重组β-半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 :构建表达 β -半乳糖苷酶 (β -gal)的重组腺病毒 ,以期为再狭窄的基因治疗研究提供一个对照载体和为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、转染效率的研究提供一有用的工具。方法 :采用基因重组方法构建穿梭质粒pAd - β -gal,通过同源重组法制备出重组腺病毒Ad - β -gal,转染的 2 93细胞用X -gal染色鉴定Ad - β-gal的正确与否。通过测定 2 6 0nm的紫外光吸收值估计病毒高度。原代大鼠血管平滑肌细胞采用组织块培养法。Ad - β -gal以 10 0moi感染VSMCs并行X -gal染色 ,以观察 β -gal在VSMCs中的表达情况。 结果 :成功构建了pAd - β -gal穿梭质粒和Ad - β -gal重组腺病毒 ,转染的 2 93细胞和VSMCs经X -gal染为蓝色 ,病毒浓度为 9× 10 11pfu/ml,以 10 0moiAd - β-gal转染VSMCs,其转染效率接近 10 0 %。结论 :表达 β -gal的重组腺病毒构建成功 ,并在VSMCs中得到有效表达 ,本研究为将来再狭窄基因治疗研究提供了一对照载体 ,也为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、有效性的研究提供了一有用的工具。     

小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.     

腺病毒携带的LacZ基因静脉注射后在大鼠体内的表达

目的 :探讨周围静脉注射的腺病毒载体介导的外源基因在体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X -gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β- gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞三种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 1 0 1 1 pfu/kg剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β -半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。 结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径 ,而对心脑血管疾病不适合。     

miR-1在心肌细胞生长中的调节作用

[摘要] 目的 构建并鉴定microRNA-1(miR-1) 的腺病毒表达载体,并探讨其在心肌肥厚中的介导作用。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片段,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAd-precusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率,并分析心肌细胞表面积及肥厚标志物ANP(Nppa)、β-MHC(myh7)的基因表达变化。结果 基因测序及酶切鉴定证实重组Ad-precursor-miR-1腺病毒载体构建成功,腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平,减小心肌细胞表面积及Nppa、myh7的表达。结论 利用同源重组方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达,抑制心肌细胞生长。     

miR-1腺病毒载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定microRNA-1(miR-1)的腺病毒表达载体。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAdprecusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率。结果基因测序及酶切鉴定证实重组Adprecursor-miR-1腺病毒载体构建成功;腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平。结论利用同源重组的方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达水平。     

野生型p53基因转移对心肌细胞生长的抑制作用

为了探讨野生型ｐ５３基因对心肌细胞生长的抑制作用及应用于高血压和肥厚型心肌病等疾病所致心肌肥厚的基因治疗可能性,本实验将野生型ｐ５３基因重组腺病毒转染体外培养的乳兔心肌细胞。应用生化染色方法,免疫组化法及聚合酶链反应技术,检测了野生型ｐ５３基因的转染效率及表达效果。采用ＭＴＴ方法及光镜技术进一步观察了野生型ｐ５３基因对心肌细胞生长的调节作用。结果显示,腺病毒载体能有效地将外源基因导入心肌细胞中并使     

心肌特异性表达腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建心肌特异性表达的腺病毒载体,使外源基因在心肌细胞中特异性表达。方法：将心肌特异性肌凝蛋白轻链蛋白－２（ｍｌｃ－２ｖ）启动子克隆至腺病毒穿梭质粒,并将绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因克隆至此质粒中,同源重组含ＧＦＰ基因的缺陷型腺病毒（ＡｄｍｌｃＧＦＰ）,转染心肌细胞及非心肌细胞。结果：经ＲＴ－ＰＣＲ分析,转染的心肌细胞有ＧＦＰｍＲＮＡ的表达,而转染的非心肌细胞无ＧＦＰｍＲＮＡ的表达;荧光显微镜下观察,可见转染的心肌细胞表达ＧＦＰ,而转染的非心肌细胞不表达ＧＦＰ。结论：构建的心肌特异性表达腺病毒载体可使源基因在心肌细胞内特异性表达。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外靶向性转染心肌细胞

