮肤黏膜交界处及睑结膜上皮细胞。角蛋白7表达在穹隆部至角膜缘上皮细胞。结论细胞角蛋白7、14、19和p63及PCNA在人孕中期不同胎龄的胎儿结膜上皮细胞的特征性表达表明,人孕中期胎儿结膜上皮细胞普遍具有增殖的活性,干细胞位于睑缘皮肤黏膜交界处和角膜缘上皮细胞的深层。     

大鼠骨髓间质干细胞脑内移植后分化行为的观察

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)植入大鼠脑内后,在脑微环境作用下的分化行为.方法:梯度离心法分离、培养、纯化MSC,Hoechst33342标记后植入大鼠海马CA4区;1,2,4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;观察Hoechst33342阳性细胞,免疫荧光法CY3显示神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、神经巢蛋白(nestin)、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)阳性表达细胞.结果:MSC植入后可见大量细胞存活,沿针道、注射区向周围散在分布,植入细胞有呈红色荧光的NSE,nestin,GFAP及NGF阳性表达细胞.结论:MSC植入动物脑内后能够存活,并分化为神经系统样细胞,表达功能产物NSE、nestin、GFAP及NGF.     

诱导向尿路上皮分化的脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质支架的生物相容性研究

目的 探讨脂肪干细胞向尿路上皮细胞分化的可行性,并将诱导后细胞与膀胱脱细胞基质复合培养,评价细胞与支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化组织提供实验基础。 方法 取6只8周龄雄性新西兰大白兔的腹股沟脂肪组织和膀胱组织,通过胶原酶消化法分离脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),同时通过胰蛋白酶消化的方法获取尿路上皮细胞,流式细胞鉴定后将第3代脂肪干细胞与尿路上皮细胞间接共培养2周,并对分化后细胞进行表型鉴定。随后将分化后细胞种植在膀胱脱细胞基质上,通过扫描电镜、组织学切片观察诱导后细胞在膀胱脱细胞基质上的生长情况。 结果 脂肪干细胞培养成功并在体外扩增,流式术检测表面抗原CD分子,细胞高表达CD29(99.6%)、CD44(98.2%);低表达CD31(1.9%)及CD45(1.6%)。通过间接共培养诱导分化后,细胞免疫荧光、Western blotting检测到尿路上皮标志物UPIa的表达,而未诱导的脂肪干细胞无表达。扫描电镜提示诱导后细胞在膀胱脱细胞基质上生长,黏附较好。组织学检查可见膀胱脱细胞基质表面细胞平铺生长。 结论 脂肪干细胞向尿路上皮诱导分化后可作为泌尿系组织工程的种子细胞,可能是尿路上皮细胞之外的又一新选择。膀胱脱细胞基质能支持诱导后的脂肪干细胞良好的生长,该支架可作为载体材料用于泌尿系组织工程的修复与重建。      

肾组织干细胞向肾小管上皮细胞的诱导分化

目的探讨肾组织干细胞向肾小管上皮细胞的诱导分化。方法分离肾乳头肾组织干细胞,对照组加入正常干细胞培养
基,诱导组应用含activin A、BMP-7、维甲酸3种细胞因子的诱导培养基与肾上皮细胞培养基交替诱导,同时与缺氧损伤的肾小
管上皮细胞共培养,通过细胞流式、免疫荧光、qRT-PCR的方法评估诱导效率。结果细胞流式结果提示,对照组肾组织干细胞
CK-18阳性率为6.5%,诱导组CK-18阳性率为44.2%;免疫荧光结果提示,诱导组成熟上皮细胞标记CK-18、E-cadherin、ZO-1部
分阳性表达;qRT-PCR结果提示,诱导组成熟上皮细胞标记E-cadherin、AQP-1基因表达水平较对照组显著升高（P<0.01）。结
论肾组织干细胞在体外可以诱导分化为肾小管上皮细胞。