目的:构建以鼠心肌轻链蛋白基因(mlc-2v)为启动子、携带人血管内皮生长因子hVEGF165基因的重组腺病毒载体,检测该重组腺病毒载体对心肌细胞转染的靶向性.方法:酶切腺病毒载体PDC315自身启动子CMV,构建腺病毒载体PDC317,分别接入hVEGF165、mlc-2v基因,构建腺病毒载体PDC-mlc-hVEGF165.鉴定正确后,将PDC-mlc-hVEGF165与Lipofectamine共转染至293细胞,经同源重组获得以mlc-2v为启动子、携带hVEGF165基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165,同步构建无靶向性的重组腺病毒Ad-hVEGF165.扩增并测定滴度后,Ad-hVEGF165、Ad-mlc-hVEGF165分别转染体外培养的心肌细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测Ad-mlc-hVEGF165转染心肌细胞的靶向性.结果:构建的病毒正确,病毒滴度为2.8×109 pfu/ml.转染3 d后,Ad-hVEGF165组在各培养细胞的上清液及细胞内均检测到VEGF的表达,而Ad-mlc-hVEGF165组仅在心肌细胞中有VEGF的表达,且Ad-mlc-hVEGF165组心肌细胞分泌的VEGF要少于Ad-hVEGF165组.结论:成功构建了以mlc-2v为启动子、携带人VEGF基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165;该重组载体能体外靶向性转染心肌细胞并使之表达VEGF.     

重组β—半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管闰滑肌细胞中的表达

目的构建表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的重组腺病毒,以期为再狭窄的基因治疗研究提供一个对照载 体和为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、转染效率的研究提供一有用的工具。方法采用基因重组方法构 建穿梭质粒pAd-β-gal,通过同源重组法制备出重组腺病毒Ad-β-gal,转染的293细胞用X-gal染色鉴定Ad-β -gal的正确与否。通过测定260nm的紫外光吸收值估计病毒高度。原代大鼠血管平滑肌细胞采用组织块培养 法。Ad-β-gal以100moi感染VSMCs并行X-gal染色,以观察β-gal在VSMCs中的表达情况。结果成功构建了 pAd-β-gal穿梭质粒和Ad-β-gal重组腺病毒,转染的293细胞和VSMCs经X-gal染为蓝色,病毒浓度为9×l011 pfu/ml,以100moiAd-β-gal转染VSMCs,其转染效率接近l00%。结论表达β-gal的重组腺病毒构建成功,并在 VSMCs中得到有效表达,本研究为将来再狭窄基因治疗研究提供了一对照载体,也为腺病毒介导的基因转移的安 全性、可行性、有效性的研究提供了一有用的工具。     

血管形成素1基因对兔缺血心肌中血管的新生作用

目的 探讨血管形成素1基因重组腺病毒载体构建及其促进心肌缺血区血管生长的作用。方法以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人脾组织获取血管形成素1(Ang-1)全长cDNA,经SalI酶切并克隆到E1、E3缺失的Ad5腺病毒载体(PAxCAwt)中。应用Cosmid-TPC磷酸钙共沉淀法共转染293细胞,制备了纯化的Ang-1重组腺病毒颗粒。将获得的Ang-1重组腺病毒直接注射转染36只新西兰白兔的冠状动脉结扎后缺血的心肌内,应用RT-PCR方法测定其在转染心肌中的表达,并用免疫组织化学及冠状动脉造影方法观察缺血心肌内血管生长及侧支循环形成的情况。结果实验所克隆的Ang-1cDNA片段为含有信号肽结构的长度为1515bp的全长cDNA,与文献报道一致。Ang-1重组腺病毒直接注射转染兔缺血心肌后能有效表达,28d后新生毛细血管密度及侧支循环形成明显高于对照组。结论腺病毒介导的血管形成素-1基因能有效地促进兔心肌缺血区血管新生及侧支循环形成。     

阻断转化生长因子-β信号转导抑制伤口瘢痕的实验研究

目的　探讨用基因治疗手段阻断伤口内细胞转化生长因子 β(TGF β)的信号转导来抑制瘢痕形成的可行性。方法　用含TGF β截短型受体 (tTGF βRII)基因的重组腺病毒 (10 0空斑形成单位 /细胞 ,pfu/细胞 )感染正常人皮肤成纤维细胞 ,Northern印迹观察tTGF βRII表达对TGF β1基因表达的调控。将 β 半乳糖苷酶 (β gal)重组腺病毒 (1× 10 9pfu)和tTGF βRII重组腺病毒 (1× 10 9pfu)分别注入新生 10天的Sprague Dawley (SD)大鼠背部皮肤的左右侧 ,并在注射部位作线型切口 ,通过组织学检测和免疫组化观察tTGF βRII表达对抑制伤口瘢痕的作用和减少伤口炎症反应及TGF β1合成的作用。在tTGF βRII转基因小鼠和对照小鼠作同样线性切口来进一步证实tTGF βRII对抑制瘢痕的作用。结果　tTGF βRII在细胞内的过度表达显著抑制TGF β1的基因表达。腺病毒介导的皮肤基因转染在注射后 2～ 3天基因表达达高峰 ,5～ 7天逐渐下降。术后 2周 ,组织学检测发现tTGF βRII转基因小鼠伤口内相对瘢痕面积和对照小鼠伤口内相对瘢痕面积分别为 136 96 9 8± 6 6 339和 4 74 6 4 1 6±2 2 7396 ,转基因鼠瘢痕面积约为对照鼠的 2 9% (P <0 0 5 )。术后 2周 ,大鼠tTGF βRII基因治疗后伤口的相对瘢痕面积和对照伤口相对瘢痕面积     

腺病毒介导vasostatin-1基因转染表达对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:构建并鉴定携带人嗜铬粒蛋白A的N端1~76片段(CGA1-76) 即vasostatin-1（VS-1）基因的腺病毒表达载体,观察重组腺病毒在大鼠心肌细胞中的表达,探讨VS-1转基因治疗对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:（1）利用CGA1-58cDNA模板,设计引物,利用PCR合成、扩增CGA1-76的cDNA并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack,经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183中同源重组。将鉴定正确的同源重组质粒pAd-VS-1线性化后转染QBI-293A细胞进行包装、扩增得到重组腺病毒颗粒Ad-VS-1,将该病毒感染大鼠心肌细胞H9c2并通过蛋白质印迹法检测其表达。（2）建立心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤模型,分为4组:空白组、H/R组、空载腺病毒转染+H/R组、Ad-VS-1转染+H/R组;测定各组心肌细胞活力,超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。结果:（1）经PCR、基因测序、酶切鉴定证实重组质粒pAd-VS-1构建成功,将其导入QBI-293A细胞,通过蛋白质印迹法证实病毒颗粒Ad-VS-1感染心肌细胞后VS-1蛋白表达。（2）H/R组心肌细胞活力和SOD含量较空白组明显降低,MDA增加;而VS-1基因转染提高了心肌细胞H/R模型心肌细胞活力和SOD含量,并降低了MDA生成量。结论:成功构建Ad-VS-1,将其感染大鼠心肌细胞后能够表达VS-1并对心肌细胞H/R损伤具有保护作用,其机制和抗氧化作用有关。     

人类抗凋亡基因bcl-xL的克隆及其在大鼠心肌细胞内的高效表达

[目的]克隆人类抗凋亡基因bcl-xL cDNA,构建两种不同的真核表达载体,评价大鼠心肌细胞表达外源性bcl-xL的效果,并比较不同转染方法对bcl-xL表达的影响.[方法]]RT-PCR法从人肝脏组织获取bcl-xL cDNA,连接至pTargeTTM载体,并亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1上;细菌内同源重组构建重组腺病毒质粒,腺病毒纯化试剂盒获取高滴度的重组腺病毒;脂质体和腺病毒介导分别转染体外培养的大鼠心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和免疫细胞化学染色法检测bcl-xL mRNA和bcl-xL蛋白的表达.[结果]获取的bcl-xL cDNA测序正确,成功克隆真核表达质粒pEGFP-bcl-xL;病毒颗粒滴度高达5.3×1012 pfu/L;脂质体和腺病毒转染心肌细胞效率分别为40.3%和95.4%,转染后bcl-xL mRNA和bcl-xL蛋白的表达均增加,但两种方法之间差异有统计学意义(P＜0.01).[结论]成功获取人类bcl-xZ基因并制备真核表达质粒和重组腺病毒,心肌细胞能高效表达外源性bcl-xL,并以腺病毒介导更为理想.为bcl-xL基因治疗缺血性心脏病提供实验基础.     

腺病毒介导的eNOS基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC)的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 :构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC ,应用聚合酶链 (PCR)、逆转录PCR(RT PCR)技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率 ;应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果 :外源性eNOS基因成功导入了VSMC ;VSMC中有eNOS基因mRNA的表达 ;外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后 ,可显著抑制VSMC的生长 ,DNA合成减少。结论 :腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC ,并可有效抑制细胞生长。     

BFGF基因促猪缺血心肌血管新生的研究（摘要）

目的探讨经导管猪冠状动脉内导入碱性成纤维细胞生长因子基因（bFGF）对缺血心肌血管新生及心功能的影响．方法构建真核表达质粒pcDNA3-bFGF后以碱裂解法大量制备；开胸结扎猪左冠状动脉回旋支（LCX）主要分支建立心肌梗死模型．模型制备成功后饲养2周，随机将实验动物分为手术对照组（n=4）、bFGF左冠脉导入组（n=5）、bFGF右冠脉导入组（n=4），于LCX主要分支结扎后2周行冠将动脉选择性造影，经导管冠状动脉内给予手术对照组每只动物生理盐水0．1mL左、右冠脉治疗组每只动物冠脉内导入pcDNA3-bFGF2000μg（溶于生理盐水0．1mL中）．给药后饲养2周监测心脏超声心动图评估实验动物的LVEF情况。[第一段]     

经周围静脉途径转移的外源基因在大鼠体内的表达

目的 :探讨经周围静脉注射的外源基因在大鼠体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞 3种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 10 1 1 pfu·kg- 1 剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β 半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

经冠状动脉转染转化生长因子-β1基因对大鼠移植心脏缺血-再灌注损伤的影响

目的:探讨经冠状动脉转染重组腺病毒介导的转化生长因子-β1(TGF-β1)基因对大鼠移植心脏缺血-再灌注损伤的影响.方法:利用Cuff技术建立颈部异位心脏移植模型.转基因组供心离体灌注含5×109 pfu/gm携带mTGF-β1基因腺病毒颗粒的4℃ Stanford大学停跳液,空白对照组灌注4 ℃ Stanford大学停跳液,空载体组灌注含5×109 pfu/gm空白载体的4℃ Stanford大学停跳液.移植术后8 h切取移植心脏,电镜下观察移植物超微结构.免疫组化染色检测移植物mTGF-β1、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及核因子-κB(NF-κB)的表达.结果:移植后8 h,与其他2组相比,转基因组心肌细胞肿胀减轻,炎性细胞浸润减少,心肌线粒体水肿明显减轻,无明显的肌丝断裂现象.空白对照组与空载体组无外源性mTGF-β1蛋白的表达,转基因组有mTGF-β1的表达.3组间相比,心肌组织ICAM-1与NF-κB的表达差异有统计学意义(F=23.8,P=0.008;F=36.7,P=0.007).转基因组ICAM-1与NF-κB的表达较空白对照组与空载体组降低(P＜0.01).结论:经冠状动脉灌注重组腺病毒介导的TGF-β1基因能减轻移植心脏缺血-再灌注损伤,其机制可能与下调ICAM-1及NF-κB的表达有关.     

腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

复制缺陷的重组腺病毒经心包腔转染急性心肌梗死猪观察

目的:评价重组腺病毒经心包腔转染的效率及持续时间.方法:应用磷酸钙沉淀方法制备携带大肠杆菌LacZ基因复制缺陷的重组腺病毒(Ad-LacZ).12头中国小型猪随机等分为实验组和对照组,采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心肌梗死模型建立后即刻采用经皮剑突下穿刺中心静脉导管心包腔内注射转染,28 d后处死.实验组胶原酶1 200 u及透明质酸酶3 000 u预处理心包后,在心包腔内注射Ad-LacZ基因2.0×109噬斑集落形成单位;对照组:同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 ml.于注射后3 d、7 d及28 d分别对缺血心肌进行HE、HBFP及X-gal染色.结果:冠状动脉造影证实前降支远端完全闭塞,病理学检查显示心肌有缺血和梗死.实验组注射Ad-LacZ基因后第3 d、7 d及28 d后X-gal染色有阳性细胞,以7 d最明显,对照组28 d内均未发现阳性细胞.结论:应用球囊堵塞法可成功建立猪急性心肌梗死模型,胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,腺病毒载体可转染缺血心肌,并持续表达4周.